微生物酶制劑對(duì)上部煙葉醇化品質(zhì)的影響

摘要 為改善煙葉醇化品質(zhì)，以低次紅花大金元上部煙葉為試材，將BioApex微生物酶應(yīng)用于煙葉醇化中，比較醇化煙葉的常規(guī)化學(xué)成分、揮發(fā)性香氣成分和感官質(zhì)量的變化。結(jié)果表明，添加微生物酶制劑會(huì)增加除氯以外的其他常規(guī)化學(xué)成分含量；同時(shí)降低了兩糖差，使煙葉成分更加協(xié)調(diào)。各微生物酶制劑處理煙葉中還原糖、水溶性糖含量與CK相比均顯著增加，但醇化時(shí)間延長會(huì)顯著降低煙堿和水溶性糖含量。微生物酶制劑處理增加了煙葉中芳香族氨基酸降解產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量。與CK相比，0.5%、1.0%和2.0%微生物酶制劑處理（90 d）明顯改善了煙葉的感官質(zhì)量。綜上所述，微生物酶制劑能夠促進(jìn)煙葉內(nèi)含物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，提升紅花大金元上部煙葉的品質(zhì)。該研究可為煙葉微生物酶制劑發(fā)酵工藝在工業(yè)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 微生物酶制劑；上部煙葉；醇化；品質(zhì)

中圖分類號(hào) TS41+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2024）18-0166-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.18.036

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of Microbial Enzyme Preparations on the Aging Quality of Upper Tobacco Leaves

WU Yao-ting，LIU Dan-ran，LI Run-jie et al

（Yunnan Tobacco Leaf Company，Kunming，Yunnan 650217）

Abstract In order to improve the aging quality of tobacco leaves，using the low-grade and upper tobacco leaves of Honghua Dajinyuan as the test material，the BioApex microbial enzyme was applied to tobacco leaves，and the conventional chemical components，volatile aroma composition and sensory quality of aged tobacco leaves were compared.The results showed that the content of conventional chemical components except chlorine were increased by microbial enzymes.Simultaneously，the microbial enzymes decreased the difference between the content of total sugars and reducing sugar，and coordinated chemical composition of aged leaves.With the increases of enzyme concentration，the content of reducing sugar，water-soluble sugar and potassium in tobacco leaves were also significantly increased.However，prolonged aging time will significantly reduce the content of nicotine and water-soluble sugar.Microbial enzyme treatment increased the degradation products of aromatic amino acids，carotenoids，and Maillard reactions in tobacco leaves.The sensory quality of tobacco leaves treated with 0.5%，1.0% and 2.0% （90 days） concentration of microbial enzyme were obviously improved compared with the control.In summary，microbial enzymes can promote the transformation of tobacco leaf contents and effectively improve the quality of the upper tobacco leaves.This study can provide theoretical basis for the industrial application of microbial enzyme preparation fermentation technology in tobacco leaves.

Key words Microbial enzyme preparations;Upper tobacco leaves;Aging;Quality

基金項(xiàng)目 云南省煙草煙葉公司科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022530000216101）。

作者簡介 吳曜廷（1997—），男，云南昭通人，助理工程師，從事煙葉倉儲(chǔ)研究。*通信作者：徐晨元，助理工程師，從事煙葉醇化研究；李作森，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事煙葉生產(chǎn)研究。

收稿日期 2023-10-31

煙葉醇化是煙草加工過程中的重要步驟，同時(shí)醇化也是煙葉吸食品質(zhì)形成過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)［1］。新鮮煙葉自然晾曬或初烤后普遍存在香氣質(zhì)單調(diào)、香氣量不足、雜氣較重和刺激性辛辣等品質(zhì)缺陷，達(dá)不到工業(yè)加工的要求。醇化處理可以改善這些品質(zhì)缺陷，使煙葉彈性增強(qiáng)、色澤均勻、燃燒性明顯改善。煙葉發(fā)酵主要有自然發(fā)酵（也稱陳化或醇化）和人工發(fā)酵2種方式。自然發(fā)酵流程簡單、操作容易、技術(shù)要求低，但也存在發(fā)酵時(shí)間長等缺點(diǎn)［2］。人工發(fā)酵可以在特定強(qiáng)化溫度和空氣濕度的環(huán)境下加速煙葉醇化，使其更符合吸食要求。與自然醇化相比，它有著發(fā)酵速度較快、發(fā)酵比較徹底、發(fā)酵時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)［3］。近年來，利用微生物和酶技術(shù)改善煙葉發(fā)酵品質(zhì)的應(yīng)用研究已見諸報(bào)端［4-6］。邵燈寅等［7］發(fā)現(xiàn)黑曲霉和自釀米酒酒糟對(duì)低檔次煙葉有較好的提質(zhì)效果。毛亞浩等［8］從煙葉提取液中篩選出一種巨大芽孢桿菌，它可以降低雪茄茄芯煙葉中木質(zhì)素含量、改善煙葉品質(zhì)。但是，目前對(duì)微生物+酶制劑應(yīng)用于煙草發(fā)酵的研究還不夠深入。

紅花大金元是云南主栽烤煙品種之一，具有突出的清香型風(fēng)格。為了改善和提高紅花大金元上部煙葉的可用性，更好地滿足卷煙工業(yè)需求，筆者探討了微生物酶制劑對(duì)紅花大金元上部初烤煙葉醇化品質(zhì)的影響，以期為煙葉醇化和品質(zhì)提升提供新的途徑和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙葉為云南宜良初烤的紅花大金元上部低次煙葉。BioApex生物酶制劑（食用），由菀之源生物科技（深圳）有限公司提供，主要成分為乳酸球菌、解淀粉芽孢桿菌、粉狀畢赤酵母菌、德克酵母菌、戊糖片球菌、酵母提取物等。

1.2 主要儀器與設(shè)備

連續(xù)流動(dòng)分析儀Futura（法國AMS-Alliance）;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；火焰光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；同時(shí)蒸餾萃取裝置（天長市東祥玻璃儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）等。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.3.1 樣品處理。

選取初烤煙葉去梗后裝袋，放入恒溫恒濕箱（溫度20 ℃、相對(duì)濕度60%）平衡水分48 h，用快速水分測(cè)定儀測(cè)定平衡好的煙葉水分。

1.3.2 試驗(yàn)方法。

分別取平衡好水分的煙葉各2.5 kg，均勻地噴灑不同質(zhì)量濃度的微生物酶制劑水溶液（噴施水分質(zhì)量為煙葉質(zhì)量的5%），使微生物酶制劑的質(zhì)量為煙葉質(zhì)量的0.5%、1.0%和2.0%（處理T1、T2、T3），以添加相同體積無菌水的煙葉作為對(duì)照（CK）。將4個(gè)處理的試驗(yàn)樣品裝入透氣塑料袋，閉光放置于室溫下發(fā)酵。于醇化30和90 d時(shí)分別取樣，對(duì)煙葉進(jìn)行酶滅活，測(cè)定化學(xué)成分含量，同時(shí)切絲卷制卷煙，平衡水分后進(jìn)行感官評(píng)吸。

1.3.3 常規(guī)化學(xué)成分測(cè)定。

煙葉中總氮、煙堿、氯含量的測(cè)定參考《YC/T 161—2002煙草及煙草制品 總氮的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》《YC/T 160—2002煙草及煙草制品 總植物堿的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》《YC/T 162—2002煙草及煙草制品 氯的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》；鉀含量的測(cè)定參考《YC/T 173—2003 煙草及煙草制品 鉀的測(cè)定 火焰光度法》；還原糖、水溶性糖含量的測(cè)定參考《YC/T 159—2002 煙草及煙草制品 水溶性糖的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》。

1.3.4 致香成分測(cè)定。

采用同時(shí)蒸餾萃取法，以正十七烷作為內(nèi)標(biāo)化合物，采用GC-MS進(jìn)行定性定量分析。樣品前處理方法參見文獻(xiàn)［9］方法。GC-MS檢測(cè)條件如下：進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣；柱流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1。升溫程序：初始溫度50 ℃（保持1 min），5 ℃/min的速度升至200 ℃，再以10 ℃/min的速度升至260 ℃（保持5 min）。電離方式為EI；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；四級(jí)桿溫度150 ℃；掃描方式為全掃描；質(zhì)量范圍35～450 amu；溶劑延遲3 min。

1.3.5 樣品感官評(píng)價(jià)。

參考YC/T 138—1998《煙草及煙草制品 感官評(píng)價(jià)方法》，由專業(yè)評(píng)吸人員對(duì)單料煙進(jìn)行評(píng)吸，每個(gè)處理評(píng)吸5支煙，主要對(duì)香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、濃度、刺激性、余味和勁頭7項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用 Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，使用 IBM SPSS Statistics 27 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析和方差分析，使用Origin 2018軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物酶制劑對(duì)煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響

煙草內(nèi)在化學(xué)成分是衡量煙葉品質(zhì)的“內(nèi)在”標(biāo)準(zhǔn)［10］。由表1可知，與對(duì)照CK（不外加酶發(fā)酵）相比，微生物酶制劑處理30 d后煙葉的總氮、煙堿、還原糖、水溶性糖和鉀含量均不同程度增加。其中，T1、T2和T3處理總氮含量分別比CK增加7.58%、7.11%和5.21%，煙堿含量分別增加21.72%、16.85%和18.35%，但是各微生物酶制劑處理總氮和煙堿含量均在適宜范圍內(nèi)。隨著微生物酶制劑濃度的增加，煙葉中的還原糖和水溶性糖含量呈現(xiàn)增加—降低—增加的變化趨勢(shì)，其中T3處理含量最高，其還原糖和水溶性糖含量分別比CK增加了54.76%和35.16%。T2處理的鉀含量比CK增加了6.83%；T1處理的氯含量比CK降低了38.10%，CK、T2、T3處理間差異不顯著。醇化90 d煙葉化學(xué)成分的變化趨勢(shì)與30 d時(shí)相似，除了中低濃度處理的煙葉氯含量明顯降低、高濃度處理煙葉鉀含量有所降低外，其他處理的化學(xué)成分含量都高于CK。其中，T3處理水溶性糖、還原糖和氯含量與CK相比顯著增加，T1處理總氮和煙堿含量最高。從醇化時(shí)間來看，煙葉總氮、煙堿、還原糖和水溶性糖含量隨時(shí)間的增加總體呈下降趨勢(shì)；中低濃度處理的鉀含量隨時(shí)間的增加而增加，高濃度處理鉀含量隨時(shí)間的增加而降低，但氯含量的變化規(guī)律則正好相反。

煙葉化學(xué)成分變化與煙草的品質(zhì)有關(guān)［11］，但煙草質(zhì)量并不取決于某一成分絕對(duì)量的高低，而取決于一系列物質(zhì)的協(xié)調(diào)性。通常認(rèn)為優(yōu)質(zhì)煙葉的施木克值為2～3，糖堿比為6.0～11.5，氮堿比為0.7～1.0，鉀氯比≥4，兩糖差越低越好［12］。唐珂等［13］認(rèn)為當(dāng)烤煙的兩糖差為2.4～3.4時(shí)，綜合感官質(zhì)量較好。從表2可以看出，30 d時(shí)，添加微生物酶制劑總體上提高了煙葉的施木克值、糖堿比，降低了兩糖差；90 d 時(shí)，添加微生物酶制劑增加了氮堿比和鉀氯比，但不同濃度微生物酶制劑對(duì)煙葉化學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響不同。總體來看，微生物酶制劑處理使煙葉的化學(xué)成分更加協(xié)調(diào)。

2.2 微生物酶制劑濃度與煙葉化學(xué)成分的相關(guān)性

由表3可知，微生物酶制劑濃度與煙葉中總氮、煙堿含量呈正相關(guān)；還原糖含量與水溶性糖含量呈極顯著相關(guān)，與鉀、氯含量均呈負(fù)相關(guān)。除總氮和鉀含量外，其他化學(xué)成分與醇化時(shí)間均呈負(fù)相關(guān)，其中醇化時(shí)間與煙堿和水溶性糖含量均呈顯著負(fù)相關(guān)?？偟颗c鉀含量，煙堿含量與還原糖含量、水溶性糖含量，還原糖含量與水溶性糖含量均呈極顯著正相關(guān)；總氮含量與氯含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，鉀含量與氯含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

2.3 微生物酶制劑對(duì)煙葉致香成分的影響

對(duì)煙葉致香成分進(jìn)行了測(cè)定，共檢出致香成分68種，定性出40種。不同處理煙葉的化學(xué)成分種類大致相同，但致香成分的含量存在差異。如圖1所示，醇化90 d時(shí)，對(duì)照CK中西松烯、香葉基香葉醇、亞麻

酸

甲酯、香根酮、（+）-芳烯、5-甲基呋喃醛、3-亞甲基-7，11-二甲基-1-十二烯、石竹烯的含量都比各微生物酶制劑處理高。T1處理1，1，5，6-四甲基茚滿、新植二烯、二氫獼猴桃內(nèi)酯、2，6-二叔丁基苯酚、4，7，9-巨豆三烯-3-酮、2，3’-聯(lián)吡啶、（2E，6E，11Z）-3，7，13-三甲基-10-（2-丙基）-2，6，11-環(huán)十四碳三烯-1，13-二醇、硬脂酸甲酯、反式-5-甲基-3-（甲基乙烯基）環(huán)己烯、α-芹子烯和β-大馬士酮的含量較高；T2處理苯甲醇、4-羥基-β-二氫大馬酮、2-丁-2-烯基-1，3，5-三甲基苯、煙堿、桑貝醇、苯乙醛、2-甲氧基-4-乙烯苯酚、糠醛和棕櫚酸含量較高；T3處理螺巖蘭草酮、糠醇、β-紫羅蘭酮、法尼基丙酮、棕櫚酸甲酯和卡泊三烯含量最高。

將圖1中40種致香化合物進(jìn)行了聚類，大體可以分為芳香族氨基酸降解產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、萜類化合物、煙堿降解產(chǎn)物、脂肪酸降解產(chǎn)物、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和其他化合物7類，各類物質(zhì)的含量如表4所示。從表4可以看出，隨著醇化時(shí)間的增加，各微生物酶制劑處理煙葉中芳香族氨基酸降解產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的含量總體呈增加趨勢(shì)，這對(duì)于煙葉香氣質(zhì)量有著非常明顯的正向作用［14］；各微生物酶制劑處理萜類化合物和其他化合物的含量隨醇化時(shí)間的增加而略有降低。醇化90 d后，除了萜類化合物外，微生物酶制劑處理煙葉各類致香物質(zhì)的含量都高于CK；T1處理的芳香族氨基酸降解產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、萜類化合物含量比CK分別增加了80.70%、127.38%和4.70%；T2處理的煙堿降解產(chǎn)物、其他化合物、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量比CK分別增加了55.35%、31.08%和648.48%。

2.4 微生物酶制劑對(duì)煙葉感官質(zhì)量的影響

因?yàn)榇蓟瘯r(shí)間短，各處理煙葉感官質(zhì)量差距不大。因此，對(duì)醇化6個(gè)月后的樣品進(jìn)行了感官評(píng)吸，評(píng)價(jià)不同濃度微生物酶制劑對(duì)煙葉感官質(zhì)量的影響。從表5可以看出，與CK相比，微生物酶制劑處理煙葉香氣質(zhì)顯著改善，香氣量、濃度、勁頭分值變化不大，雜氣、刺激性評(píng)分有所增加，感官質(zhì)量總分均有所提高。T1、T2、T3處理的煙葉感官評(píng)價(jià)總分較CK分別增加3.4、2.2和5.3分?？傮w來看，經(jīng)2.0%微生物酶制劑處理的煙葉感官評(píng)價(jià)總分最高，表現(xiàn)為香氣質(zhì)改善，香氣量充足，雜氣和刺激性適中，余味舒適。

注：AADV.芳香族氨基酸降解產(chǎn)物；Alkaloids.煙堿降解產(chǎn)物；CDV.類胡蘿卜素降解產(chǎn)物； FADV.脂肪酸降解產(chǎn)物；MRs.美拉德反應(yīng)產(chǎn)物；VT.萜類化合物；Others.其他化合物。

Note：AADV.Aromatic amino acid degradation products；Alkaloids.Nicotine degradation products；CDV.Carotenoid degradation products； FADV.Fatty acid degradation products；MRs.Maillard reaction products；VT.Terpenoids；Others.Other compounds.

3 討論與結(jié)論

微生物酶制劑處理導(dǎo)致煙絲內(nèi)含物質(zhì)含量存在差異，進(jìn)而影響煙絲發(fā)酵的最終品質(zhì)。邵燈寅等［7］研究表明黑曲霉和酒糟發(fā)酵可以降低上部低次煙葉的總氮和總植物堿含量，但該研究結(jié)論與其相反。這可能與微生物酶制劑本身含氮，煙葉氮代謝、煙堿代謝相關(guān)酶活性增加及干基質(zhì)量減少等因素有關(guān)［15］。隨著醇化時(shí)間的增加，煙堿降解加劇，導(dǎo)致煙葉中煙堿和總氮的含量降低。煙葉鉀含量增加可能與噴施微生物酶制劑后干物質(zhì)總量損失有關(guān)，而氯含量降低則與微生物酶制劑中生物酶的降解作用相關(guān)。

糖是煙草中重要的一類化學(xué)成分，其對(duì)煙氣平衡起著重要作用。該試驗(yàn)中微生物酶制劑的施用提高了煙葉還原糖和水溶性糖含量，微生物酶制劑濃度與還原糖含量、水溶性糖含量均呈極顯著正相關(guān)。這可能是煙葉醇化過程中外源添加的微生物酶制劑使淀粉水解酶的含量增加，提高了其活性，使淀粉更多地轉(zhuǎn)化為還原糖［16］。另外，由于發(fā)酵過程中溫濕度的作用，水溶性糖被氧化成水和二氧化碳而散失［17］，因此兩糖差降低。隨著醇化時(shí)間的延長，酶作用加劇致使煙葉中煙堿和水溶性糖含量都有所下降。

煙葉醇化過程中品質(zhì)變化的主要原因是煙葉中化合物的分解和轉(zhuǎn)化。微生物酶制劑代謝可以增加致香化合物生成、轉(zhuǎn)化與積累的效率和速度［18］。該研究發(fā)現(xiàn)低濃度的微生物酶制劑處理醇化30 d時(shí)煙葉揮發(fā)性香氣成分含量增加，尤其是芳香族氨基酸降解產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和萜類化合物，而中高濃度微生物酶制劑明顯提高了煙葉中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和煙堿降解產(chǎn)物的含量，這與潘勇等［19］、帥瑤等［20］的研究結(jié)果相一致。該試驗(yàn)的感官質(zhì)量結(jié)果也表明微生物酶制劑可以通過調(diào)節(jié)煙氣的刺激性和雜氣、增加余味來改善上部低次煙葉的品質(zhì)。

將BioApex微生物酶制劑應(yīng)用于紅花大金元上部初烤煙葉的醇化，增加了煙葉中水溶性糖、煙堿和鉀等化學(xué)成分及致香物質(zhì)的含量，明顯改善了感官評(píng)吸質(zhì)量。該研究結(jié)果可為微生物和酶學(xué)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于煙葉醇化提供新的思路，也可為微生物酶制劑發(fā)酵工藝在工業(yè)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。目前，該微生物酶制劑影響煙葉發(fā)酵的機(jī)理還尚不明確，需要進(jìn)一步研究。

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