麥類殼多胞斑點病菌的快速檢測方法研究

摘要 利用麥類殼多胞斑點病菌β-tubulin一段保守基因序列，設計特異性引物進行麥類殼多胞斑點病菌的檢測，并進行特異性與靈敏度驗證。結果顯示，該方法特異性強，靈敏度可達5 pg/μL，適合于麥類殼多胞斑點病菌的快速檢測。

關鍵詞 β-tubulin基因；麥類殼多胞斑點病菌；特異性；靈敏度

中圖分類號 S41 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）18-0118-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.18.025

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Rapid Identification Method of Parastagonospora pseudonodorum

LI Jin-qing1，2，WANG Ying-chao1，3，SHAO Xiu-ling1 et al

（1.Technical Center of Qingdao Customs，Qingdao，Shandong 266109；2.Technical Center of Yantai Customs，Yantai，Shandong 264000;3.Linyi Vocational University of Science and Technology，Linyi，Shandong 276000）

Abstract This study utilized partly conserved gene sequence of β-tubulin in Parastagonospora pseudonodorum，designed specific primers for the detection of Parastagonospora pseudonodorum，with specificity and sensitivity verified.The results showed that this method had strong specificity and a sensitivity of up to 5 pg/μL and suitable for rapid detection of Parastagonospora pseudonodorum.

Key words β-tubulin gene;Parastagonospora pseudonodorum;Specificity;Sensitivity

基金項目 國家重點研發(fā)計劃（2021YFD1400100，2021YFD1400103）；青島海關科研項目（QK202053，QK202016）。

作者簡介 李金慶（1982—），男，山東安丘人，高級農藝師，碩士，從事植物檢疫研究。*通信作者，研究員，從事植物檢疫研究。

收稿日期 2023-10-20；修回日期 2023-11-20

麥類殼多胞斑點病菌可為害小麥、大麥等禾本科植物，引起小麥等作物的斑點病，生長后期可引起壞死癥狀，導致小麥等嚴重減產［1-3］。病菌主要危害葉片和葉鞘上部，葉斑橢圓形，常聚結，稻草色或淺黃色，中央部分有球果狀分生孢子器，通常為灰色到黑色［4］。麥類殼多胞斑點病菌現已逐漸成為世界性病害，已在非洲［1］、美洲［1-3］、亞洲［1，5］、歐洲［6-8］、大洋洲［1］有分布，并被列入我國進境植物檢疫性有害生物名錄，是一種重要的檢疫性菌物。近年來由于菌物分類研究的快速發(fā)展，許多檢疫性菌物的分類地位已經發(fā)生變化［9］，麥類殼多胞斑點病菌的學名Stagonospora avenae Bissett f. sp. triticea T. Johnson已更新為Parastagonospora pseudonodorum B. A. McDonald，P. C. Brunner，Croll，D. Pereira & Crous ［10-11］。目前麥類殼多胞斑點病菌還未有分子檢測等方面的研究。

隨著分子生物學發(fā)展，β-微管蛋白基因（β-tubulin）、Histone H3、核糖體DNA內轉錄間隔區(qū)（ITS）序列、EF-1α和nadh1等被廣泛應用在菌株間的親緣關系和病原菌的分子鑒定。由于麥類殼多胞斑點病菌與近似種之間的ITS序列同源性較高，較難通過ITS序列將麥類殼多胞斑點病菌與近似種區(qū)分［12］，因此有必要選擇其他的基因片段進行麥類殼多胞斑點病菌的檢測。微管是細胞骨架、紡錘體等的主要組分，微管蛋白是微管的組成單位，由α-tubulin蛋白和β-tubulin蛋白組成，其中β-tubulin蛋白由β-tubulin基因所編碼［13］，可影響菌絲生長及形態(tài)、孢子形成和附著胞分化等［14］。由于β-tubulin基因既有保守的外顯子又有許多內含子，廣泛用于物種鑒定和真菌各級分類水平上的系統(tǒng)發(fā)育研究［15-19］。曹繼芬等［20］以β-tubulin基因為靶標設計了特異性引物Tbas-tub2F/Tbas-tubR用于根黑腐病菌的PCR 檢測，對其檢測特異性、靈敏度、早期診斷技術進行了測試，該引物對根黑腐病菌基因組DNA 檢測的靈敏度為10 fg/μL，可從接種侵染24 h后的煙草組織中檢測到根黑腐病菌，從而對根黑腐病進行準確的早期診斷。彭軍等［21］研究利用β-tubulin保守序列建立一種 PCR檢測方法用于從感病組織及根際土壤中檢測香蕉枯萎菌，可以從海南、廣東分離的18個菌株中擴增到單一明顯的497 bp條帶，并在此基礎上建立了巢式PCR，提高了檢測靈敏度。目前還未有利用β-tubulin基因用于麥類殼多胞斑點病菌檢測方法的研究。

筆者在麥類殼多胞斑點病菌新的分類進展的基礎上，基于β-tubulin基因探索開發(fā)麥類殼多胞斑點病菌的特異性檢測方法，填補該病菌沒有特異性檢測方法的空缺，以期為口岸檢疫鑒定提供快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

麥類殼多胞斑點病菌（Parastagonospora pseudonodorum）（寧波海關技術中心贈送）；6種進境大麥中經常截獲的病菌［22］：侵染鏈格孢菌（Alternaria infectoria）、互隔鏈格孢菌（Alternaria alternata）、大麥網斑病菌（Pyrenophora teres）、麥根腐平臍孺孢菌（Bipolaris sorokiniana）、梨孢鐮刀菌（Fusarium poae）、大麥黑變病菌（Cladosporium herbarum）；3種小麥上發(fā)生的病菌：小麥基腐病菌（Oculimacula yallundae）、小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces graminis var.tritici）、假禾谷鐮刀菌（Fusarium pseudograminearum）。

1.2 DNA提取

利用天根生化科技（北京）有限公司生產的高效植物基因組DNA提取試劑盒（DP350-02）刮取在PDA平板上生長的病原菌菌絲進行DNA提取。提取完成后測定其濃度與純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計與合成

根據麥類殼多胞斑點病菌一段β-tubulin基因保守序列，用NCBI的Primer-Blast功能模塊設計Parastagonospora pseudonodorum的特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Psp-tub-F：5′- TGGTCCAAATTGCACAACGC-3′，Psp-tub-R：5′- GGGTGATCTGGAAACCCTGG-3′。

1.4 引物特異性驗證

以麥類殼多胞斑點病菌、侵染鏈格孢菌、互隔鏈格孢菌、大麥網斑病菌、麥根腐平臍孺孢菌、梨孢鐮刀菌、大麥黑變病菌、小麥基腐病菌、小麥全蝕病菌、假禾谷鐮刀菌的基因組DNA及ddH2O為模板，分別用特異性引物Psp-tub-F、Psp-tub-R進行常規(guī)PCR反應。

PCR擴增采用25 μL PCR反應體系：Premix Mix 12.5 μL、引物Psp-tub-F／Psp-tub-R各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，加入ddH2O補齊至25 μL。將反應體系混合均勻后置于普通PCR儀中進行反應。

PCR反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)35次；72 ℃ 5 min。

1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測普通PCR產物，進行引物特異性驗證。

1.5 引物靈敏度驗證

以麥類殼多胞斑點病菌DNA模板（50 ng/μL）做10倍濃度梯度稀釋，共8個稀釋度，將DNA原液及稀釋液作為模板，依照方法“1.4”中設計的反應體系和反應條件來檢測麥類殼多胞斑點病菌PCR反應的靈敏度。

2 結果與分析

2.1 特異性驗證檢測結果

特異性驗證結果表明，建立的麥類殼多胞斑點病菌PCR檢測方法具有高度的特異性，只有麥類殼多胞斑點病菌DNA模板的反應中出現片段大小為291 bp的特異性條帶，而其他9種病菌及ddH2O均未出現特異性條帶（圖1）。

注：M.DL 2000 DNA Marker。a.麥類殼多胞斑點病菌; b.侵染鏈格孢菌; c.互隔鏈格孢菌; d.大麥網斑病菌; e.麥根腐平臍孺孢菌; f.梨孢鐮刀菌; g.大麥黑變病菌; h.小麥基腐病菌; i.小麥全蝕病菌; j.假禾谷鐮刀菌;k.ddH2O。

Note：M.DL 2000 DNA Marker.a. Parastagonospora pseudonodorum;b.Alternaria infectoria;c.Alternaria alternata;d.Pyrenophora teres;e.Bipolaris sorokiniana;f.Fusarium poae;g.Cladosporium herbarum;h.Oculimacula yallundae;i.Gaeumannomyces graminis var.tritici;j.Fusarium pseudograminearum;k.ddH2O.

2.2 靈敏度驗證檢測結果

靈敏度驗證結果表明，模板DNA原液及10-1、10-2、10-3、10-4稀釋度均出現特異性條帶，而10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度均未出現特異性條帶。由此可見，10-4稀釋度是該試驗的檢測下限。換算后可知，麥類殼多胞斑點病菌PCR試驗的靈敏度可達5 pg/μL（圖2）。

注：M.DL 2000 DNA Marker；a.DNA原液；b.10-1；c.10-2；d.10-3；e.10-4；f.10-5；g.10-6；h.10-7；i.10-8。

3 討論

麥類殼多胞斑點病菌是我國進境植物檢疫性有害生物名錄中的一種檢疫性真菌病害，檢疫意義重大。為保護我國糧食產業(yè)不受麥類殼多胞斑點病菌入侵和危害，保護農業(yè)生態(tài)，促進對外貿易的正常開展，需要加強對麥類殼多胞斑點病菌的檢疫，嚴防其傳入國內。我國已于2014年頒布了麥類殼多胞斑點病菌的鑒定標準（SN/T 3892—2014），該標準是建立在形態(tài)學、生物學等基礎上的常規(guī)鑒定手段，為提高貨物檢疫的準確性和通關放行速度，建立一套快速、完整、準確的分子特異性檢測方法迫在眉睫。

目前，麥類殼多胞斑點病菌主要集中在形態(tài)、防治方面的研究，而分子鑒定方面的研究較少［11］。該研究基于麥類殼多胞斑點病菌（Parastagonospora pseudonodorum）的β-tubulin基因，建立了一套快速、靈敏、高效的PCR分子檢測方法。該研究根據GenBank中得到的麥類殼多胞斑點病菌與其近似種的β-tubulin基因序列，用NCBI的Primer-Blast功能模塊設計Parastagonospora pseudonodorum的特異性引物Psp-tub-F和Psp-tub-R，PCR反應中只有麥類殼多胞斑點病菌DNA模板的反應出現片段大小291 bp的特異性條帶，而其近似種及陰性對照均未出現特異性條帶，表明該對引物特異性強，可有效從進口糧食中鑒定出麥類殼多胞斑點病菌。該方法靈敏度較高，檢測靈敏度可達5 pg/μL。該研究填補了麥類殼多胞斑點病菌鑒定沒有特異性檢測方法的空缺，首次將β-tubulin基因序列分析應用于麥類殼多胞斑點病菌的鑒定中，為麥類殼多胞斑點病菌的鑒定開拓了途徑。該研究結果可為麥類殼多胞斑點病菌標準的修訂提供參考，為海關一線執(zhí)法提供數據支持。

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