高效液相色譜法檢測玉米中嘔吐毒素方法優(yōu)化

摘要：在GB 5009.111—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法，通過優(yōu)化樣品的前處理過程，旨在建立一種能夠快速、準(zhǔn)確、大批量檢驗玉米中嘔吐毒素含量的測定方法。結(jié)果顯示，嘔吐毒素在100～5 000 ng/mL的濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2大于0.999 97，方法檢出限為18.4 μg/mL，定量限為61.3 μg/mL，樣品回收率在90.04%～108.42%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.69%～6.70%，符合國標(biāo)對嘔吐毒素的檢驗要求，滿足大規(guī)模玉米樣品的快速測定。

關(guān)鍵詞：玉米；嘔吐毒素；高效液相色譜；快速測定

中圖分類號：O657.7+2 文獻標(biāo)志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20240225

Optimization of high performance liquid chromatography for detection of vomitoxin in maize

Wang Yudi， Yue Tingting， Tan Hongbo， Pan Xing

（ Baicheng Grain and Oil Quality Monitoring Center， Baicheng， Jilin 137000 ）

Abstract： On the basis of GB 5009.111—2016 "Determination of deoxynivalenol and its acetylated derivatives in foodstuffs"， high-performance liquid chromatography （HPLC） was used， and by optimizing the pretreatment process of the samples， the aim was to establish an assay method that could rapidly， accurately， and in large quantities test the content of vomitoxin in corn. The results demonstrated that the linear relationship of vomitoxin was good in the concentration range of 100～5 000 ng/mL， with the linear correlation coefficient （R2） greater than 0.999 97. The limit of detection （LOD） of the method was 18.4 μg/mL， the limit of quantification （LOQ） was 61.3 μg/mL， the recoveries of vomitoxin were in the range of 90.04%～108.42%， and the relative standard deviations （RSD） were in the range of 3.69%～6.70%， which ea56c72948692ce5bf09be7fd1beae14complied with the requirements of the national standard for the determination of vomitoxin in corn. It met the requirements for the rapid determination of large-scale corn samples.

Key words： corn； vomitoxinl； high performance liquid chromatography； rapid detection

嘔吐毒素（DON），因其分子結(jié)構(gòu)為雪腐鐮刀菌烯醇的4-脫氧衍生物，又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，主要是由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生的真菌毒素[1]，一般污染玉米、小麥、燕麥等糧食作物及其制品和副產(chǎn)品，尤其是對玉米和小麥的污染最為嚴(yán)重，污染地區(qū)遍布全球[2-4]。人類和動物食用嘔吐毒素超標(biāo)的產(chǎn)品后容易引起惡心、嘔吐、胃部不適、免疫抑制、生殖異常等癥狀，嚴(yán)重時可危及生命。同時糧食中嘔吐毒素的積累不僅對人類和動物造成嚴(yán)重的健康威脅，而且在食品和畜牧業(yè)中造成經(jīng)濟損失。因此采用準(zhǔn)確、快速、高效的檢測方法對糧食中嘔吐毒素含量進行監(jiān)測和管控，對于人類健康和社會經(jīng)濟發(fā)展具有重大意義[5]。

目前嘔吐毒素的檢驗方法主要有：液相色譜法（HPLC）[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）[7]、薄層色譜法（TIC）[8]、酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）[9]、膠體金免疫法[10]、時間分辨熒光免疫層析法[11]等。高效液相色譜技術(shù)具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，相較于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法技術(shù)無法進行多組分同時檢測的弊端增加了檢驗的時間。鑒于高效液相色譜儀在基層實驗室的保有率更高，本文在GB 5009.111—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》[12]中第二法“免疫親和層析凈化高效液相色譜法”的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化前處理的過程，建立一個能夠在保證檢驗結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，縮短檢驗時間，降低檢驗成本，簡化操作流程，更加適用于日常化驗室大批量檢驗玉米樣品中嘔吐毒素含量的測定方法，以期為糧食檢驗監(jiān)測部門提供切實有效的檢驗方法與數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

嘔吐毒素免疫親和柱：北京中檢維康生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜級）：德國默克公司；超純水：用Milli-Q超純水機實驗室制得；有機微孔濾膜（0.45 μm）：天津津滕中國有限公司；聚乙二醇：上海麥克林生化科技有限公司；乙腈中嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW（E）100394（100.7 μg/mL）：國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院；玉米陰性樣品：實驗中留存；嘔吐毒素成分分析質(zhì)控樣品（400、800 μg/kg）：國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2010型高效液相色譜儀配紫外檢測器：日本島津公司；LD210-2型電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；PTQZ-6D型自動渦旋振蕩器：常州普天儀器制造有限公司；A10型Milli-Q超純水機：美國Milli-Pore公司；TGL-16G型高速臺式離心機：常州諾機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：島津C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：50%甲醇—水等度洗脫；進樣量：50 μL；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測器：紫外檢測器、波長218 nm。

1.3.2 試樣制備方法

試樣制備：樣品采用分樣器多次混勻縮分至1 kg，經(jīng)研磨機粉碎，過40目篩混勻備用。

1.3.3 樣品前處理方法優(yōu)化

稱樣量優(yōu)化：分別稱取嘔吐毒素陽性質(zhì)控樣品25 g、5 g，聚乙二醇5 g、1 g于250 mL具塞三角瓶和50 mL離心管中，分別加入超純水100 mL、20 mL混勻，置于全自動渦旋震蕩器中震蕩20 min，10 000 r/min離心5 min，留上清液備用，即為樣品提取液。取2 mL的提取液過嘔吐毒素免疫親和柱，10 mL水淋洗，吹干免疫親和柱，準(zhǔn)確移取1 mL甲醇洗脫免疫親和柱至試管中，于50 ℃水浴加熱條件下氮吹至近干加入1 mL初始流動相復(fù)溶，0.45 μm濾膜過濾，收集濾液于樣品瓶中，以備進樣。

提取劑用量優(yōu)化：稱取5 g樣品，用10、20、25、30 mL超純水進行提取。其余均按上述制備方法操作，分析結(jié)果的影響。

凈化條件優(yōu)化：取1 mL甲醇洗脫免疫親和柱至試管中，于50 ℃水浴加熱條件下氮吹至近干加入1 mL初始流動相復(fù)溶與1 mL甲醇洗脫免疫親和柱至試管中，不經(jīng)過氮吹直接加入1 mL超純水混勻，分析結(jié)果的影響。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：準(zhǔn)確移取100 mg/L的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1 000 μL于10 mL容量瓶中，使用初始流動相定容至刻度，配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：準(zhǔn)確移取適量的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液用初始流動相稀釋，配制成100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，4 ℃保存，有效期7 d。

1.3.5 方法驗證

根據(jù)GB/T 5009.1—2003《食品衛(wèi)生檢驗方法 理化部分 總則》[13]附錄A及GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[14]附錄F的規(guī)定，對該方法的線性關(guān)系、靈敏度、檢出限、定量限、重復(fù)性、準(zhǔn)確性等進行驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 稱樣量優(yōu)化

實驗對比了稱取嘔吐毒素陽性質(zhì)控樣品25 g、聚乙二醇5 g、超純水100 mL提取與稱取嘔吐毒素陽性質(zhì)控樣品5 g、聚乙二醇1 g、超純水20 mL提取對結(jié)果的影響，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，縮小稱樣量至5 g對檢測結(jié)果影響不大，接近陽性質(zhì)控樣品的標(biāo)準(zhǔn)值。但是當(dāng)稱樣量為5 g時可以采用50 mL一次性離心管置于多孔位全自動渦旋振蕩器來進行提取，能夠一次性提取更多樣品，并且能節(jié)約樣品和試劑，同時使用一次性離心管代替錐形瓶可減少樣品交叉污染的風(fēng)險。

2.2 提取劑用量優(yōu)化

實驗對比了稱取5 g樣品時，用10、20、25、30 mL超純水進行提取對結(jié)果的影響，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，10 mL超純水提取效果不佳，其余3種用量對結(jié)果影響不大，均在陽性質(zhì)控樣品標(biāo)準(zhǔn)值誤差允許范圍內(nèi)，但25 mL超純水的提取效果最好，最接近標(biāo)準(zhǔn)值。

2.3 氮吹對檢測結(jié)果的影響

實驗對比了1 mL甲醇洗脫免疫親和柱至試管中，于50 ℃水浴加熱條件下氮吹至近干加入1 mL初始流動相復(fù)溶與1 mL甲醇洗脫免疫親和柱至試管中，不經(jīng)過氮吹直接加入1 mL超純水混勻?qū)Y(jié)果的影響，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，減少氮吹環(huán)節(jié)較氮吹后的結(jié)果差異不明顯，且其結(jié)果均在陽性質(zhì)控樣品標(biāo)準(zhǔn)值誤差允許范圍內(nèi)。同時不氮吹的樣品峰附近無大的雜峰干擾，見圖1。不進行氮吹不僅可避免氮吹過程對待測成分的影響，同時又可以較大程度節(jié)約前處理的時間。

2.4 方法的線性關(guān)系、靈敏度、檢出限、定量限、重復(fù)性、準(zhǔn)確性

2.4.1 方法的線性關(guān)系

將濃度分別為100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，按照1.3.1的色譜條件進樣測定，以嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)工作濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，線性回歸方程為Y=0.084 8X-2.192 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 97，結(jié)果表明嘔吐毒素濃度在100～5 000 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4.2 方法的靈敏度、檢出限、定量限測定

根據(jù)GB/T 5009.1—2003附錄A的規(guī)定，線性回歸曲線的斜率b是方法的靈敏度，故該方法的靈敏度為0.084 8。以3倍信噪比（S/N=3）確定檢出限為18.4 μg/kg，以10倍信噪比（S/N=10）確定定量限為61.3 μg/kg。滿足GB 5009.111—2016對檢出限和定量限的要求。

2.4.3 方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性

以陰性玉米樣品為基質(zhì)，添加一定量嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其添加水平為玉米嘔吐毒素限量標(biāo)準(zhǔn)的0.5倍（500 μg/kg）、1倍（1 000 μg/kg）、2倍（2 000 μg/kg）。分別做6個平行樣品按照1.3.1的色譜條件進樣測定，嘔吐毒素回收率及重復(fù)性結(jié)果見表4。結(jié)果表明，本方法嘔吐毒素回收率為90.04%～108.42%，方法和儀器重復(fù)性測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.69%～6.70%。滿足GB/T 27404—2008對重復(fù)性和準(zhǔn)確性的要求。

3 結(jié) 論

本文優(yōu)化了玉米中嘔吐毒素的測定，建立了一種快速、準(zhǔn)確地大批量檢驗玉米中嘔吐毒素含量的測定方法。研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)臏p少稱樣量xP2DBxGFdQDmvnZs16mOpkvFI3HUphm6xuDTXKq8QXI=、增大提取液比例能夠使提取效果更好；樣品前處理過程不使用PBS緩沖溶液對測定結(jié)果幾乎無影響，使用一次性離心管代替錐形瓶可減少樣品交叉污染的風(fēng)險，不需要氮吹既可避免氮吹過程對待測成分的影響又可以較大程度節(jié)約前處理的時間。實驗結(jié)果表明，該方法從提取到凈化色譜分離的時間控制在40 min內(nèi)完成。方法檢出限為18.4μg/mL，定量限為61.3 μg/mL，樣品回收率在90.04%～108.42%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.69%～6.70%，顯示出較高的精密度和回收率。說明該方法實用性強、穩(wěn)定性高、效率顯著提升，可適用于大規(guī)模玉米樣品監(jiān)測。

參 考 文 獻

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