利用SSR標記鑒定西瓜雜交種新喜3號純度

摘 " "要：為了提高雜交種篩選效率，從23對西瓜簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）引物中篩選適用于西瓜雜交種新喜3號及其親本的特異性引物并進行種子純度鑒定。結果表明，1對引物BVWS00208在親本間具有多態(tài)性且在雜交后代中兼具雙親條帶，屬于共顯性標記。將該引物在98個雜交后代中進行驗證，純度鑒定結果為98.9%，通過傳統(tǒng)田間純度鑒定結果為98.0%，二者誤差≤1%。綜上，SSR引物BVWS00208能夠作為特異引物對西瓜雜交種新喜3號進行種子純度鑒定，且該方法便捷經(jīng)濟，能為該品種的制種和推廣提供技術支持。

關鍵詞：西瓜；新喜3號；SSR分子標記；純度鑒定

中圖分類號：S651 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）08-131-05

Identification of seed purity of watermelon hybrid Xinxi 3 by SSR marker

REN Yici1， LIU Xicun1， WANG Wenying1， GAO Zhan1， WANG Xiangdong1， GUO Chunjiang1， LI Jiangwei2

（1. Xinxiang Academy of Agricultural Sciences， Xinxiang 453000， Henan， China; 2. Xinxiang Agricultural Products Quality and Safety Testing and Inspection Center， Xinxiang 453000， Henan， China）

Abstract： In order to improve the efficiency of hybrid screening， this study screened specific primers suitable for the watermelon hybrid Xinxi 3 and its parents from 23 pairs simple sequence repeat（SSR）primers in watermelon. The results showed that one pair of primers BVWS00208 showed polymorphism between parents and had both parental bands in hybrid offspring， belonging to codominant marker. The primer was validated in 98 hybrid individuals， and the purity identification result was 98.9%. The traditional field test showed the purity was 98.0%， with an error of ≤1% between them. This indicates that the primer BVWS00208 can serve as a specific primer for seed purity detection of watermelon hybrid Xinxi 3. The identification is convenient and economical， which can provide technical support for the seed production and promotion of this variety.

Key words： Watermelon; Xinxi 3; SSR molecular marker; Purity test

西瓜（Citrullus lanatus）屬葫蘆科一年生植物，含有果糖、番茄紅素、瓜氨酸等營養(yǎng)成分，是深受消費者青睞的水果之一。經(jīng)過長期的栽培和育種，中國已有成百上千個西瓜品種問世[1]。通過保護地或者熱帶種植，西瓜已實現(xiàn)周年化生產(chǎn)，全年供應。FAO統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，2022年世界西瓜栽培面積為291.64萬hm2，中國的西瓜栽培面積為139.19萬hm2，占比47.73%；2022年全球西瓜總產(chǎn)量為9 995.75萬t，中國的西瓜總產(chǎn)量為6 054.22萬t，占比60.57%，中國的西瓜栽培面積和產(chǎn)量均居于世界首位。

隨著西瓜產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，市面上西瓜種子行業(yè)競爭也日漸激烈。種子質(zhì)量是影響果實品質(zhì)、產(chǎn)量、種植者和種子企業(yè)經(jīng)濟效益的關鍵因素[2]。雜交育種是最基本的育種方法之一，其后代兼具雙親優(yōu)勢性狀，世界范圍內(nèi)主要作物的優(yōu)良品種大多通過雜交育種的方法獲得[3]。在雜交種生產(chǎn)過程中，氣候環(huán)境、隔離區(qū)選擇、制種工人操作時機和認真程度等均會影響種子純度。為保證種子質(zhì)量、市場占有額以及農(nóng)戶的生產(chǎn)安全，種子純度鑒定工作尤為重要[4]。以形態(tài)學標記進行純度鑒定會因作物遺傳背景相對狹窄、環(huán)境差異等因素而受限制，逐漸不能滿足實際生產(chǎn)需要。為了更加準確地鑒定品種純度，提高鑒定效率，通過DNA鑒定的方法越來越受到重視。

DNA分子標記是能夠反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段，是基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術的分子標記，結果可靠、重復性好，不僅在大田作物和蔬菜育種中得到應用[5]，在食用菌[6]、果樹[7]、花卉[8]中也有廣泛應用。西瓜的DNA分子標記主要包括隨機擴增多態(tài)性DNA標記（RAPD）、插入或缺失DNA標記（InDel）、簡單重復序列標記（SSR）、相關序列擴增多態(tài)性標記（SRAP），基于單核苷酸多態(tài)性（SNP）開發(fā)的酶切擴增多態(tài)性標記（CAPS）等，涉及西瓜的品種選育、種子純度鑒定、遺傳多樣性分析、抗病蟲性等研究內(nèi)容。其中，SSR分子標記具有共顯性、準確性強、對DNA質(zhì)量要求低、檢測成本低等優(yōu)勢[4]。

筆者從23對西瓜SSR引物中篩選適用于西瓜雜交種新喜3號及其親本的特異性引物并進行種子純度鑒定，借助分子標記鑒定種子純度，提高鑒定效率，降低檢測成本，以期為品種的開發(fā)與推廣提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學院選育的大果型西瓜品種新喜3號（雜交一代）及其親本為試驗材料，新喜3號為淺綠色果皮，覆較窄的綠齒條帶，果皮堅韌，果實呈橢圓形；母本為圓形果實，淺綠果皮上覆齒條；父本為橢圓形，淺綠果皮覆網(wǎng)狀條帶（圖1）。

1.2 材料培育

2023年3月25日，選擇新喜3號種子100粒及其親本種子各20粒，將種子在55 ℃溫水中浸種6 h，使用50孔穴盤（54 cm×28 cm×85 cm）進行播種，選用瓜類專用滅菌基質(zhì)育苗。材料長至3葉1心時，于2023年4月27日定植于塑料大棚內(nèi)，爬地栽培，常規(guī)管理。

1.3 西瓜基因組DNA提取及檢測

待植株長至2葉1心時，每株取1 cm2的嫩葉，編號后液氮速凍帶回實驗室并存入-80 ℃超低溫冰箱。使用冷凍研磨儀將樣品充分研磨，按照改良的CTAB法提取DNA樣本[9]，借助微量核酸蛋白檢測儀檢測DNA質(zhì)量及濃度，并將樣品稀釋至50 ng?μL-1，放置在-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.4 分子鑒定

試驗用23對SSR引物來自張慕月[10]。PCR反應體系：DNA模板0.5 μL，正、反向引物各0.5 μL，2×PCR Mix 5.0 μL，ddH2O補齊至10.0 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，根據(jù)不同引物設置退火溫度，退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，放于4 ℃保存。利用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測，采用銀染法借助膠片觀察燈觀察條帶[2]。

1.5 純度鑒定

定植后對新喜3號進行日常栽培管理，于2023年7月2日在果實成熟期統(tǒng)計果實皮色、果實形狀、果肉顏色等農(nóng)藝性狀，通過形態(tài)學標記判斷雜交種純度。結合篩選出的具有特異性的SSR引物，通過DNA分子標記技術鑒定種子純度，同時顯現(xiàn)雙親的條帶類型即視為真雜種。

2 結果與分析

2.1 特異性引物篩選

選取23對西瓜SSR引物在新喜3號及其親本材料中進行多態(tài)性篩選。有一對引物BVWS00208（上游引物序列：GCAAAGATTGTCTATGAAGCAGCA；下游引物序列：GCTCATTGGCTTCTTGAATCTGTT）在雙親中呈現(xiàn)單條帶，且具有顯著差異，在雜交種中呈現(xiàn)雙親條帶，具有互補性和共顯性，詳見圖2。初步判斷該引物可作為新喜3號品種的特異性引物，進行純度鑒定。

2.2 多態(tài)性引物的重復性檢驗

利用引物BVWS00208對98份F1代新喜3號進行種子純度鑒定，擴增條帶如圖3所示，除去不明顯的5份材料（編號21、35、54、58、59），其余92份材料的條帶大小一致，具有雙親的條帶特征，1份材料（編號92）的條帶表現(xiàn)與母本（P2）一致，純度鑒定結果為98.9%。

2.3 形態(tài)學鑒定

在果實成熟期利用形態(tài)學標記對品種純度進行田間鑒定，發(fā)現(xiàn)西瓜的果實外觀、瓤質(zhì)瓤色一致性較好，表現(xiàn)為淺綠色果皮覆較窄的綠齒條帶，果皮堅韌，果實呈橢圓形。僅有2株果實性狀與母本特征相似，表現(xiàn)為圓形果實，淺綠果皮上覆綠齒條，由此可得雜交種純度為98.0%。

3 討論與結論

目前依托傳統(tǒng)形態(tài)學標記的植物特異性、一致性、穩(wěn)定性測試受主觀或者環(huán)境因素影響，對育種材料或品種間的差異描述逐漸不能滿足實際需要[11]。西瓜、甜瓜作為非主要農(nóng)作物，進行品種保護、種子經(jīng)營需要向農(nóng)業(yè)農(nóng)村部申請新品種保護或登記。為了有效管理已登記的品種，自2021年起，向日葵、黃瓜、甜瓜登記品種利用DNA分子鑒定技術進行了清退相似品種的工作，已連續(xù)開展三批，以后將會在其他作物中應用[12]。不論是育種者個人還是公司、檢測機構，均會逐步完善遺傳背景的描述，防止惡意競爭，維護育種者的知識產(chǎn)權不受侵害。

SSR標記具有檢驗速度快、成本低、標記分布均勻，準確性高的特點，在種子純度鑒定方面發(fā)揮了重要作用。何玉等[13]在28對SSR標記中篩選出了5對多態(tài)性好的SSR，并利用BVWS00839標記檢驗西瓜品種W1806的純度。尤佳琪等[14]利用SSR標記對黑津和申蜜968這兩個西瓜品種進行純度檢測，鑒定結果高效準確，彌補了大田純度鑒定耗時長、易受環(huán)境影響的不足。楊會會等[15]利用雙重以及三重PCR純度鑒定體系鑒定西瓜品種錦霞八號雜交種的純度，提高了檢測的準確性。程維舜等[16]采用熒光標記SSR鑒定西瓜品種武農(nóng)8號雜交種的純度，峰值清晰，避免了凝膠電泳圖結果辨別困難的問題。筆者在本研究中利用SSR標記BVWS00208對西瓜品種新喜3號進行純度鑒定，分子標記鑒定與形態(tài)學鑒定結果一致。篩選到的特異性標記，加深了對育種材料間差異關系的了解，為該品種制種及推廣開發(fā)有一定的助力作用。

隨著測序技術的發(fā)展，三代分子標記SNP在作物遺傳育種中的應用逐漸增多。其中競爭性等位基因特異性PCR（KASP）、靶向測序基因型檢測（GBST）技術都具有準確性高、成本較低的優(yōu)勢[11]。KASP適宜檢測大量樣本SNP位點；GBST技術是對靶向位點進行測序和基因型檢測，依托其開發(fā)的基于GenoBaits的液相芯片可以更深層次探究遺傳多樣性和不同材料的精細差異。目前該技術已在玉米、水稻、大豆等作物上應用，未來有望實現(xiàn)資源共享與開源育種[17]。Park等[18]使用Fluidigm基因分型開發(fā)了一組核心SNPs，用以韓國西瓜商業(yè)品種的鑒定和新品種開發(fā)的所有權保護。Yang等[1]在前人研究的基礎上，篩選出241個SNPs對247個中國西瓜品種基因型進行鑒定與多樣性分析，將西瓜品種分為5個亞群，并選擇了32個核心SNPs，通過KASP標記可實現(xiàn)高效低成本的西瓜品種精準鑒定，有助于開展西瓜品種保護管理工作。徐云碧等[19]通過分析世界各國主要作物品種保護經(jīng)驗，建議建立專家咨詢委員會，完善DUS評價和實質(zhì)性派生品種評價體系，建立品種保護數(shù)據(jù)庫，提供查詢對比服務，進而推動種業(yè)創(chuàng)新和新品種保護。

綜上所述，SSR標記BVWS00208能對新喜3號品種純度進行有效鑒定，純度達98.9%，與形態(tài)學鑒定結果一致，研究結果為其他西瓜品種的純度鑒定和新品種保護提供了借鑒。品種的培育、開發(fā)與推廣離不開基礎研究與市場化運作，借助分子技術輔助西瓜育種是必然趨勢。育種者應合理利用技術手段，提高西瓜品質(zhì)和品種適應性，充分利用DNA指紋圖譜對品種純度進行鑒定和新品種保護，維護育種人員的合法權益，從而推動西瓜產(chǎn)業(yè)綠色健康發(fā)展。

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收稿日期：2024-02-29；修回日期：2024-06-16

基金項目：河南省科技攻關計劃項目（222102110361）

作者簡介：任藝慈，女，研究實習員，主要從事西瓜甜瓜育種工作。E-mail：ycamy14@163.com

共同第一作者：劉喜存，男，副研究員，主要從事西瓜甜瓜育種及病蟲害防治工作。E-mail：lxc78zll79@126.com

通信作者：李江偉，男，高級農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)業(yè)技術推廣應用工作。E-mail：lijiangwei8855@126.com