楊樹水泡型潰瘍病病原菌的分離鑒定及藥劑抑菌分析

摘要采集發(fā)生水泡型潰瘍病的楊樹樹皮病斑，在實驗室內(nèi)進行分離和分子鑒定，確定病原菌種類，并開展了百菌清對該病原菌的抑菌試驗。結(jié)果表明：鑒定病原菌為楊樹水泡型潰瘍病病原菌，有性階段為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea），無性階段為小穴殼菌（Dothiorella gregaria）；百菌清600倍稀釋液對楊樹水泡型潰瘍病抑制率達到90%以上，百菌清對楊樹水泡型潰瘍病有較好的抑制效果。

關鍵詞楊樹；水泡型潰瘍??；序列鑒定；百菌清；抑菌

中圖分類號：S763.11文獻標識碼：Adoi：10.13601/j.issn.1005-5215.2024.05.007

Isolation and Identification of Pathogens of Poplar Vesicular Canker and Analysis of Fungicide Antibacterial

Wang Shitong

（Institute of Forest and Grassland Investigation and Planning，National Forestry and Grassland Administration，Beijing 100714，China）

AbstractPoplar bark lesions with vesicular canker were collected，isolated and molecularly identified in the laboratory to determine the pathogen species，and the antibacterial test of chlorothalonil against the pathogen was carried out. The results showed that the pathogen was identified as the pathogen of poplar vesicular canker. The sexual stage was Botryosphaeria dothidea，and the asexual stage was Dothiorella gregaria. The inhibition rate of chlorothalonil 600 times dilution on poplar vesicular canker reached more than 90%，and chlorothalonil had a good inhibitory effect on poplar vesicular canker.

Key wordspoplar;vesicular canker;sequence identification;chlorothalonil;antibacterial

楊樹（Populus spp.）是世界中緯度平原地區(qū)栽培面積最大的速生用材林樹種之一，具有生長快、成林早、產(chǎn)量高和易于更新等特點，因而被廣泛用于集約栽培[1]。近年來，一些地區(qū)因沒有做到適地適樹、經(jīng)營管理粗放等導致楊樹病蟲害發(fā)生嚴重，給林業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失，威脅著楊樹用材林和生態(tài)林的發(fā)展[2]。

楊樹潰瘍病是發(fā)生在枝干部、引起皮層局部潰瘍性壞死等多種癥狀的重大病害。該病在我國東北、華北、西北、河南、江蘇、安徽、山東等20多個省市和自治區(qū)發(fā)生[3]，可危害青楊派、白楊派、黑楊派及歐美楊等在內(nèi)的200多個楊樹品種、雜交種和無性系，還可侵染多種其他樹木，幾乎遍及全球[4]。目前，楊樹潰瘍病在我國各楊樹栽植區(qū)均有發(fā)生且危害嚴重，是阻礙楊樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一[5]。因此，掌握楊樹潰瘍病發(fā)病規(guī)律，切實做好楊樹潰瘍病防治工作，對楊樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株

從遼寧省沈陽市國有新民市機械化林場5年生新林1號楊發(fā)病植株上采集樹皮病斑，于實驗室內(nèi)進行分離純化。

1.1.2供試培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑

DNA提取試劑盒：快捷性植物基因組DNA提取系統(tǒng)（天根生化科技有限公司）；

PCR擴增試劑： 10×Ex Taqbuffer、dNTP、Ex Taq酶、ddH2O、Marker（DL2000）（TaKaRa生物工程有限公司）；真菌通用引物：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），由上海生工生物工程有限公司合成；有效成分75%百菌清（利民化學有限責任公司）。

1.2方法

1.2.1病原菌分離

（1）培養(yǎng)基制備。

取新鮮馬鈴薯洗凈去皮切成小塊，用天平稱取200 g，加適量水放置于電阻爐上加熱至沸騰，持續(xù)加熱25 min后用8層紗布過濾，棄濾渣，將濾液定容至1 L，加入20 g葡萄糖，再加入20 g瓊脂，用玻璃棒攪拌至葡萄糖充分混勻并溶解，均勻分裝于三角瓶中高壓滅菌備用[6，7]。

（2）無菌病斑預處理。

將采集的病斑用無菌剪刀剪成約1 cm2的小塊，用自來水進行病斑表面的沖洗， 75%的酒精清洗3次，1%氯化汞浸泡5 min，再用無菌水沖洗3次，即得到無菌病斑[8]。

（3）菌株分離、純化。

將滅菌的PDA培養(yǎng)基趁熱倒入無菌平皿中，待凝固后接種無菌病斑，封口，倒置于25 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨時觀察菌落變化，待菌落長到5 cm左右時，將菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接至新固體PDA培養(yǎng)基中，獲得進一步純化后的純菌株[9]。

1.2.2病原菌的分子鑒定

（1）DNA提取。

將純菌株接種于新PDA培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，用無菌刀片刮取菌絲放于無菌研缽中，迅速加入液氮研磨成粉末，分裝于1 mL離心管中，DNA提取過程見DNA提取試劑盒使用說明書[10]。

（2）DNA濃度測定和電泳檢測。

用DHS NanoPro超微量紫外分光光度計進行測定，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測[11]。

（3）PCR擴增。

以提取DNA為模板，ITS1/ ITS4為引物進行PCR擴增[12]。

反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP（2.5 mmol）2.0 μL、上游引物ITS1（10 mmol）0.5 μL、下游引物ITS4（10 mmol）0.5 μL、模板DNA 1.0 μL、Ex Taq酶 0.25 μL、ddH2O up to 25 μL。

反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72℃延伸10 min，反應30個循環(huán)，4 ℃終止反應。

電泳檢測：

取5 μL反應產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測[13]。

（4）序列Blast比對。

對電泳檢測的PCR產(chǎn)物進行測序。測序結(jié)果在NCBI中進行Blsat比對，確定病原菌種類[13]。

1.2.3藥劑抑菌試驗

（1）帶藥培養(yǎng)基制備。

將不同濃度梯度的百菌清藥劑（無菌水配置）依次加入到冷卻40 ℃左右無菌PDA培養(yǎng)基中，混合均勻倒入平皿中，待培養(yǎng)基冷卻后備用，使各培養(yǎng)基中百菌清的稀釋倍數(shù)為400、600、800和1 000倍，以無菌水為對照，每組處理4次重復[14，15]。

（2）接種病害病原菌。

在無菌操作室用無菌打孔器（直徑5 mm）在活化好的楊樹病害病原菌邊緣打孔，用接種鏟挑取一片菌塊，倒置接種至帶藥培養(yǎng)基中，封口膜封口，倒置于25 ℃生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照菌絲長至平皿邊緣時終止生長[16，17]。

（3）計算與統(tǒng)計。

采用生長速率法測定菌絲生長抑菌率，并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析[18-20]。

抑菌率=對照菌絲生長直徑-處理菌絲生長直徑對照菌絲生長直徑×100％

2結(jié)果與分析

2.1楊樹病害病原菌菌種分離

將采集的病原菌病斑接種至PDA平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 d后可見白色菌絲長出，轉(zhuǎn)接純化2次，獲得純種菌絲，將菌種命名為KY8090。生長情況如圖1、圖2。

2.2楊樹病害病原菌分子鑒定結(jié)果

2.2.1DNA電泳檢測

提取后的DNA經(jīng)脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3。KY8090 DNA條帶單一無雜質(zhì)，無降解。

2.2.2DNA濃度檢測

用DHS-NanoPro超微量紫外可見風光光度計對提取的KY8090 DNA樣品進行濃度測定，結(jié)果見表1。提取的DNA濃度為200～250 μg·mL-1，A260/A280比值1.8～1.9，說明DNA較好，可以作為PCR反應模板。

2.2.3PCR擴增及電泳檢測

PCR反應結(jié)束后，取5 μL反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳結(jié)果見圖4。

擴增出來的目的片段處于同一位置，約600 bp的目的片段，條帶單一，無雜帶，無引物二聚體。

2.2.4PCR產(chǎn)物序列測定

經(jīng)過生物公司序列測定，確定所測得的目的片段長度大小為550 bp，序列如下：

TTCCTCCCGGCCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTG

ATCCGAGGTCAACCTTGAGAAAAGTTCAGAAGGTTCGTCCGGCGGGCGAC

GCCCTGCGCTCCGAAGCGAGATGTATGTTCTACTACGCTTGAGGCAAGAC

GCCACCGCCGAGGTCTTTGAGGCGCGCCCGCAAAGGACGGTGCCCAATAC

CAAGCAGAGCTTGAGGGTTGTAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCTTCGG

AATACCAAAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATT

CTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCA

GAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAGTTTATTAAATGTTTTTCAG

ACTGCATCGTTTACTGACTGGAGTTTGATGGTCCTCTGGCGGGCGCTGGC

CACCCCCCCGGGGAGGGGGGCGGCCGCGGAGGACCGCGGCCCGCCAAAGC

AACAGAGGTAGGTACACAAAGGGTGGGAGGATCGGGCCGAGCCCGAATCA

2.2.5序列Blast比對結(jié)果

將測得目的序列在NCBI官網(wǎng)上進行Blast核酸比對，結(jié)果見圖5。

KY8090與登記號為MN871641.1、MH393518.1、KC197771.1、EU520229.1、MG779570.1、KY393143.1、KY788305.1等菌株序列相似性較高。Query cover 均為100%，Ident均為99%，均為水泡型潰瘍病病原菌，有性階段為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea），屬子囊菌亞門腔菌綱格孢腔菌目葡萄座腔菌屬；無性階段為小穴殼菌（Dothiorella gregaria），屬半知菌亞門球殼孢目球殼孢科小穴殼屬。確定KY8090為楊樹水泡型潰瘍病。

2.3藥劑抑菌試驗結(jié)果

由表2和圖6可見，對照培養(yǎng)基病原菌菌絲生長很快，帶藥培養(yǎng)基上病原菌菌絲生長緩慢。培養(yǎng)5 d左右，對照菌絲已延伸至平皿邊緣，此時菌絲生長直徑達85.27 mm，1 000倍稀釋液的菌絲生長直徑為13.86 mm，抑菌率為83.75%，而600倍稀釋液的菌絲生長直徑僅為7.38 mm，抑菌率為91.35%。各組間菌絲生長直徑和抑菌率存在顯著差異（P＜0.05）。各組菌絲均為白色，對照菌絲向外延伸很長，而處理組菌絲向外幾乎不延伸，各組均未產(chǎn)生孢子。

可見，隨著百菌清稀釋倍數(shù)減?。ㄋ巹舛仍龃螅种坡手饾u增大，當達600倍稀釋液時，抑菌率達90%以上。通過抑菌試驗確定百菌清對楊樹水泡型潰瘍病有顯著的抑菌作用，最適宜的抑菌濃度為600倍稀釋液。

3結(jié)論與討論

本研究對發(fā)病楊樹的樹皮病斑進行了病原菌分離，并進行分子鑒定，確定病原菌為楊樹水泡型潰瘍病病原菌，有性階段為葡萄座腔菌，無性階段為小穴殼菌。同時開展了保護型殺菌劑百菌清對楊樹水泡型潰瘍病抑菌作用試驗，確定百菌清對楊樹水泡型潰瘍病有較好抑菌作用，最適宜的抑菌濃度為600倍稀釋液，此時抑菌率達90%以上。

楊樹是我國栽培廣泛的一種重要樹種，具有重要的經(jīng)濟效益、社會效益和生態(tài)效益。楊樹病害及時準確的防治，可有效降低病害帶來的巨大損失，提高木材產(chǎn)量和質(zhì)量。百菌清是一種保護型殺菌劑，主要作用是使病原真菌細胞的新陳代謝受破壞而失去生命力。該藥劑沒有內(nèi)吸傳導作用，具有良好的黏附性、不易被雨水沖刷掉、藥效期較長等特點。本研究僅開展了室內(nèi)抑菌試驗，還應進行林間病害防治試驗來進一步分析百菌清對楊樹病害的抑菌作用，以期為楊樹水泡型潰瘍病防治提供科學依據(jù)。

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