山豆根ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

摘要 以山豆根為試驗(yàn)材料，采用正交試驗(yàn)考察DNA、引物、Mg2+、dNTPs、Taq酶5個(gè)因素對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響，建立并優(yōu)化山豆根ISSR-PCR反應(yīng)體系條件。結(jié)果表明：山豆根ISSR-PCR反應(yīng)體系（20 μL）最優(yōu)條件為Mg2+濃度3 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq酶1 U，引物0.5 μmol/L，模板DNA 100 ng，運(yùn)用該體系從100條UBC引物中篩選到10條清晰、多態(tài)性好的引物。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可有效建立山豆根ISSR-PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系，為山豆根的親緣關(guān)系，種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)及品種鑒定和系統(tǒng)分類等研究提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 山豆根；ISSR-PCR體系優(yōu)化；正交試驗(yàn)；引物篩選

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2024）18-0078-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.18.017

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of ISSR-PCR Reaction System and Primer Selection of Sophora tonkinensis Gagnep

LI Jin-mei1，GUAN Miao-juan1，HUANG Ding1，2 et al

（1.College of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530200; 2.Key Laboratory of Resources Protection and Utilization of Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530200）

Abstract Taking Sophora tonkinensis as materaial， orthogonal experiments were used to investigate the effects of DNA， primers， Mg2+， dNTPs， and Taq enzymes on the ISSR-PCR reaction system， and the conditions of ISSR-PCR reaction system of Sophora tonkinensis were established and optimized. The results showed that the optimal conditions for the ISSR-PCR reaction system （20 μL） of Sophora tonkinensis including 3 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTPs， 1 U Taq enzyme， 0.5 μmol/L primer， 100 ng template DNA. Ten primers with good polymorphism were selected from 100 UBC primers by this system. The optimal system of ISSR-PCR reaction can be effectively established by orthogonal experiment design， which provides a scientific basis for the research of genetic relationship， genetic diversity evaluation of germplasm resources， variety identification and systematic classification of Sophora tonkinensis.

Key words Sophora tonkinensis Gagnep;ISSR-PCR system optimization;Orthogonal test design;Primer screening

基金項(xiàng)目 廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)一流學(xué)科項(xiàng)目（2019XK093）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)青年創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2018QT001）。

作者簡(jiǎn)介 李金梅（1998—），女，廣西靈山人，碩士研究生，研究方向：中藥資源學(xué)。*通信作者，教授，博士，從事中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究。

收稿日期 2023-10-07

山豆根（Sophora tonkinensis Gagnep）為豆科越南槐屬植物，常以干燥根和根莖入藥，主要分布在我國(guó)廣西、貴州、云南等地［1］。其化學(xué)成分主要為生物堿、黃酮和三萜類化合物等［2］，具有抗癌、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗心律失常等藥理作用［3-6］。

分子標(biāo)記技術(shù)ISSR （inter-simple sequence repeat）又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增，由1994年加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz等［7］提出。ISSR因其具有無需預(yù)先基因組序列信息、快速、穩(wěn)定、多態(tài)性豐富、重復(fù)性強(qiáng)及成本低等優(yōu)點(diǎn)［8］，廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源收集和鑒定、遺傳多樣性和親緣關(guān)系、優(yōu)異基因的發(fā)掘和定位等方面。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)藥用植物山豆根的分子鑒定研究多采用DNA條形碼技術(shù)，而有關(guān)ISSR分子技術(shù)研究較少。筆者以山豆根為試驗(yàn)材料，采用正交試驗(yàn)結(jié)合ISSR的方法，優(yōu)化Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物和模板DNA等影響因素，建立山豆根最佳反應(yīng)體系，旨在為植物山豆根親緣關(guān)系、種質(zhì)資源、遺傳多樣性等研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為山豆根的新鮮幼嫩葉，采自廣西中醫(yī)藥大學(xué)仙葫藥圃，樣品由廣西中醫(yī)藥大學(xué)李良波研究員鑒定為山豆根。摘取山豆根新鮮幼嫩葉，用蒸餾水沖洗葉片，75%乙醇擦拭表面，晾干至-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 改良CTAB法提取基因組DNA。

采用改良CTAB法提取山豆根嫩葉組織DNA，取2 μL基因組總DNA溶液與1 μL loading Buffer 混合，點(diǎn)樣于0.7%瓊脂糖凝膠上樣孔，在1×TAE緩沖液中電壓120 V電泳40 min。電泳結(jié)束采用Gel Red 染料凝膠泡染，凝膠成像，觀察記錄并分析其基因組完整性，取1 μL基因組總DNA溶液，使用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，并置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

以山豆根基因組DNA為模板，采用UBC835引物為固定引物，以L16（45）開展正交試驗(yàn)（表1、表2），對(duì)4水平5因素（模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs、Taq 酶）配比進(jìn)行體系優(yōu)化。選用該引物TM梯度條帶多態(tài)性、完整性較好的最佳溫度，根據(jù)反應(yīng)程序至PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中含2 μL 10×Buffer，其余不足由滅菌水補(bǔ)足。每處理重復(fù)3次。

1.2.3 ISSR-PCR擴(kuò)增。

建立ISSR-PCR反應(yīng)體系體積為20 μL，其中Taq酶1 U，模板50 ng，引物0.3 μmol/L，Mg2+ 2 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，10×Buffer 2 μL，其余由滅菌水補(bǔ)足。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性 30 s，50 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，循環(huán)30次，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

取擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL，與1 μL loading Buffer 混合，點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠上樣孔中，在1×TAE緩沖液中電壓120 V 電泳40 min，結(jié)束后使用Gel Red 染料泡染，凝膠成像系統(tǒng)成像，觀察記錄并分析各組條帶。

1.2.4 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理。

參照何正文等［9］方法，以條帶清晰、多態(tài)性好為指標(biāo)，對(duì)各組條帶進(jìn)行打分，多態(tài)性好且清晰記16分，反之則記1分。3次重復(fù)試驗(yàn)評(píng)分?jǐn)?shù)值采用SPSS 19軟件進(jìn)行直觀分析、方差分析、多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 山豆根總基因組DNA

豆科植物山豆根總基因組DNA電泳、紫外檢測(cè)結(jié)果見表3、圖1，結(jié)果表明，該植物DNA的條

帶清晰明亮，有少量RNA污染；DNA的OD260/280的數(shù)值均在1.8～2.0，OD260/230的比值在1.9～2.1。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由于模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs、Taq酶5個(gè)影響因素各水平的配比不同，擴(kuò)增結(jié)果存在差異（圖2）。根據(jù)電泳結(jié)果對(duì)每組條帶評(píng)分，評(píng)分結(jié)果見表4。根據(jù)評(píng)分結(jié)果進(jìn)行直觀分析、方差分析和多重比較。

2.2.1 正交試驗(yàn)直觀分析。

正交試驗(yàn)3次重復(fù)處理的平均值能夠反映各因素對(duì)反應(yīng)體系的影響情況，根據(jù)3種藥用植物各重復(fù)處理評(píng)分結(jié)果進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見表5。①極差R大小表明各因素對(duì)反應(yīng)體系的影響程度，山豆根各因素對(duì)反應(yīng)體系的影響因素從大到小表現(xiàn)為Mg2+>模板DNA> dNTPs >Taq酶>引物；②同一因素均值最大所對(duì)應(yīng)的水平為該因素最佳水平，山豆根的最佳水平為Mg2+水平4、dNTPs水平2、Taq酶水平2、引物水平4、模板DNA水平4。

2.2.2 正交試驗(yàn)方差分析。

為了進(jìn)一步判斷各因素對(duì)山豆根ISSR-PCR體系的影響程度，對(duì)正交試驗(yàn)評(píng)分結(jié)果進(jìn)行方差分析。比較各因素F值，F(xiàn)值越大、表示該因素影響程度越大。

由表6可知，在山豆根ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響程度表現(xiàn)為Mg2+>模板DNA>Taq酶>dNTPs>引物，其中Mg2+和模板DNA具有顯著性（P<0.05），P值分別為0.010、0.038。

根據(jù)方差分析F值比較各因素對(duì)山豆根ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響程度，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與直觀分析結(jié)果不一致，但其最大的影響因素一致。正交試驗(yàn)中的極差分析法僅具有方便直觀的特點(diǎn)，未經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，而方差分析經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)更加準(zhǔn)確。

2.2.3 正交試驗(yàn)Duncan多重比較。

為進(jìn)一步確定山豆根ISSR-PCR反應(yīng)體系中各因素的最佳水平，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果對(duì)各因素進(jìn)行Duncan多重比較分析，對(duì)同一因素4個(gè)水平的均值進(jìn)行比較，判斷4個(gè)水平的差異顯著性。根據(jù)山豆根Duncan多重比較結(jié)果（表7）得知，Mg2+水平4均值最高，與水平1有顯著差異，因此選擇水平4為最佳水平，即3.0 mmol/L。dNTPs 水平2均值最高，與水平1、水平3差異不顯著，與水平4差異顯著，而水平4與水平1、水平3差異不顯著，因此選擇水平2為最佳水平，即0.2 mmol/L。在Taq 酶和引物因素中，4個(gè)水平無顯著差異，綜合考慮選擇均值最高的Taq酶水平2和引物水平4為最佳水平，分別為1.0 U和0.5 μmol/L。模板DNA因素中，水平4均值最高，與水平1、水平3有顯著差異，與水平2無顯著差異，因此選擇水平4為最佳水平，即100 ng。

綜上所述，根據(jù)方差分析和多重比較分析，確定山豆根的ISSR-PCR反應(yīng)體系的最優(yōu)條件：Mg2+ 3.0 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq酶1.0 U，引物0.5 μmol/L，模板DNA 100 ng。

2.2.4 退火溫度的確定。

研究發(fā)現(xiàn)，退火溫度會(huì)直接影響引物與模板DNA的特異性結(jié)合。采用不同的退火溫度，擴(kuò)增結(jié)果具有明顯的差異性。因此，對(duì)引物最佳退火溫度的確定是有必要的。選用UBC835引物，進(jìn)行退火溫度梯度研究。8個(gè)梯度退火溫度分別為55.0、54.2、52.9、51.2、48.9、46.9、45.7、45.0 ℃。以條帶清晰度、數(shù)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，由圖3可見泳道3條帶較清晰、數(shù)量較多，因此山豆根最佳退火溫度可確定為52.9 ℃。

2.2.5 ISSR引物的篩選與驗(yàn)證。

對(duì)山豆根最佳反應(yīng)體系進(jìn)行100條UBC引物篩選。部分引物篩選結(jié)果見圖4和表8，結(jié)果表明山豆根的最佳反應(yīng)體系均具有較高的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

3 討論

DNA質(zhì)量的好壞對(duì)進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)體系研究有一定影響，DNA雜質(zhì)過多會(huì)導(dǎo)致后續(xù)DNA發(fā)生降解，從而影響ISSR-PCR體系的擴(kuò)增效果［10-11］。在對(duì)植物DNA提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同的采集時(shí)期，植物葉片中多糖、多酚、蛋白質(zhì)等代謝產(chǎn)物含量不同，而新鮮嫩葉代謝產(chǎn)物含量較低且DNA含量高，而使用改良的CTAB方法對(duì)山豆根新鮮嫩葉進(jìn)行提取，可以有效降低DNA雜質(zhì)，提供DNA質(zhì)量。退火溫度較低或較高都會(huì)影響ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量，采用不同的退火溫度，擴(kuò)增結(jié)果具有明顯差異［12］，因此在體系優(yōu)化中引物退火溫度的篩選是有必要的。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)因具有方便、節(jié)約時(shí)間、反應(yīng)靈敏及條件穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在植物遺傳多樣性等研究分析中被廣泛應(yīng)用［13］。但I(xiàn)SSR-PCR穩(wěn)定擴(kuò)增易受體系內(nèi)各因素水平的影響［14］，因此在利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)山豆根親緣關(guān)系、遺傳多樣性等分析之前，需要對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。目前正交試驗(yàn)法已成為優(yōu)化ISSR-PCR反應(yīng)體系試驗(yàn)的主流方法，其綜合考慮了各影響因素的交互作用［15］，并在廣西莪術(shù)［16］、夜來香［17］、通脫木［10］等植物中建立了ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系。該試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，可快速確定最優(yōu)水平，但設(shè)計(jì)中未考慮到各因素間的相互作用，降低了最佳水平的可靠程度［18］。在正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理上，采用直觀分析法、方差分析法和多重比較分析法，不同方法分析得到的結(jié)果有所不同。這可能與PCR反應(yīng)的不穩(wěn)定性有關(guān)，也可能是由于試驗(yàn)結(jié)果采用主觀打分，人為主觀意識(shí)重、隨意性大，在一定程度上導(dǎo)致試驗(yàn)的誤差［19-20］。

該試驗(yàn)采用5因素4水平L16（45）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)山豆根進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化，通過對(duì)5個(gè)因素進(jìn)行直觀分析、方差分析和多重比較，確定其反應(yīng)體系的最優(yōu)條件。即山豆根ISSR-PCR反應(yīng)體系（20 μL）的最優(yōu)條件為Mg2+ 3.0 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq酶1.0 U，引物0.5 μmol/L，模板DNA 100 ng。選用UBC835引物進(jìn)行退火溫度篩選，并確定山豆根的最佳退火溫度為52.9 ℃。該體系的建立將為山豆根進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)開展相關(guān)研究奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

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