灰氈毛忍冬ERF 基因家族鑒定及其在衰老過(guò)程中的表達(dá)分析

摘 要：【目的】灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides 為我國(guó)南方地區(qū)大宗道地中藥材和重要經(jīng)濟(jì)植物，綠原酸和木犀草苷等藥效物質(zhì)在器官衰老過(guò)程中積累且受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)ERF 基因家族廣泛參與植物的衰老、脅迫響應(yīng)和次生代謝。鑒定灰氈毛忍冬ERF 家族成員并探究其表達(dá)模式，可為該類(lèi)基因調(diào)控次生代謝的功能研究提供參考。【方法】基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定灰氈毛忍冬ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析其進(jìn)化關(guān)系，利用MEME 在線網(wǎng)站分析序列的結(jié)構(gòu)基序。QRT-PCR 分析LmERFs 基因在不同器官衰老過(guò)程以及冷脅迫和乙烯處理后的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】在灰氈毛忍冬中共鑒定出65 個(gè)具AP2 保守結(jié)構(gòu)域的LmERFs 基因，可將其分為3 個(gè)亞組。利用RNA-Seq 技術(shù)篩選了在幼嫩和衰老葉片之間差異表達(dá)的20 個(gè)LmERFs。進(jìn)一步qRT-PCR 分析顯示，分別有18 個(gè)、13 個(gè)和11 個(gè)LmERFs 基因在葉片、莖和花的衰老過(guò)程顯著差異表達(dá)，其中LmERF2、LmERF9、LmERF16、LmERF17 和LmERF19 基因表達(dá)在不同器官衰老過(guò)程中均具顯著差異。冷脅迫后，葉和莖中7 個(gè)LmERFs（LmERF1、LmERF2、LmERF6、LmERF7、LmERF8、LmERF11 和LmERF12） 顯著上調(diào)，LmERF3、LmERF9、LmERF16 和LmERF19 顯著下調(diào)；而乙烯處理誘導(dǎo)了LmERF1、LmERF8 和LmERF12基因的表達(dá)，抑制了LmERF2、LmERF4、LmERF9、LmERF10、LmERF14、LmERF15、LmERF16、LmERF17、LmERF18 和LmERF19 基因的表達(dá)?！窘Y(jié)論】8 個(gè)LmERFs（LmERF1、LmERF2、LmERF6、LmERF9、LmERF10、LmERF15、LmERF16 和LmERF19）響應(yīng)了器官發(fā)育、冷脅迫和乙烯誘導(dǎo)的衰老過(guò)程，這為后續(xù)挖掘高效調(diào)控灰氈毛忍冬次生代謝的靶點(diǎn)LmERFs 提供了數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：灰氈毛忍冬；ERF 基因家族；器官衰老；乙烯；冷害脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.79 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003—8981（2024）02—0013—16

灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand-Mazz又名大金銀花，忍冬科忍冬屬植物，為我國(guó)西南地區(qū)大宗道地中藥材和特色經(jīng)濟(jì)植物，其次生代謝產(chǎn)物如綠原酸和木犀草苷等核心藥效成分具有抗病毒、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等多種功能[1]。目前，灰氈毛忍冬已被廣泛應(yīng)用于制藥、保健品及化妝品等行業(yè)，市場(chǎng)巨大[2]。然而，灰氈毛忍冬存在品種混雜、藥效成分含量參差不齊等問(wèn)題，已成為制藥、提取、加工等下游產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，挖掘調(diào)控次生代謝產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵因子是解決這一難題的重要途徑。

研究表明，植物通過(guò)產(chǎn)生次生代謝物響應(yīng)衰老信號(hào)、適應(yīng)環(huán)境壓力[3]。擬南芥葉片衰老過(guò)程中，花青素和吲哚衍生的甲基葡萄糖苷顯著增加；而黃酮醇苷和芥子酸共軛物持續(xù)減少。隨著器官的發(fā)育和衰老，灰氈毛忍冬綠原酸、綠原酸前體及異構(gòu)體等苯丙烷類(lèi)物質(zhì)和木犀草苷等黃酮類(lèi)物質(zhì)含量發(fā)生顯著變化[1，4]。Rezaie 等[5] 發(fā)現(xiàn)，冷脅迫顯著影響了羅勒中苯丙素類(lèi)化合物的含量。糖和次生代謝在柑橘類(lèi)植株響應(yīng)冷脅迫中發(fā)揮著重要作用[6-7]。乙烯可促進(jìn)植物次生代謝物的產(chǎn)生，如長(zhǎng)春花中酚酸、黃酮醇、萜類(lèi)和吲哚類(lèi)生物堿、烏龍茶中兒茶素和甜橙中瓦倫西亞橘烯[8]。由此可知，植物發(fā)育、激素或脅迫信號(hào)顯著影響次生代謝物合成，探究灰氈毛忍冬響應(yīng)衰老和脅迫機(jī)制有助于挖掘次生代謝物合成的關(guān)鍵基因，為利用基因工程手段培育新品種提供理論依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)介導(dǎo)次生代謝物合成參與生物和非生物應(yīng)激反應(yīng)[9]。AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，成員含有1 個(gè)或2 個(gè)由60 ～ 70 個(gè)氨基酸構(gòu)成的AP2 保守結(jié)構(gòu)域，根據(jù)結(jié)構(gòu)域數(shù)量和識(shí)別序列的不同可將其分為AP2、ERF、DREB、RAV 和Soloist5 個(gè)亞家族[10]，廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、初生和次生代謝調(diào)控、生物或非生物脅迫響應(yīng)[11] 以及乙烯等植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑[12-13]。其中ERF（ethylene response factor） 轉(zhuǎn)錄因子亞家族是乙烯信號(hào)通路下游的關(guān)鍵調(diào)控因子[14-15]，只含有一個(gè)AP2 結(jié)構(gòu)域，第14 位和第19 位氨基酸分別是丙氨酸和天冬氨酸，區(qū)別于其他亞家族成員。ERF 亞家族成員可特異性結(jié)合基因啟動(dòng)子區(qū)的GCC-box 元件（AGCCGCC），從而參與調(diào)控乙烯應(yīng)答、生物及非生物脅迫和次生代謝[13，16]。胡俊東等[17] 研究表明，PheERF5 基因參與毛竹抗生物和非生物脅迫過(guò)程；小麥TaERF1基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)高鹽和低溫的耐受性[18]；ERF- Ⅵ亞族成員CRF 具有正向調(diào)節(jié)植物滲透脅迫耐受性和抗凍性作用[18-19]。Lyu 等[20] 發(fā)現(xiàn)樺木中BpERF13 過(guò)表達(dá)可通過(guò)結(jié)合并上調(diào)冷脅迫關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子CBF 的基因表達(dá)來(lái)增強(qiáng)耐寒性。擬南芥ERF 亞族轉(zhuǎn)錄因子ORA59基因受茉莉酸和乙烯的協(xié)同誘導(dǎo)，通過(guò)正向調(diào)控PDF1.2 的表達(dá)增加植物灰霉抗性，在茉莉酸與乙烯信號(hào)的交叉對(duì)話中起了重要的調(diào)控作用[21-22]。煙草中過(guò)表達(dá)NtERF19 可顯著增加生物堿，特別是新煙堿的含量[23]。目前，鮮見(jiàn)忍冬屬藥用植物ERF 轉(zhuǎn)錄因子的研究，在灰氈毛忍冬中尚未見(jiàn)ERF 參與脅迫響應(yīng)的研究報(bào)道。