轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米LG11中m2cryAb-vip3A融合基因及其蛋白的表達(dá)分析

關(guān)鍵詞：m2cryAb-vip3A；表達(dá)模式：轉(zhuǎn)基因：玉米

中圖分類號(hào)：S513：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）06-0025-05

玉米是我國(guó)主要的糧食作物之一，用途廣泛，包括食用、飼用、種用和工業(yè)用途等，在國(guó)家糧食安全和農(nóng)產(chǎn)品有效供給方面占重要地位。蟲害是影響我國(guó)玉米產(chǎn)量及品質(zhì)的重要問題之一。其中，亞洲玉米螟是危害我國(guó)玉米生產(chǎn)的主要生物脅迫因素之一，常年發(fā)生面積在2000萬(wàn)hm²以上。轉(zhuǎn)Bt基因玉米因其特定且高效的殺蟲效果深受種植者歡迎，不僅能減少化學(xué)殺蟲劑的使用，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，還能提高農(nóng)民收入。因此，培育抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新品種具有非常廣闊的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)潛力。

轉(zhuǎn)基因作物中外源Bt基因具有明顯的組織器官和時(shí)空表達(dá)變化規(guī)律，并且受地域和環(huán)境等非生物因素影響?？瓜x轉(zhuǎn)基因作物中殺蟲蛋白的表達(dá)量對(duì)抗蟲效果至關(guān)重要，因此，研究外源Bt基因在不同生育時(shí)期和不同組織器官中的時(shí)空表達(dá)模式，準(zhǔn)確定量殺蟲蛋白的表達(dá)，對(duì)于抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化后的害蟲抗性治理和農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理具有重要意義。

LG11轉(zhuǎn)化體是通過轉(zhuǎn)基因方法將山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院研發(fā)的新型抗蟲融合基因m2cryAb-vip3A和bar基因串聯(lián)導(dǎo)人受體材料，并以骨干自交系昌7-2為回交親本進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，獲得的抗蟲耐除草劑且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因玉米新材料：所使用的抗蟲蛋白是利用人工合成方法將設(shè)計(jì)優(yōu)化的CrylAb和Vip3Aa蛋白的主要結(jié)構(gòu)域組合形成的新型抗蟲融合蛋白M2cryAb-vip3A，因這兩種殺蟲蛋白在進(jìn)化上沒有同源性且殺蟲機(jī)理存在差別，能有效降低靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗性的幾率，擴(kuò)大殺蟲譜，增強(qiáng)對(duì)玉米主要害蟲的抗性。通過抗蟲性分析發(fā)現(xiàn)，LG11轉(zhuǎn)化體對(duì)靶標(biāo)害蟲亞洲玉米螟、草地貪夜蛾等高抗。為明確LG11轉(zhuǎn)化體中m2cryAb-vip3A基因及其編碼的蛋白的表達(dá)變化規(guī)律，本研究以LG11轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹?-2為對(duì)象，采用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）全面分析LG11轉(zhuǎn)化體不同生育時(shí)期、不同組織器官中m2cryAb-vip3A基因及其編碼的蛋白的表達(dá)變化規(guī)律，以期為加快轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米育種進(jìn)程和明確抗蟲機(jī)理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米材料為山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主研發(fā)的新型抗蟲耐除草劑優(yōu)良轉(zhuǎn)化體LG11的BC₄F₂代（自交2代回交4代）和BC₅F₂（自交2代回交5代）兩個(gè)連續(xù)世代植株，以非轉(zhuǎn)基因受體材料昌7-2為對(duì)照。

1.2樣本采集

選取BC₄F₂代和B₅F₂代LG11轉(zhuǎn)化體植株，分別取苗期的根、莖、葉，吐絲期的根、莖、花絲和花粉，成熟期的根、莖、葉、籽粒和苞葉等組織樣品，每3株為一個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA提取和qRT-PCR分析

利用多糖多酚總RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取各樣品的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）說(shuō)明書完成cDNA的合成和純化。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（ qRT-PCR）方法進(jìn)行定量檢測(cè)。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)m2cryAb-vip3A的qRT-PCR特異引物F：5′- GTTTCCTTTAC-CGGGGACGA -3′：R：5′-ACCACCCCCTTCAACT-TCAG-3′。以玉米zSSHb基因作為內(nèi)參基因。內(nèi)參基因引物序列為F：5′-CGGTGGATGCTAAG-GCTG -3′;R：AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′。