腦多肽對(duì)PCPA誘導(dǎo)的睡眠障礙小鼠5-羥色胺系統(tǒng)和腸道菌群的影響

摘" 要：為探究腦多肽對(duì)昆明小鼠睡眠和腸道菌群的影響，通過小鼠神經(jīng)遞質(zhì)含量和氧化應(yīng)激水平的變化，分析腸道菌群與睡眠之間的聯(lián)系.腹腔注射對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA）建立睡眠障礙模型，連續(xù)灌胃給藥7 d，通過戊巴比妥鈉睡眠協(xié)同實(shí)驗(yàn)、懸尾和明暗箱實(shí)驗(yàn)以及小鼠神經(jīng)遞質(zhì)和氧化應(yīng)激水平的變化，分析腦多肽對(duì)睡眠障礙小鼠鎮(zhèn)靜催眠功能的影響；蘇木精-伊紅染色法（Hamp;E）和糖原染色法（AB-PAS）觀察小鼠海馬及結(jié)腸組織病理變化；收集糞便，進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序，分析小鼠腸道菌群豐度的變化.結(jié)果表明：腦多肽高、低劑量組小鼠睡眠時(shí)間顯著增加，睡眠潛伏期顯著縮短，MDA含量顯著降低，5-HT、GABA、MT含量、GSH-Px和SOD酶活均顯著升高（Plt;0.05）；小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊，胞核固縮深染現(xiàn)象改善，結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；腦多肽高劑量組擬桿菌門豐度顯著升高，乳桿菌屬、雙歧桿菌屬豐度顯著升高（Plt;0.05），擬桿菌屬豐度與GSH-Px的變化趨勢(shì)呈顯著正相關(guān)，乳桿菌屬豐度與5-HT、MT、SOD的變化趨勢(shì)呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）.腦多肽通過調(diào)節(jié)腸道菌群正向調(diào)節(jié)血清內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和腦組織氧化應(yīng)激水平，有效治療PCPA誘導(dǎo)的小鼠睡眠障礙癥狀，隨著劑量增加治療效果明顯提高.

關(guān)鍵詞：腦多肽；5-羥色胺；腸道菌群；氧化應(yīng)激；睡眠障礙

中圖分類號(hào)：R917""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：10001565（2024）05048312

DOI：10.3969/j.issn.10001565.2024.05.005

Effects of brain peptides on 5-hydroxytryptamine system and intestinal flora in PCPA induced sleep disorder mice

HUANG Xinran， WANG Linna， DAI Jiaqi， SONG Nannan， ZHOU Chengyan

（Key Laboratory of Pharmaceutical Quality Control of Hebei Province， College of Pharmacy Sciences， Hebei University， Baoding 071002， China）

Abstract： This work studied the impact of brain peptide （BP） on sleep and intestinal microbiota in mice， and analyzed the relationship between intestinal microbiota and sleep through changes in neurotransmitter content and oxidative stress levels in mice. The insomnia model was established by peritoneal injection of p-chlorophenylalanine （PCPA）， which was administered via continuous gavage for 7 days. The sedative and hypnotic effects of brain peptides on insomniac mice were analyzed by using a pentobarbital sodium sleep coordination test， tail suspension test（TST），light and dark box test （LDB）， along with measurements of

收稿日期：20240404;修回日期：20240518

基金項(xiàng)目：

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（H2020201291）；貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（FAMP202006K）

第一作者：黃欣然（2003—），女，河北大學(xué)在讀碩士研究生，主要從事睡眠疾病菌群相關(guān)研究以及藥物分析方向研究.E-mail：huang18132083386@163.com

通信作者：周程艷（1976—），女，河北大學(xué)副教授，主要從事代謝組學(xué)、菌群、脂質(zhì)組學(xué)以及相關(guān)藥理作用機(jī)制研究.E-mail：xuefanone@163.com

neurotransmitter levels and oxidative stress markers. Hematoxylin-eosin staining （Hamp;E） and glycogen staining （AB-PAS） were used to observe histopathological changes in the hippocampus and colon of mice. The stool was collected and 16S rRNA gene was sequenced to analyze the changes of intestinal flora abundance in mice. Compared with the model group， the sleep latency of mice in the high-dose and low-dose brain polypeptide groups was significantly shortened， and the sleep time was significantly increased. MDA content decreased significantly， 5-HT， GABA and MT content， the enzyme activity of GSH-Px and SOD increased significantly in high-dose brain polypeptide group（Plt;0.05）. The neuronal cells in CA1 region of hippocampus of mice were arranged neatly， the phenomenon of nuclear shrinkage and deep staining was improved， and the infiltration of inflammatory cells in colon tissue was reduced. 16S rRNA results showed that compared with the model group， the abundance of Bacteroidetes was significantly increased in the high-dose BP group at the phylum level， and the abundance of Lactobacillus and Bifidobacterium at the genus level was significantly increased （Plt;0.05）. Pearson correlation analysis showed that the abundances of Bacteroides was positively correlated with the trends of GSH-Px， and the abundances of Lactobacillus was positively correlated with the trend of 5-HT， MT and SOD （Plt;0.05）. Brain polypeptide can effectively treat PCPA induced insomnia in mice by regulating intestinal flora and positively regulating serum neurotransmitter and brain tissue oxidative stress level， and the therapeutic effect is better with the increase of dose.

Key words： brain polypeptide；5-hydroxytryptamine；intestinal flora；oxidative stress；somnipathy

睡眠是中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)下機(jī)體周期性、反復(fù)性的生理活動(dòng)，在恢復(fù)體力、維持身體生存、保護(hù)腦功能以及正常生理活動(dòng)方面發(fā)揮重要作用［1］.當(dāng)睡眠-覺醒機(jī)制出現(xiàn)異常時(shí)，機(jī)體就會(huì)發(fā)生睡眠障礙，發(fā)生一系列睡眠和覺醒狀態(tài)相關(guān)的以睡眠過多或不足為主要表現(xiàn)的疾病.睡眠障礙已成為中國社會(huì)公共衛(wèi)生問題，中國有近4億人患有睡眠障礙，睡眠障礙機(jī)制問題亟待解決［2］.研究表明，睡眠-覺醒周期主要受中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控，而這一過程涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)與腸道菌群等微生物的復(fù)雜相互作用.機(jī)體中通過腦-腸軸的免疫、神經(jīng)調(diào)節(jié)和內(nèi)分泌，達(dá)到調(diào)控睡眠的目的.研究證實(shí)機(jī)體發(fā)生睡眠障礙時(shí)會(huì)出現(xiàn)晝夜節(jié)律紊亂和睡眠不足，進(jìn)而產(chǎn)生生理壓力并且能夠改變腸道菌群豐度和腸道通透性［3］，提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)與睡眠之間存在復(fù)雜聯(lián)系，這種聯(lián)系在入睡前后腸道微生物的活動(dòng)、腸道菌群的變化之中可以顯現(xiàn)［4-5］.

動(dòng)物大腦中含有多種具有神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的腦多肽（BP），它們?cè)谡{(diào)節(jié)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和促進(jìn)神經(jīng)信息傳遞中發(fā)揮著極為重要的作用.從豬中提取的腦組織勻漿制備的腦多肽注射液具有保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受侵害、改善記憶系統(tǒng)、促進(jìn)大腦成熟、提高腦組織抗缺氧能力等作用［6］.本實(shí)驗(yàn)主要以豬源腦多肽為研究對(duì)象，探究是否能夠通過調(diào)節(jié)腦-腸軸改善睡眠.

為進(jìn)一步探究腦多肽能否通過腦-腸軸機(jī)制調(diào)控腸道菌群改善相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)睡眠，本研究通過分析腦多肽營(yíng)養(yǎng)液對(duì)睡眠障礙小鼠睡眠相關(guān)生理指標(biāo)的影響，采用16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)分析正常組（NC），模型組（INS），腦多肽高、低劑量組（BP、BP-L）小鼠腸道菌群的變化，探究睡眠障礙的發(fā)生與腸道菌群之間的聯(lián)系.

1" 材料

1.1" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

18～22 g的雄性SPF級(jí)KM小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（京）2021-0011.

1.2" 藥品與儀器

腦多肽營(yíng)養(yǎng)液（河北智同生物制藥有限公司，批號(hào)20220601）；艾司唑侖（規(guī)格：1 mg/片，上海信誼藥廠有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20200619）；對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA，上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)C14214611）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px） 測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒、丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（南京生物建成工程研究所）；小鼠5-羥色胺（5-HT）和褪黑素（MT）和γ-氨基丁酸（GABA）的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（武漢酶免生物科技有限公司，批號(hào)均為202307）.

高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；高速低溫組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；YD-A2生物組織攤片機(jī)、YD-B生物組織烤片機(jī)、YD-6L生物組織包埋機(jī)、YD-335石蠟切片機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）.

2" 方法

2.1" 動(dòng)物分組、造模及給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將50只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為5組，為正常組（NC）、模型組（INS）、艾司唑侖組（SA）、腦多肽高劑量組（BP）、腦多肽低劑量組（BP-L），每組10只.除正常組外其余小鼠建立睡眠障礙模型，于每日早晨8—9點(diǎn)連續(xù)3 d腹腔注射PCPA混懸液（300 mg/kg，10 mg/mL）.當(dāng)小鼠出現(xiàn)坐立不安、躁動(dòng)、日間活動(dòng)增加等現(xiàn)象，表明造模成功［7］.對(duì)造模成功的小鼠于次日上午開始給藥，連續(xù)7 d，劑量設(shè)計(jì)與分組見表1.實(shí)驗(yàn)過程觀察記錄小鼠每日攝食量、攝水量、體質(zhì)量的變化、外貌及精神狀態(tài)等.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠脫頸處死，眼眶取血，離心收集血清，低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?，取出腦、肝、脾、腎、結(jié)腸，濾紙擦拭并稱量，根據(jù)公式計(jì)算相應(yīng)臟器系數(shù).臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%.

2.2" 腦多肽對(duì)睡眠障礙小鼠行為學(xué)影響

2.2.1" 明暗穿梭箱實(shí)驗(yàn)（LDB）

攝像記錄小鼠從箱體正中格開始5 min 內(nèi)的行為，以及小鼠進(jìn)入明箱次數(shù)、明箱停留時(shí)間；更換小鼠時(shí)，應(yīng)提前清洗箱體地面及內(nèi)壁，減少余留信息，減小實(shí)驗(yàn)誤差［8］.

2.2.2" 懸尾實(shí)驗(yàn)（TST）

用醫(yī)用膠帶將小鼠尾巴（距尾尖約1 cm）固定在掛鉤上，使小鼠頭自然垂下，頭距離地面約30 cm，用攝像設(shè)備正對(duì)小鼠，記錄5 min內(nèi)小鼠的狀態(tài).本實(shí)驗(yàn)主要通過小鼠在懸掛狀態(tài)下不斷掙扎以及累計(jì)出現(xiàn)的間斷性相對(duì)靜止時(shí)間來評(píng)價(jià)小鼠的絕望狀態(tài).實(shí)驗(yàn)記錄了首次達(dá)到靜止?fàn)顟B(tài)的時(shí)間，以及相對(duì)靜止期（特指四肢僅有小幅度抖動(dòng)或完全靜止的狀態(tài)）的持續(xù)時(shí)間和占總觀察時(shí)間的百分比.

2.2.3" 腦多肽對(duì)睡眠障礙小鼠睡眠協(xié)同實(shí)驗(yàn)的影響

末次給藥之后，進(jìn)行戊巴比妥鈉睡眠協(xié)同實(shí)驗(yàn)，同時(shí)評(píng)估造模和藥物干預(yù)效果.腹腔注射0.01 mL/g戊巴比妥鈉（55 mg/kg），通過翻正反射實(shí)驗(yàn)，觀察并記錄小鼠睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間［9］.

2.3" 腦多肽對(duì)睡眠障礙小鼠神經(jīng)遞質(zhì)含量及氧化應(yīng)激水平的影響

采用 ELISA 試劑盒檢測(cè)血清中的GABA、5-HT、MT水平，檢測(cè)腦組織勻漿中MDA的含量和 SOD、GSH-px的酶活性.

2.4" 腦多肽對(duì)PCPA睡眠障礙小鼠組織病理學(xué)變化的影響

每組隨機(jī)抽取3只小鼠的結(jié)腸組織和腦組織，施行梯度脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精和伊紅染色（H＆E），光學(xué)顯微鏡下觀察染色切片并拍照［10］.另外取結(jié)腸組織進(jìn)行 AB-PAS 染色，進(jìn)行組織病理學(xué)分析.

2.5" 腦多肽對(duì)睡眠障礙小鼠糞便16S rRNA基因測(cè)序的分析

采用隨機(jī)數(shù)字表法在3組中隨機(jī)挑選6只小鼠的糞便標(biāo)本進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序分析.設(shè)計(jì)16S rDNA V3-V4區(qū)域的引物，在Illumina平臺(tái)對(duì)群落DNA片段進(jìn)行雙端測(cè)序，進(jìn)一步對(duì)高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)解析生物信息［11］.

主要采用Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)進(jìn)行Alpha多樣性分析，分析不同組別小鼠菌群均勻度和豐富度的變化；采用主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）闡述Beta多樣性分析，評(píng)估不同組別菌群組成和分布的相似性與差異性；繪制門、屬水平群落結(jié)構(gòu)堆疊圖，比較各組腸道菌群種類與豐度，進(jìn)行LEfSe分析尋找差異菌群；采用冗余分析法，闡述血清中神經(jīng)遞質(zhì)、腦組織中氧化應(yīng)激水平與腸道菌群的關(guān)系，進(jìn)一步采用Spearman相關(guān)系數(shù)繪制關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析圖及關(guān)聯(lián)熱圖，精確呈現(xiàn)菌群與睡眠相關(guān)因子的關(guān)系.

2.6" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示.采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）進(jìn)行多組間分析、LSD法進(jìn)行組間兩兩比較，P＜0. 05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3" 結(jié)果

3.1" 腦多肽對(duì)睡眠障礙小鼠體質(zhì)量、攝食量、攝水量及臟器的影響

實(shí)驗(yàn)過程中NC組小鼠毛發(fā)、飲食、節(jié)律正常，具有良好精神狀態(tài).腹腔注射PCPA 造模后，模型組小鼠白天活動(dòng)減少，晝夜節(jié)律紊亂，毛發(fā)干枯，飲食減少.與造模前相比，除NC組外其余小鼠每日體質(zhì)量顯著降低，各組小鼠攝水量、攝食量均顯著降低（Plt;0.05），造模成功.給藥最后1 d體質(zhì)量與造模后體質(zhì)量相比，BP組體質(zhì)量為（20.15±2.13） g，SA組為（19.99±2.95） g，NC組為（20.56±1.48） g，均顯著增高，說明腦多肽給藥后，睡眠障礙小鼠體質(zhì)量回升［6］.

與NC組相比，INS組小鼠腦和結(jié)腸臟器系數(shù)升高（P＞0.05）；與INS組相比，給藥后BP組小鼠腦組織和結(jié)腸組織系數(shù)均顯著降低（P＜0.05）（表2）.臟器外觀見圖1，INS組小鼠腸腔中有深紅色血便出現(xiàn)，同時(shí)伴有結(jié)腸腸壁變薄；BP組結(jié)腸炎癥稍微緩解，結(jié)腸顏色呈淡紅色，糞便基本成形，腸腔不再出血；腦多肽給藥在一定程度上可以有效緩解結(jié)腸炎癥，改善臟器狀態(tài).

3.2" 腦多肽對(duì)睡眠障礙小鼠的行為及睡眠質(zhì)量改善情況

實(shí)驗(yàn)采用明暗箱實(shí)驗(yàn)，評(píng)估藥物的抗焦慮和鎮(zhèn)靜作用［12］.腦多肽給藥后，BP、BP-L組明箱停留時(shí)間較模型組均顯著延長(zhǎng)（Plt;0.05）（表3），表明腦多肽用藥后可以鎮(zhèn)靜催眠，減輕小鼠焦慮樣行為.懸尾實(shí)驗(yàn)是最經(jīng)典的評(píng)價(jià)藥物鎮(zhèn)靜催眠作用、抗抑郁作用、興奮性作用的動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法之一，懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)也作為PCPA睡眠障礙小鼠模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一［13］.與INS組相比，BP組的靜止?fàn)顟B(tài)持續(xù)時(shí)間顯著縮短（Plt;0.05）（表3），隨著腦多肽給藥劑量增加，持續(xù)時(shí)間繼續(xù)縮短，說明腦多肽治療后，小鼠活動(dòng)能力明顯改善，睡眠障礙絕望的行為減少［14］.

本研究根據(jù)《保健食品功能檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法》（2023版）中規(guī)定，睡眠協(xié)同實(shí)驗(yàn)采用戊巴比妥鈉進(jìn)行［15］.在戊巴比妥鈉（55 mg/kg）的誘導(dǎo)催眠下，與INS相比，BP組、BP-L組睡眠潛伏期均顯著降低（Plt;0.05），并且隨著腦多肽給藥量增加，睡眠動(dòng)物數(shù)增加，小鼠睡眠潛伏期縮短，睡眠時(shí)間加長(zhǎng)（表4），說明腦多肽（12 mg/kg）有改善睡眠的功能［5］.

3.3" 腦多肽對(duì)睡眠障礙小鼠血清內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)、腦組織氧化應(yīng)激水平的影響

與NC組相比，INS組小鼠血清內(nèi)5-HT、MT、GABA的含量均顯著降低（Plt;0.05）（表5）.與INS組相比，BP組小鼠神經(jīng)遞質(zhì)中 5-HT、MT和GABA的含量顯著提升（Plt;0.05）.這與徐飛飛等［16］的研究結(jié)果一致，證明腦多肽有利于提高小鼠血清和神經(jīng)遞質(zhì)中5-HT、MT和GABA的含量.

與INS組相比（表5），BP、BP-L組小鼠腦組織中MDA的含量降低、GSH-Px、SOD 的酶活性升高（Plt;0.05）.這與李莉等［17］的研究結(jié)果一致，腦多肽能夠在改善睡眠相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)而改善睡眠質(zhì)量的同時(shí)降低腦組織中MDA含量、提高小鼠腦組織中GSH-Px、SOD 酶活性，改善小鼠氧化應(yīng)激水平.提示腦多肽可調(diào)理睡眠障礙小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平.

3.4" 腦多肽對(duì)睡眠障礙小鼠結(jié)腸及腦組織病理變化的影響

使用H＆E和AB-PAS 2種染色方法對(duì)小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行病理學(xué)觀察，和NC組相比，INS組小鼠結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞減少，細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)明顯，炎癥癥狀明顯；和INS組相比，BP組結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)減少，炎癥癥狀得到改善［18］.

睡眠障礙作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，與腦組織關(guān)系密切，其中，海馬體、大腦皮質(zhì)、下丘腦作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)代表性腦區(qū)，與睡眠障礙相關(guān)性更強(qiáng).海馬體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，在調(diào)節(jié)睡眠-覺醒過程中有十分重要的作用［19］，進(jìn)行海馬區(qū)H＆E染色，觀察各組病理變化.NC組小鼠CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的排列規(guī)律整齊，未出現(xiàn)細(xì)胞核固縮現(xiàn)象；INS組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列十分不規(guī)則，并且伴隨出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)胞核固縮現(xiàn)象；和INS組相比，BP組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列較為整齊規(guī)則，細(xì)胞核固縮現(xiàn)象減少（圖2），說明腦多肽在一定程度上改變小鼠結(jié)腸病理表征，有效改善了睡眠.

3.5" 腦多肽對(duì)睡眠障礙小鼠腸道菌群的影響

3.5.1" Alpha多樣性和Beta多樣性分析

平緩的 Alpha 多樣性稀釋曲線表明本實(shí)驗(yàn)測(cè)序樣本足夠，測(cè)序結(jié)果能充分反映當(dāng)前樣本所包含的微生物信息（圖3a）.Alpha多樣性是局部均勻生物環(huán)境下的物種在豐富度、多樣性和均勻度等方面的指標(biāo)，本研究評(píng)估小鼠腸道菌群物種均勻、豐富度采用Shannon 和Simpson 指數(shù)，評(píng)估小鼠腸道菌群中包含物種的數(shù)目采用Chao1和Observed-species指數(shù)［5］.INS組的Chao1、Observed-species、Simpson 和Shannon指數(shù)顯現(xiàn)降低趨勢(shì)，BP組Observed-species、Simpson和Shannon指數(shù)呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，但均無明顯差異（Pgt;0.05）（圖3b）.本實(shí)驗(yàn)采用主坐標(biāo)分析法反映Beta多樣性，睡眠障礙造模成功后，BP組小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)較正常組發(fā)生明顯變化，組間差異較大，說明腦多肽給藥后改變了睡眠障礙小鼠體內(nèi)的腸道菌群，菌群多樣性發(fā)生變化（圖3c）.

3.5.2" 睡眠障礙小鼠腸道菌群分類學(xué)組成分析

16S rRNA 基因測(cè)序結(jié)果，3組小鼠腸道菌群共注釋到23個(gè)門，57個(gè)綱，91個(gè)目，150個(gè)科，244個(gè)屬，316個(gè)種［5］.在門水平上（圖4a），3組小鼠的優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）［5］.BP組的厚壁菌門相對(duì)豐度顯著降低，擬桿菌門相對(duì)豐度顯著升高（Plt;0.05）（表6）.屬水平上（圖4b），乳桿菌屬（Lactobacillus）、異桿菌屬（Allobaculum）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）等占比較高［20］.INS組乳桿菌屬、異桿菌屬、雙歧桿菌屬相對(duì)豐度顯著性降低，BP組乳桿菌屬相對(duì)豐度顯著性升高（Plt;0.05）（表7）.

采用LEfSe（LDA Effect Size）分析尋找差異菌群，在屬水平上，BP組克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、放線菌屬的Adlercreutzia菌群豐度具有顯著性差異變化，菌群豐度均表現(xiàn)升高（圖4c、4d）.

3.5.3" 血清中神經(jīng)遞質(zhì)、腦組織中氧化應(yīng)激水平與腸道菌群的相關(guān)性分析

門水平上，擬桿菌門、放線菌門與5-HT、GABA、MT的含量及SOD、GSH-Px的酶活性呈正相關(guān)，與MDA的含量負(fù)相關(guān)［20］（圖5a）.屬水平上，乳桿菌屬、雙歧桿菌屬與5-HT、GABA、MT的含量及SOD、GSH-Px的酶活性呈正相關(guān)，與MDA呈負(fù)相關(guān)（圖5b）.相關(guān)性熱圖中，變形菌門與GABA、MT顯著正相關(guān)，乳桿菌屬與5-HT、MT、SOD、GSH-Px呈顯著正相關(guān)，擬桿菌屬與GSH-Px的變化趨勢(shì)呈顯著正相關(guān)，放線菌門與5-HT、MT、SOD、GSH-Px顯著正相關(guān)，雙歧桿菌屬與MDA、MT、GSH-Px顯著正相關(guān)（Plt;0.05）（圖5c、5d）.

4" 討論

睡眠發(fā)生是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一個(gè)主動(dòng)過程，發(fā)生睡眠障礙的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與睡眠-覺醒機(jī)制有關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化相關(guān)［21］.腸道菌群同時(shí)能夠?qū)λ哒系K產(chǎn)生影響［4］，微生物的代謝產(chǎn)物可能在其中發(fā)揮重要作用，一些細(xì)菌能產(chǎn)生多巴胺、血清素、乙酰膽堿、γ-氨基丁酸及其他類似神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)［22］.這類神經(jīng)遞質(zhì)中5-HT對(duì)調(diào)節(jié)睡眠、痛覺等生理功能有一定影響，MT分泌量直接影響睡眠質(zhì)量和節(jié)律，GABA 是腦內(nèi)最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能夠促進(jìn)覺醒向睡眠轉(zhuǎn)化，正向調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)就能夠正向調(diào)節(jié)睡眠［22］.提示大腦與腸道微生物之間存在雙向性的關(guān)系，本文用微生物群-腸-腦軸的機(jī)制來探究睡眠機(jī)制（圖6）.

實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射PCPA制備睡眠障礙小鼠模型，睡眠障礙小鼠體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，懸尾不動(dòng)時(shí)間顯著增加，明箱停留時(shí)間縮短，戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)小鼠的睡眠潛伏期延長(zhǎng)，睡眠維持時(shí)間縮短，提示PCPA誘導(dǎo)的睡眠障礙小鼠模型復(fù)制成功.腦多肽高劑量治療小鼠的5-HT、GABA、MT含量以及SOD、GSH-Px酶活性顯著性升高，MDA含量顯著性降低，提示腦多肽可能通過正向調(diào)節(jié)睡眠-覺醒神經(jīng)遞質(zhì)改善睡眠［16-17］.此外，腸道菌群在睡眠剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起關(guān)鍵作用［20］.腦多肽治療睡眠障礙小鼠腸道菌群Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)無顯著性差異，菌群總體多樣性無顯著性變化，但3組小鼠菌群組成上存在顯著性差異，腦多肽可能改善特定菌的豐度，對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)一步分析，將有助于理解腦多肽的作用機(jī)制.

擬桿菌門、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬是睡眠菌群研究中的常用指標(biāo)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪后小鼠出現(xiàn)腸道擬桿菌門豐度減少，體內(nèi)丁酸鹽增多的現(xiàn)象，提示擬桿菌與神經(jīng)發(fā)育正相關(guān)，是人體有益菌［23-24］.同時(shí)在腸道菌群中，乳桿菌屬是維持腸道穩(wěn)態(tài)的有益菌，連續(xù) 24 h 剝奪睡眠可降低小鼠乳桿菌屬的相對(duì)豐度［19］.乳桿菌屬豐度的增加不僅能改善睡眠障礙，同時(shí)能提高 5-HT 水平，推測(cè)乳桿菌屬能夠正向調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)改善睡眠［20］.菌群分類學(xué)組成表明，腦多肽可以增加擬桿菌門、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬這3類菌的豐度，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)擬桿菌門與5-HT的變化趨勢(shì)呈正相關(guān)，乳桿菌屬與5-HT顯著性正相關(guān).推測(cè)腦多肽可能上調(diào)擬桿菌、乳桿菌屬豐度，通過腦-腸軸調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量，改善睡眠障礙（圖6）.

文獻(xiàn)［25］研究顯示，羅漢果提取物能夠通過調(diào)節(jié)血清內(nèi)MDA、SOD濃度使機(jī)體恢復(fù)正常氧化平衡狀態(tài)，從而改善睡眠，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.提示腦多肽可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)，改善睡眠.在研究黃芩素對(duì)腸道影響的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)擬桿菌科可以減輕炎癥，抑制有害菌和氧化應(yīng)激［26］.任璐婷等［27］在研究結(jié)腸炎癥時(shí)發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬可以抑制促炎因子分泌緩解腸道炎癥，提示擬桿菌和乳桿菌豐度的增加可以改善氧化應(yīng)激.腦多肽高劑量治療小鼠的SOD、GSH-Px酶活性顯著性升高，MDA含量顯著性降低，擬桿菌屬與MDA的變化趨勢(shì)呈正相關(guān)，乳桿菌屬與SOD酶活性呈顯著正相關(guān)，推測(cè)腦多肽可以在一定程度上通過改善菌群豐度，激活體內(nèi)抗氧化酶SOD的活性，清除細(xì)胞內(nèi)增多的過氧化產(chǎn)物MDA，正向調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平，進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)，改善睡眠障礙.

5" 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射PCPA造模，進(jìn)行戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)證實(shí)造模成功.通過16Sr RNA基因測(cè)序以及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)測(cè)定，推測(cè)腦多肽可能通過上調(diào)擬桿菌門、乳桿菌屬豐度，并利用腦-腸軸通路上調(diào)5-HT的含量、SOD活性，下調(diào)MDA含量改善小鼠睡眠.

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（責(zé)任編輯：梁俊紅）