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    蜂巢小甲蟲保幼激素環(huán)氧水解酶基因JHEH1和JHEH1-2生物信息學(xué)及表達分析

    2024-08-22 00:00:00楊馨宇顧一凡蘇奕源高景林韓文素李曉宇
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年6期

    關(guān)鍵詞:保幼激素環(huán)氧水解酶;蜂巢小甲蟲;保幼激素;生物信息學(xué)分析;基因表達

    中圖分類號:S895:Q786 文獻標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2024)06-0103-10

    蜂巢小甲蟲(Aethina tumida Murray)屬鞘翅目(Coleopera)露尾甲科(Nitdiuldae),是蜂群的重要寄生性害蟲,源自于非洲南部的撒哈拉以南地區(qū),目前已擴散至除南極洲之外的所有大陸,我國2017年首次報道該蟲的危害。蜂巢小甲蟲不僅對養(yǎng)蜂業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,還可入侵熊蜂、無刺蜂和獨棲蜂,從而破壞當(dāng)?shù)氐奈锓N生態(tài)平衡。蜂巢小甲蟲具有對環(huán)境適應(yīng)能力強、傳播途徑廣、寄主種類多、飛行距離遠、繁殖率高、成蟲壽命長等特點。據(jù)報道,一只雌蟲可存活6個月之久,一生可產(chǎn)卵2000多粒,幼蟲和成蟲均可取食蜂蜜、花粉、蜜蜂幼蟲和蛹,幾個月后幾只成蟲即可繁殖出成千上萬只,并再次侵染爆發(fā)成災(zāi)。

    蜂巢小甲蟲作為蜜蜂的六大重要病原體之一(World Organisation for Animal Health,2019),侵害早期很難被察覺,目前無行之有效的預(yù)防手段,其一旦進入我國適宜生長的地區(qū),很容易爆發(fā)成災(zāi),破壞生態(tài)平衡的同時也將對當(dāng)?shù)仞B(yǎng)蜂業(yè)造成嚴(yán)重影響。保幼激素(juvenile hormone,JH)是一類倍半萜類激素,在昆蟲發(fā)育和生殖過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,干擾其合成和代謝一直被認(rèn)為是一種很有前途的替代化學(xué)殺蟲劑的方法,并且對非目標(biāo)生物毒性低。研究表明,保幼激素降解過程主要涉及3種酶:保幼激素環(huán)氧水解酶JHEH、保幼激素脂酶(juvenile hormone esterase,JHE)和保幼激素二醇激酶(juvenile hormone di-olkinase,JHDK),其中JHEH屬于微粒體環(huán)氧化物水解酶家族(microsomal epoxide hydrolase family),與組織中膜結(jié)合,催化血淋巴中JH和保幼激素酸(juvenile hormone acid,JHa),使之降解為沒有活性的保幼激素二醇(juvenile hormone di-ol,JHd)和保幼激素酸二醇(juvenile hormone acid diol,JHad),并中斷咽側(cè)體JH的合成。目前,JHEH基因在多種昆蟲中進行了較為深入的研究,如褐飛虱Nilaparvata lugens、煙芽夜蛾Heliothis virescens、家蠶Bombyx mori、粉紋夜蛾Trichoplusia ni、赤擬谷盜Tribolum castane-um、橘小實蠅Bactrocera dorsalis、意大利蜜蜂Apis mellifera、黏蟲Mythimna separata等。不同昆蟲中JHEH基因的數(shù)量不同,其功能也不盡相同。但鞘翅目昆蟲中,關(guān)于蜂巢小甲蟲保幼激素及保幼激素降解酶的研究鮮有報道。

    本課題組前期對蜂巢小甲蟲卵巢組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序,注釋到5條JHEH基因,其中JHEH1和JHEH1-2的表達在不同發(fā)育時期卵巢中差異顯著。本研究對蜂巢小甲蟲保幼激素環(huán)氧水解酶基因JHEH1和JHEH1-2進行生物信息學(xué)分析,并檢測其在成蟲不同發(fā)育時期的卵巢等不同組織中的表達模式,為后續(xù)深入研究JHEH基因?qū)Ψ涑残〖紫x生長發(fā)育調(diào)控機制提供重要的理論基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1試驗材料

    蜂巢小甲蟲采自海南省??谑协傊锌h吊羅山鄉(xiāng)區(qū)域內(nèi)中華蜜蜂蜂場(109°57′36″E,18°47′48″N),帶回實驗室飼養(yǎng)于人工氣候箱和暗室的養(yǎng)蟲籠內(nèi)。參照Neumann的方法飼養(yǎng),略有改動。蜂巢小甲蟲成蟲和幼蟲均用自制蜂糧(含蜂蜜、花粉、豆粉、奶粉)飼喂。飼養(yǎng)條件為:溫度(27±1)℃,相對濕度(60±10)%,未成熟幼蟲黑暗飼養(yǎng)約2周;老熟幼蟲人工放進高溫滅菌的沙土(含水量8%~10%)內(nèi)化蛹;蛹及羽化后的成蟲每日自然光照14 h飼養(yǎng);成蟲產(chǎn)卵孵化為幼蟲后,再黑暗飼養(yǎng),周而復(fù)始。

    1.2主要試劑和儀器

    Eastep@ Super Total RNA Extraction Kit為美國Promega公司產(chǎn)品;TRUEscript RT Master Mix(OneStep gDNA Removal)試劑盒、2×SYBRrGreen qPCR Mix(Low ROX)試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。主要儀器為體視顯微鏡(卡爾蔡司光學(xué)(中國)有限公司)、湘儀高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)、微量紫外可見分光光度計(ND2000C,Thermo Fisher Sci-entific)、實時熒光定量PCR儀(Applied Biosys-tems,Thermo Fisher Scientific)等。

    1.3蜂巢小甲蟲JHEH基因生物信息學(xué)分析

    從GenBank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中獲取基因編碼的氨基酸序列,使用InterPro工具(https://www.ebi.ac.uk/in-terro/)進行功能結(jié)構(gòu)域分析,在NCBI上利用在線軟件BLAST(https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)進行比對,使用MEGA 7.0軟件對氨基酸序列進行分析并使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。對目的基因編碼產(chǎn)物,使用ProtParam工具(ht-tp://protparam.net/index.html)預(yù)測其理化性質(zhì),使用ProtScale工具(https://www.expasy.org/re-sources/protscale)分析疏水性,使用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域,使用SignaIP 5.0(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析信號肽,使用SOPMA工具(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu),用SWISS-MODEL工具(https://swissmodel.ex-pasy.org/)預(yù)測三級結(jié)構(gòu)。

    1.4蜂巢小甲蟲JHEH基因表達分析

    1.4.1組織樣品采集 分別取未出土(0d)和出土后1日齡、2日齡、3日齡(1、2、3 d)的蜂巢小甲蟲雌成蟲若干,置于硅膠盤上,放置于體視顯微鏡下解剖出卵巢,用PBS緩沖液沖洗并除去多余的脂肪、氣管等組織后用于試驗。同日齡的5個蜂巢小甲蟲卵巢作為1個生物學(xué)重復(fù),設(shè)3個重復(fù)。此外,取早期未出土成蟲60只,分別收集頭、胸、足和脂肪體樣本。每個組織收集3組,每組為一個生物學(xué)重復(fù)(20只),設(shè)3個重復(fù)。所有樣品放人液氮中速凍后置于-80℃冰箱中備用。

    1.4.2總RNA提取與cDNA第一鏈合成 將組織樣品用液氮充分研磨至粉末狀,轉(zhuǎn)入1.5 mL無RNA酶離心管中稱量,加入裂解液反復(fù)吹打直至無明顯塊狀組織。根據(jù)Eastep Super總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。微量分光光度計檢測RNA濃度和純度,1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性??俁NA提取完成后統(tǒng)一稀釋至100ng/μL。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒TRUEscript RTMaster Mix(OneStep gDNA Removal)操作說明書進行反轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后的cDNA保存于-20℃作為qPCR模板備用。

    1.4.3引物設(shè)計及RT-qPCR擴增 以蜂巢小甲蟲的甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參基因,引物來源于文獻,JHEH1和JHEH1-2基因的引物設(shè)計和合成均由上海生工生物工程有限公司完成(表1)。以1.4.2合成的cDNA為模板,采用2×SYBR Green qPCR Mix(Low ROX)試劑盒,在熒光定量PCR儀QuantStudio 6 Flex real-time qPCR System通過2步法進行。反應(yīng)體系為20μL:2× SYBR qPCR Mix (Low ROX) 10μL,DNA模板1μL,上、下游引物各0.4μL,ddH2O8.2μL。反應(yīng)程序為:95℃2 min;95℃15s,60℃30 s,72℃30 s,40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次,生物學(xué)重復(fù)3次。

    1.5數(shù)據(jù)分析

    使用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用2-△△Ct法計算蜂巢小甲蟲成蟲不同發(fā)育時期及組織JHEH1和JHEHl-2的相對表達量,采用單因素方差分析(ANOVA)的LSD法進行顯著性差異檢驗(Plt;0.05),使用GraphPad Prism 5軟件作圖。

    2結(jié)果與分析

    2.1蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2基因序列分析

    從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取蜂巢小甲蟲JHEH1(LOC109597754)和JHEH1-2(LOC109605925)基因的開放閱讀框(ORF),預(yù)測可編碼的蛋白質(zhì)分別含有460個和461個氨基酸(圖1)。使用InterPro數(shù)據(jù)庫對兩個蛋白的結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測,表明JHEH1蛋白和JHEHl-2蛋白均屬于環(huán)氧化物水解酶(epoxide hydrolase)蛋白家族,且均具有環(huán)氧化物水解酶的N端結(jié)構(gòu)域,分子功能預(yù)測前者具備乙醚水解酶活性,后者具有催化活性。

    2.2蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2基因系統(tǒng)進化分析

    從NCBI數(shù)據(jù)庫中分別搜索與蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2存在同源關(guān)系的同源蛋白序列,獲得了包括光肩星天牛(Anpoploppora glabrip-ennis)、內(nèi)華達白蟻(Zootermopsis nevadensis)等昆蟲的氨基酸序列,并采用Bootstrap法重復(fù)1000次以構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。JHEH1的系統(tǒng)進化分析結(jié)果(圖2A)顯示,蜂巢小甲蟲與光肩星天牛被歸為一支,并進一步與內(nèi)華達白蟻聚為一類。JHEHl-2的系統(tǒng)進化分析結(jié)果(圖2B)表明,蜂巢小甲蟲的JHEH1-2較為保守,與檉柳葉甲(Di-orhabda sublineata)、紅柳粗角螢葉甲(Diorhabda carinulata)、異色瓢蟲(Harmonia axyndis)、七星瓢蟲(Coccinella septempunctata)、米象(Sitophilus oryzae)聚為一支。

    2.3蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEHl-2基因生物信息學(xué)分析

    2.3.1編碼蛋白理化性質(zhì)分析 使用ProtParam對兩個基因所編碼蛋白產(chǎn)物的理化性質(zhì)進行分析,結(jié)果顯示,JHEH1編碼460個氨基酸,蛋白相對分子質(zhì)量為52 kDa,預(yù)測的理論等電點(pI)為8.06,蛋白分子式為C2425 H3707 N603O660S16,原子總數(shù)為7411。JHEH1編碼的總氨基酸序列中,亮氨酸(Leu)占比最高,為10.2%,其次為纈氨酸(Val),占比為7.6%,其中吡咯賴氨酸(Pyl)和硒代半胱氨酸(Sec)的含量為零。帶有負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)為46個,帶有正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)為48個。該蛋白N端推測為蛋氨酸(Met),推測其半衰期為30 h(哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞,體外)。其不穩(wěn)定系數(shù)為32.69,脂肪系數(shù)為91.93,總平均親水系數(shù)為-0.109。

    JHEH1-2編碼461個氨基酸,蛋白相對分子質(zhì)量為52 kDa,預(yù)測的理論等電點(pI)為8.70,蛋白分子式為C2420 H3713N597O656S15,原子總數(shù)為7401。JHEH1-2編碼的總氨基酸序列中,亮氨酸(Leu)占比最高為10.6%,其次為賴氨酸(Val)占比為8.5%,其中吡咯賴氨酸(Pyl)和硒代半胱氨酸(Sec)的含量為零。帶有負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)為43個,帶有正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)為48個。該蛋白N端推測為蛋氨酸(Met),推測其半衰期為30 h(哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞,體外)。其不穩(wěn)定系數(shù)為31.85,脂肪系數(shù)為93.64,總平均親水系數(shù)為-0.070。

    2.3.2編碼蛋白疏水性分析 使用ProtScale工具對JHEH1和JHEH1-2這兩個基因所編碼蛋白的親疏水性進行分析。結(jié)果(圖3)表明,JHEH1和JHEH1-2編碼的蛋白分別約含有4個和5個高峰(疏水區(qū)),N端疏水性均較強,需要結(jié)合跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測以進行下一步分析。

    2.3.3編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測與分析 使用TMHMM 2.0工具對JHEH1和JHEH1-2進行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析。結(jié)果(圖4)顯示,JHEH1編碼蛋白的1—27位氨基酸位于跨膜結(jié)構(gòu)域的可能性較低,且預(yù)測全部氮基酸均位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)(圖4A);JHEH1-2編碼蛋白的1—6位氨基酸位點位于細(xì)胞內(nèi)側(cè),7—29位氨基酸位于跨膜區(qū),其余30—461位氨基酸定位于細(xì)胞外側(cè),與疏水性預(yù)測的結(jié)果高度吻合。

    2.3.4編碼蛋白信號肽預(yù)測與分析 使用Sig-naIP 5.0軟件對JHEH1和JHEH1-2基因編碼蛋白的信號肽進行分析。結(jié)果(圖5)顯示,JHEH1編碼蛋白有信號肽的概率為86.563%,信號肽切割位點為22—23位,可能性為52.080%,預(yù)測的信號肽序列為MGKCGTFYVAIVALLAYGGYRA(圖SA);JHEH1-2編碼蛋白有信號肽的概率為51.493%,信號肽切割位點為25-26位,可能性為30.760%,預(yù)測的信號肽序列為MGKVCGLFLL-GIFATLAFVGFKTYS(圖5B)。

    2.3.5編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析 使用SOPMA工具對JHEH1和JHEH1-2編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測與分析。結(jié)果(圖6)顯示,JHEH1二級結(jié)構(gòu)中,α螺旋占41.52%,延伸鏈占12.17%,無規(guī)則卷曲占43.48%,β轉(zhuǎn)角占2.83%。JHEH1-2二級結(jié)構(gòu)中,α螺旋占41.87%,延伸鏈占12.58%,無規(guī)則卷曲占42.30%,β轉(zhuǎn)角占3.25%。

    2.3.6編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 使用SWISS-MODEL工具對JHEH1和JHEH1-2基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。以光肩星天牛保幼激素環(huán)氧水解酶為模板建模,結(jié)果(圖7)顯示JHEH1序列與其同源性為63.76%,JHEH1-2序列與其同源性為62.09%。

    2.4蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2基因表達分析

    蜂巢小甲蟲成蟲不同時期卵巢的RT-qPCR結(jié)果(圖8)顯示,JHEH1和JHEH1-2均在未出土成蟲的卵巢中處于高水平表達狀態(tài)。從1日齡到3日齡,兩基因表達量均呈先下降再上升然后再下降的趨勢。JHEH1表達量在1日齡最低,JHEH1-2表達量在3日齡時最低。

    蜂巢小甲蟲未出土成蟲不同組織的RT-qPCR結(jié)果(圖9)顯示,兩個基因在5種組織中的表達有較大差異。JHEH1在卵巢和脂肪體中的相對表達量顯著高于頭、胸和足(Plt;0.05);JHEH1-2在卵巢中的相對表達量最高,顯著高于其他組織(Plt;0.05)。

    3討論與結(jié)論

    JH在昆蟲的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,參與昆蟲變態(tài)、發(fā)育、繁殖和滯育等生命活動。JHEH是JH的重要水解酶之一,通過影響昆蟲體內(nèi)的JH滴度調(diào)控昆蟲的蛻皮、繁殖、滯育和變態(tài)。本研究對蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2基因序列的分析表明,它們均屬于環(huán)氧化物水解酶蛋白家族,具有JHEH的典型結(jié)構(gòu)特征,并且N-末端包含氨基酸組成的疏水性信號肽序列,編碼的蛋白疏水性較強,與已報道的昆蟲JHEH特征基本一致。通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析表明,蜂巢小甲蟲JHEH1與同為鞘翅目的光肩星天牛JHEH聚為一支,說明鞘翅目內(nèi)的昆蟲親緣關(guān)系較近。蜂巢小甲蟲JHEH1編碼的氨基酸全部位于細(xì)胞內(nèi)側(cè),JHEH1-2編碼的氨基酸跨膜分布,與疏水性預(yù)測的結(jié)果高度吻合。蜂巢小甲蟲JHEH蛋白的二級結(jié)構(gòu)為α螺旋/β折疊型,以α螺旋為主。用SWISS-MODEL同源建模的方法構(gòu)建蜂巢小甲蟲JHEH的模擬三維結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2與光肩星天牛JHEH的結(jié)構(gòu)相似度較高。

    JHEH基因在昆蟲體內(nèi)的表達具有明顯的組織特異性?,F(xiàn)有研究表明,馬鈴薯甲蟲LdJHEH1和LdJHEH2在所有檢測組織中均有表達,且Ld-JHEH1在胸肌、前腸、中腸、后腸高表達,LdJHEH2在腦-心-偶體復(fù)合體、后腸、馬氏管、雌性卵巢內(nèi)高表達;橘小實蠅BdJHEH2在脂肪體內(nèi)高表達,而BdJHEH3在馬氏管內(nèi)高表達;黏蟲Bd-JHEH2在體壁和脂肪體中高表達;九香蟲AcJHEH在脂肪體中表達量最高,其次為卵巢、精巢和中腸。本研究中,蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2在成蟲卵巢內(nèi)的表達量均顯著高于頭、胸和足,此外,JHEH1還在脂肪體中較高表達,JHEH1-2在胸部較高表達。這些結(jié)果表明,JHEH在昆蟲不同組織中均有降解JH的作用,其發(fā)揮作用的大小取決于物種的種類。此外,JHEH基因的表達量在昆蟲不同發(fā)育階段也存在顯著差異,如JHEH在意大利蝗卵早期發(fā)育階段呈現(xiàn)出先快速上升再下降的趨勢;九香蟲4~5齡若蟲體內(nèi)JHEH表達量較高,而七星瓢蟲JHEH在初羽化的成蟲體內(nèi)表達量較高。JHEH1和JHEH2在馬鈴薯甲蟲幼蟲各個齡期也均有表達,在4齡幼蟲孵化后32h表達量達到峰值。本研究中,JHEH1和JHEH1-2均在早期未出土成蟲的卵巢中表達量較高,推斷它們在蜂巢小甲蟲卵巢的發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用。

    JH是昆蟲特有的性激素,在調(diào)節(jié)發(fā)育和生殖成熟的生理過程中發(fā)揮重要作用,干擾其生物合成或降解過程中重要基因的功能,一直都被認(rèn)為是代替非靶向化學(xué)殺蟲劑的有效策略。JHEH是降解JH的關(guān)鍵酶,抑制其活性可以改變昆蟲體內(nèi)JH滴度,從而擾亂昆蟲的生理。當(dāng)前已有粉紋夜蛾和煙草天蛾JHEH特異性酶抑制劑的報道?;谶@些抑制劑對昆蟲內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響,可將它們作為潛在的可用于農(nóng)業(yè)的新型殺蟲劑。

    綜上所述,通過生物信息學(xué)分析,蜂巢小甲蟲JHEH1和JHEH1-2基因具有降解JH的功能,且在早期未出土成蟲卵巢內(nèi)高表達,說明JHEH在蜂巢小甲蟲的生殖過程中發(fā)揮重要作用。該研究可為進一步利用RNA干擾技術(shù)研究蜂巢小甲蟲JHEH的功能奠定基礎(chǔ),為蜂巢小甲蟲綠色防控產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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