基于多組學(xué)綜合分析的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1與不同類型腫瘤的關(guān)系研究

【摘要】目的 基于多組學(xué)綜合分析的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1（CHEK1）與不同類型腫瘤的關(guān)系研究，為臨床治療提供參考。

方法 利用腫瘤免疫評(píng)估資源（TIMER）、基因表達(dá)譜交互式分析（GEPIA）、臨床多組學(xué)腫瘤（UALCAN）數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估CHEK1在不同類型腫瘤中的表達(dá)及臨床預(yù)后；利用GEPIA、基因表達(dá)公共（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估CHEK1在不同類型腫瘤中的相關(guān)性。利用cBioPortal、注釋可視化及綜合發(fā)現(xiàn)（DAVID）、蛋白質(zhì)相互作用（String）數(shù)據(jù)庫(kù)分析肺腺癌（LUAD）中CHEK1的共表達(dá)基因。采用轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（TRRUST）數(shù)據(jù)庫(kù)分析轉(zhuǎn)錄因子（TF）與靶基因之間的調(diào)控關(guān)系。結(jié)果 CHEK1在泛癌如乳腺癌、肝細(xì)胞癌、肺腺癌等中普遍高表達(dá)，與多種癌癥的病理分期相關(guān)，CHEK1可能參與多種癌癥的形成及進(jìn)展。CHEK1的啟動(dòng)因子甲基化水平在LUAD中顯著下調(diào)，提示CHEK1可影響染色體穩(wěn)定性與基因組完整性。CHEK1主要參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期等生物學(xué)過(guò)程；調(diào)控CHEK1的上游轉(zhuǎn)錄因子包括腫瘤蛋白（TP53）、B細(xì)胞淋巴瘤（BCL6）、骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因同源物（MYC）及細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（E2F1）。結(jié)論 CHEK1在不同類型癌癥中高表達(dá)，并與多種癌癥密切相關(guān)；CHEK1可能是泛癌重要的分子生物標(biāo)志物，有望成為癌癥治療以及生殖不孕中有前景的分子靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1；腫瘤；多組學(xué)綜合分析

【中圖分類號(hào)】R979.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-2665.2024.16.0111.05

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.16.035

細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1（CHEK1）屬于潛在的泛癌分子生物標(biāo)志物。編碼CHEK1的基因位于人類11號(hào)染色體長(zhǎng)臂的第4個(gè)區(qū)域（11q24.2）[含13個(gè)外顯子，互補(bǔ)DNA（cDNA）全長(zhǎng)1 891 bp]。 CHEK1基因編碼檢查點(diǎn)激酶1蛋白（Chk1）在DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激活、DNA復(fù)制和修復(fù)中起核心作用，對(duì)于細(xì)胞的增殖和患者的生存至關(guān)重要[1]。 DNA損傷性抗腫瘤治療是常用的治療方案，但DNA損傷會(huì)促進(jìn)Chk1/CHEK1激活，引起細(xì)胞周期阻滯于DNA合成后期（G2期）[2]。 Chk1會(huì)增強(qiáng)癌細(xì)胞的DNA修復(fù)，尤其是腫瘤蛋白（TP53）有缺陷的癌細(xì)胞，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的存活率、促進(jìn)癌細(xì)胞增殖； CHEK1抑制導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)早進(jìn)入有絲分裂期（M期）， DNA損傷積累，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于M期，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，故CHEK1被臨床認(rèn)為是影響癌癥發(fā)展和治療的潛在分子生物標(biāo)志物之一[3]。此外，利用生物信息技術(shù)進(jìn)行泛癌研究，可挖掘目標(biāo)基因在不同類型腫瘤中的潛在作用，為全面理解腫瘤發(fā)病機(jī)制及研制靶向藥物提供新策略?；诖?，本研究利用生物信息學(xué)方法，探尋CHEK1與不同類型腫瘤的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 CHEK1在不同類型腫瘤中的表達(dá) ⑴采用腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞組分（TIMER）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//timer.comp-genomics.org/timer）分析CHEK1 mRNA表達(dá)情況。在“Gene_DE”的 “Gene Expression”框內(nèi)填寫“CHEK1”并運(yùn)行“Submit”。⑵采用基因表達(dá)譜交互式分析（GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia2.cancer-pku.cn）分析不同癌細(xì)胞和對(duì)應(yīng)癌旁細(xì)胞中CHEK1 mRNA表達(dá)情況。⑶采用臨床多組學(xué)腫瘤（UALCAN）（https：//ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html）數(shù)據(jù)庫(kù)分析不同類型腫瘤的癌細(xì)胞和癌旁細(xì)胞之間CHEK1蛋白表達(dá)情況。

1.2 CHAiUl2Kmp3pF6stklw5fnAw==EK1在不同類型腫瘤中的關(guān)系 ⑴采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的“Stage plot”模塊分析不同病理分期腫瘤中CHEK1 mRNA的表達(dá)情況。⑵采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)的“生存分析”模塊分析不同類型腫瘤中CHEK1的總體生存（OS）。采用癌癥基因組圖譜（TCGA）和 基因表達(dá)公共（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)分析CHEK1 mRNA表達(dá)與不同類型腫瘤患者的相關(guān)性。

1.3 CHEK1啟動(dòng)因子甲基化水平 采用癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)分析BRCA、 LIHC、 LUAD和正常組織中啟動(dòng)因子甲基化水平在不同癌癥分期、年齡和TP53突變狀態(tài)中的差異。

1.4 LUAD中CHEK1的共表達(dá)基因 ⑴選擇cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)中LUAD的“TCGA，PanCancer Atlas”隊(duì)列及“相對(duì)于所有樣本的mRNA表達(dá)Z分?jǐn)?shù)（log RNA Seq V2 RSEM）”，輸入CHEK1基因后，在“Co-expression”模塊中獲得19 999個(gè)共表達(dá)基因。⑵在注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)（DAVID）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david-d.ncifcrf.gov/summary.jsp）中進(jìn)行基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)（GO）及京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）分析，采用生物信息學(xué)方法對(duì)批量基因和蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行解析。在線繪制GO富集氣泡圖（https：//www.bic.ac.cn/BIC/#/）、KEGG弦圖（http：//vip.sangerbox.com/login.html）。⑶將前50個(gè)共表達(dá)基因與CHEK1共同導(dǎo)入蛋白質(zhì)相互作用（String）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org），以研究多個(gè)蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。⑷采用Cytoscape_v3.9.1軟件、cytoHubba插件，拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)算法給每個(gè)基因賦值，排序發(fā)現(xiàn)核心基因。

1.5 CHEK1的轉(zhuǎn)錄因子與靶基因研究 采用轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（TRRUST）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.grnpedia.org/trrust）分析轉(zhuǎn)錄因子（TF）與靶基因之間的調(diào)控關(guān)系，以確定調(diào)控CHEK1的關(guān)鍵因素。

2 結(jié)果

2.1 CHEK1在不同類型腫瘤中的表達(dá)分析結(jié)果 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)、GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，CHEK1 mRNA在膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma， BLCA）、乳腺浸潤(rùn)癌（breast invasive carcinoma， BRCA）、宮頸鱗癌和腺癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma， CESC）、結(jié)腸癌（colon adenocarcinoma，COAD）、食管癌（esophageal carcinoma， ESCA）、膠質(zhì)瘤（glioma， GBM）、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma， HNSC）、肝細(xì)胞肝癌（liver hepatocellular carcinoma， LIHC）、肺腺癌（lung adenocarcinoma， LUAD）、肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma， LUSC）、直腸腺癌（rectum adenocarcinoma，READ）、胃癌（stomach adenocarcinoma， STAD）、子宮內(nèi)膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma， UCEC）的癌組織中表達(dá)高于癌旁組織。 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示， CHEK1蛋白在GBM、 HNSC、 LUAD、 LUSC、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma， PAAD）、 UCEC的癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，見(jiàn)圖1。

2.2 CHEK1與不同類型腫瘤的相關(guān)性分析結(jié)果

CHEK1 mRNA表達(dá)與BRCA、 LIHC、 LUAD的病理分期顯著相關(guān)，病理分期越高CHEK1 mRNA表達(dá)水平越高；高表達(dá)的CHEK1 mRNA均與這3種腫瘤的OS相關(guān)，說(shuō)明CHEK1具有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用， CHEK1表達(dá)與BRCA、 LIHC、 LUAD這3種腫瘤患者的密切相關(guān)，見(jiàn)圖2。

2.3 CHEK1啟動(dòng)因子甲基化水平分析 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示， LIHC及LUAD中CHEK1啟動(dòng)因子甲基化水平顯著下降； BRAC組織與正常組織中的CHEK1啟動(dòng)因子甲基化水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖3。提示LIHC中CHEK1啟動(dòng)因子甲基化水平顯著下降，與年齡、癌癥分期無(wú)關(guān)，與TP53突變狀態(tài)有關(guān)（具有TP53突變的LIHC患者的CHEK1啟動(dòng)因子甲基化水平顯著下降， P<0.001）； LUAD中CHEK1的啟動(dòng)因子甲基化水平顯著下降，與不同癌癥分期、年齡和TP53突變狀態(tài)均無(wú)關(guān)。

2.4 LUAD中CHEK1的共表達(dá)基因分析 121個(gè)共表達(dá)基因中相關(guān)系數(shù)最大的基因?yàn)榧?xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白（CDCA）5（r值=0.88），見(jiàn)圖4-A。GO按照生物過(guò)程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組成（CC）對(duì)基因進(jìn)行注釋和分類，校正P<0.05后的GO與KEGG被視為顯著富集，前10個(gè)GO與KEGG條目進(jìn)行可視化分析。GO富集氣泡圖顯示， CHEK1共表達(dá)基因主要發(fā)揮結(jié)合蛋白質(zhì)、 ATP、 DNA等功能，在細(xì)胞核、核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中發(fā)揮作用，主要參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期等生物學(xué)過(guò)程，見(jiàn)圖4-B。KEGG弦圖顯示， CHEK1緊密相關(guān)的基因主要富集到細(xì)胞周期、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、孕酮介導(dǎo)的卵細(xì)胞成熟、 DNA復(fù)制、同源重組等通路，見(jiàn)圖4-C。其蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，與CHEK1緊密聯(lián)系的核心基因，包括解旋酶超家族（RAD）54L、非染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白凝縮蛋白復(fù)合體Ⅰ亞單位H（NCAPH）、Polo樣激酶（PLK）4、著絲粒蛋白（CENP）A、著絲粒復(fù)合體（NDC）80、驅(qū)動(dòng)蛋白超家族蛋白（KIF）2C、 CDCA5、NCAPG（沉默非染色體結(jié)構(gòu)維護(hù)凝縮蛋白Ⅰ復(fù)合體G亞基）、微管組織因子（TPX）2、 CDCA8、人核酸外切酶（EXO）1、母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶（MELK）、 KIF15、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（BUB）1B、KIF4A、 KIF11、蛋白激酶（TTK）、 KIF23、 BUB1、拓?fù)洚悩?gòu)酶（TOP）2A、CDC20、細(xì)胞周期蛋白（CCN）A2、盤大同源相關(guān)蛋白（DLGAP）5、 PLK1、微染色體維持10復(fù)制qoqqateeHAuMQ6OvwUiGxA==起始因子（MCM10）、 CDC45、 CDC8、紡錘體和著絲粒相關(guān)復(fù)合亞基（SKA）3。

2.5 CHEK1的轉(zhuǎn)錄因子與靶基因研究分析 TRRUST數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)構(gòu)顯示， CHEK1為非轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控CHEK1的上游轉(zhuǎn)錄因子[如TP53、轉(zhuǎn)錄抑制因子BCL6、骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因同源物（MYC）（激活作用）、 E2F轉(zhuǎn)錄因子（E2F）1]。探索CHEK1及核心基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子靶點(diǎn)，關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子包括E2F4、 E2F3、 E2F1、 Y-盒結(jié)合蛋白（YBX）1、 TP53及MYC，見(jiàn)表1。

3 討論

相關(guān)研究表明，CHEK1在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)[4-5]，與本研究結(jié)果一致。本研究分析CHEK1在泛癌中的表達(dá)水平，檢測(cè)多個(gè)在線大型數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，CHEK1 mRNA在BLCA、BRCA、CESC、COAD、ESCA、GBM、HNSC、LIHC、LUAD、LUSC、READ、STAD及UCEC種顯著上調(diào)。CHK1蛋白在GBM、HNSC、LUAD、LUSC、PAAD、UCEC這6種癌癥中顯著上調(diào)。這說(shuō)明CHEK1在大多數(shù)惡性腫瘤中作為促癌基因，參與不同類型腫瘤的形成及進(jìn)展。

本研究分析CHEK1在不同類型癌癥中的預(yù)后價(jià)值，結(jié)果表明CHEK1與BRCA、LIHC、LUAD的病理分期顯著相關(guān)且高表達(dá)的CHEK1 mRNA會(huì)降低BRCA、LIHC、LUAD患者的總體生存。這提示CHEK1與BRCA、LIHC、LUAD的密切相關(guān)。LIHC及LUAD中CHEK1啟動(dòng)因子甲基化水平顯著下降；BRAC組織與正常組織中的CHEK1啟動(dòng)因子甲基化水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示LIHC中CHEK1啟動(dòng)因子甲基化水平顯著下降，與年齡、癌癥分期無(wú)關(guān)，與TP53突變狀態(tài)有關(guān)；LUAD中CHEK1的啟動(dòng)因子甲基化水平顯著下降，與不同癌癥分期、年齡和TP53突變狀態(tài)均無(wú)關(guān)。

本研究利用生物信息技術(shù)研究共表達(dá)基因并構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，尋找核心基因，以探究CHEK1在LUAD中的作用機(jī)制。CHEK1主要參與結(jié)合蛋白質(zhì)等功能，并富集于細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、同源重組等信號(hào)通路，這與本研究結(jié)果一致[3]。這些作用機(jī)制推動(dòng)Chk1抑制劑在癌癥治療中的應(yīng)用，如利用ATR/Chk1/WEE1通路治療PARP抑制劑耐藥性癌癥等[6]。CHEK1共表達(dá)基因富集于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、孕酮介導(dǎo)的卵細(xì)胞成熟信號(hào)通路，這可能與女性生殖不孕有關(guān)[2]。此外，具有Chk1等位基因雜合子突變的卵母細(xì)胞受精后由于停滯在細(xì)胞周期的G2期而無(wú)法進(jìn)行第一次有絲分裂，故Chk1抑制性藥物可能為具有CHEK1雜合突變的女性提供新的藥物解決方案。

本研究結(jié)果還顯示，可以調(diào)控CHEK1的上游轉(zhuǎn)錄因子包括TP53、轉(zhuǎn)錄抑制因子BCL6、MYC及E2F1。Chk1激酶能夠與TP53基因協(xié)同作用，抑制細(xì)胞周期并誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡[7]。在T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病（T-ALL）（與NOTCH1，TP53，轉(zhuǎn)錄抑制因子BCL6 等基因突變有關(guān)）中，Chk1的過(guò)表達(dá)通過(guò)防止過(guò)度復(fù)制應(yīng)激，對(duì)細(xì)胞的增殖和生存至關(guān)重要[8]。此外，抑制Chk1會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡生長(zhǎng)抑制、MYC丟失及自噬激活[9]。選擇性Chk1抑制劑與mTOR抑制劑在MYC過(guò)表達(dá)細(xì)胞中產(chǎn)生顯著的協(xié)同作用，這或許可以作為MYC介導(dǎo)的腫瘤的一種新穎且有效的聯(lián)合治療方式[10]。在胃癌、結(jié)直腸癌中，Chk1的表達(dá)受到E2F1調(diào)控，影響鉑類化療及放療敏感性。

綜上所述，CHEK1在不同類型癌癥中高表達(dá)，并與多種癌癥密切相關(guān)。本研究分析CHEK1在LUAD中的作用，以及其潛在的生物過(guò)程和富集通路，這為全面理解CHEK1在腫瘤促進(jìn)中的關(guān)鍵作用增加新的維度，也為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的深入驗(yàn)證乃至未來(lái)癌癥治療的臨床應(yīng)用提供了一個(gè)綜合分析的基礎(chǔ)。

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