文冠果組織培養(yǎng)再生體系的建立

摘 要：【目的】建立文冠果體細(xì)胞胚胎發(fā)生及再生植株體系，所建立的高效再生體系可為培育文冠果優(yōu)良株系以及文冠果的遺傳轉(zhuǎn)化的基因工程奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳晕墓诠g胚、中期胚、成熟胚為外植體，設(shè)計(jì)不同濃度生長素、細(xì)胞分裂素的正交實(shí)驗(yàn)，通過正交實(shí)驗(yàn)，確定文冠果外植體、激素濃度配比對提高愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，確定文冠果愈傷組織誘導(dǎo)增殖、不定芽分化、伸長和生根培養(yǎng)最適基本培養(yǎng)基及其中各激素的濃度配比，建立文冠果組織培養(yǎng)再生體系?！窘Y(jié)果】在1 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA 的激素配比中，誘導(dǎo)出嫩綠色的、結(jié)構(gòu)致密的愈傷組織，誘導(dǎo)率為80.46%，誘導(dǎo)愈傷組織形成的最佳品種為‘WF15’的中期胚；在1 mg/L6-BA 和0.3 mg/L IBA 的激素配比中，大量的愈傷組織出現(xiàn)嫩綠色的芽點(diǎn)，部分產(chǎn)生叢生芽，不定芽最高誘導(dǎo)率為75%；在1.0 mg/L TDZ 和0.2 mg/L IAA 的激素配比中，能促進(jìn)分化出的不定芽繼續(xù)良好生長，繼代30 d，每個(gè)不定芽可分化3 ～ 4 個(gè)枝條，枝條高度可達(dá)5 cm，最佳品種是‘WF19’；0.3 mg/L IBA 誘導(dǎo)生根率最高，最高為88.35%，生成的根長約9 cm；開瓶時(shí)間為36 h 時(shí)，幼苗生長良好，移栽成活率為73.33%，顯著高于其他開瓶時(shí)間【結(jié)論】誘導(dǎo)愈傷組織形成的最佳培養(yǎng)基為：MS+1 mg/L 6-BA+0.5 CmxnNWIoSYLetC0tY5BaSxTMmWPfvxOizjTIOBoxh7w=mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂；誘導(dǎo)不定芽形成的最佳培養(yǎng)基為：WPM+1 mg/L 6-BA+0.3 mg/LIBA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂；誘導(dǎo)不定芽增殖分化的培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg/L TDZ+0.2 mg/L IAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂；誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為：1/2MS+0.3 mg/L IBA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂。

關(guān)鍵詞：文冠果；外植體；組織培養(yǎng) ；再生體系

中圖分類號：S668 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1003—8981（2024）02—0158—09

文冠果Xanthoceras sorbifolium Bunge， 無患子科文冠果屬植物，單屬單種。文冠果屬落葉灌木或小喬木，耐干旱、貧瘠，抗風(fēng)沙[1]，具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，是中國特有多用途的木本油料樹種[2]，其種子含油率高[3]，籽油既可作生物柴油，又可作為食用油[4]。但是，文冠果屬異花授粉植物，后代性狀分離現(xiàn)象嚴(yán)重，在文冠果發(fā)展過程中，因?yàn)榇嬖谥狈α挤N、坐果率低、扦插不易生根等問題[5]，導(dǎo)致利用常規(guī)育種手段大量培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、性狀穩(wěn)定的文冠果株系困難大，因此，急需建立高效穩(wěn)定的文冠果再生體系。

植物組織器官培養(yǎng)是指在無菌的條件下，通過選取植物的器官或分生組織作為外植體，將其在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直接獲得組培苗的方法。文冠果的生殖器官（種子）和營養(yǎng)器官（根、莖和葉）均可以作為誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生的外植體。目前，基于文冠果種胚為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究已經(jīng)具有一定成果，顧玉紅等[6] 已經(jīng)將文冠果種胚接種在初代培養(yǎng)基上，成功獲得愈傷組織。柳金鳳等[7] 在文冠果細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)研究中發(fā)現(xiàn)NAA 對文冠果愈傷組織萌芽培養(yǎng)有較大的促進(jìn)作用。臧國忠利用文冠果種子子葉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在MS 固體培養(yǎng)基上可大量產(chǎn)生胚性愈傷組織[8]，李晶等[9] 通過對3 個(gè)發(fā)育期果實(shí)的種胚在愈傷組織誘導(dǎo)方面能力的比較和分析發(fā)現(xiàn)，果實(shí)發(fā)育中期的種胚對誘導(dǎo)愈傷組織的效果最佳，但對進(jìn)一步繼代生根的研究還不是很充足[10-13]。上述研究表明，以種胚為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)具有較高的可行性，然而不定芽繼代以及組織培養(yǎng)過程中生根移栽的問題仍然沒有解決，文冠果誘導(dǎo)、萌發(fā)、增殖和轉(zhuǎn)化成苗的效率低是目前存在的最大問題。因此，仍有必要繼續(xù)優(yōu)化文冠果的組培快繁體系。

本研究以文冠果幼齡胚、中期胚、成熟胚為外植體，探究文冠果不同外植體、不同激素濃度配比對文冠果愈傷組織誘導(dǎo)增殖、不定芽分化、伸長和生根培養(yǎng)的影響，以建立簡單高效的文冠果體細(xì)胞胚發(fā)生及再生植株體系，所建立的高效再生體系可為培育文冠果優(yōu)良株系以及文冠果的工廠育苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料來源

試驗(yàn)材料為文冠果種子不同發(fā)育時(shí)期的種胚，均于2021 年6—7 月取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)試驗(yàn)站（36°10′19.2″N，117°09′01.3″E），選擇長勢良好，無病蟲害的優(yōu)良株系‘WF15’‘WF19’‘46321’作為母樹，取生長狀況良好的幼齡胚、中期胚和成熟胚作為外植體。采果分3 個(gè)時(shí)期進(jìn)行：6 月初為幼果期，果實(shí)大小接近成熟時(shí)的50%，種皮是白色柔軟的，內(nèi)溶物呈無色透明稠密液，結(jié)構(gòu)分化還不明顯；7 月初為中期，果實(shí)大小已接近成熟時(shí)的80％，種皮白色、較柔軟，種胚淡黃綠色子葉和胚軸已發(fā)育完全；7 月中為果實(shí)成熟期，果皮綠色較硬，種皮也變?yōu)樽睾谏?、很硬?/p>

1.1.2 材料處理

將采集到的文冠果種子用洗滌劑水漂洗，再用自來水沖洗干凈。把清洗過的種子放入60 ℃的自來水中浸泡3 ～ 4 h。在超凈工作臺上，先用75% 的乙醇消毒2 min，無菌水沖洗3 次，每次2 ～3 min，再用50% 的次氯酸鈉溶液浸泡20 min，無菌水沖洗3 次，每次2 ～ 3 min。在超凈工作臺上剝?nèi)シN皮，取出種胚。在無菌條件下，用75% 的酒精浸泡種胚30 s，無菌水沖洗3 次，每次2 ～ 3 min。用無菌濾紙吸干表面水分備用。