番茄LeGlyⅠ基因的生物信息學特征與表達模式分析

關鍵詞：LeGlyⅠ基因：番茄；生物信息學分析；氧化脅迫：基因表達：亞細胞定位

中圖分類號：S641.2：Q786 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）06-0001-06

番茄（Solanum lycopersicum L.）是一年生或多年生草本植物，屬于雙子葉植物綱茄科茄屬。番茄果實有很高的營養(yǎng)和經(jīng)濟價值，不僅富含鉀、鈣、鎂等礦物質(zhì)和多種維生素等營養(yǎng)成分，而且風味獨特，可蔬菜和水果兼用，在全球廣泛種植，是重要的經(jīng)濟作物。但在自然條件下，番茄植株的生長發(fā)育易遭受各種逆境脅迫，導致產(chǎn)量和經(jīng)濟效益降低。因此，研究抗逆機制，挖掘抗逆基因，選育抗逆品種，對于保障番茄高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效生產(chǎn)具有重要意義。

逆境脅迫主要分為生物脅迫和非生物脅迫。當遭受逆境脅迫時，植物體內(nèi)會過量累積活性氧（ROS）、甲基乙二醛（MG）等有害物質(zhì)，造成代謝紊亂，損傷生物膜系統(tǒng)，從而影響植株生長發(fā)育。研究表明，植物體內(nèi)的乙二醛酶（glyoxalase，Gly）系統(tǒng)能夠通過酶促反應將醛類有毒化合物轉化為無毒代謝物，降低過量MG對植物細胞的損傷，維持植物體的正常狀態(tài)。Gly系統(tǒng)包含協(xié)同作用的GlyⅠ和GlyⅡ，以及獨立反應的Gly Ⅲ。GlyⅠ又稱作乳酰谷胱甘肽裂解酶（lactoylglutathione lyase），是Gly系統(tǒng)中發(fā)揮作用的第一個酶，其主要以谷胱甘肽為底物，催化MG轉化為S-D-乳酰谷胱甘肽，從而降低MG的生理活性濃度。許多植物的研究都表明GlyⅠ能夠參與抵御多種非生物脅迫，如：蕓苔屬GlyⅠ基因在煙草中的異源表達可以增強煙株對MG和高鹽的耐受性；GlyⅠ基因在黑豆中過表達后也能使植株獲得耐鹽性：將小麥GlyⅠ基因和水稻OsGLYⅠ-11.2基因在煙草中異位表達，都能使煙株獲得對多種非生物脅迫和重金屬毒性的耐受性；過表達OsGlyl基因可提高水稻的非生物耐受力和籽粒產(chǎn)量；過表達玉米ZmGLYI-8基因能增強擬南芥苗期對干旱和鹽脅迫的耐受性。可見，GlyⅠ基因參與了植物對多種逆境的抵抗，但有關其在番茄中的功能研究鮮有報道。

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在番茄遭受多種非生物脅迫前后，LeGlyⅠ基因的表達量有所差異，推測該基因參與了番茄抵抗多種非生物脅迫的過程。為進一步研究該基因在番茄抵御非生物脅迫中的功能，本研究從番茄葉片中克隆了LeGlyⅠ基因，分析了其生物信息學特征、組織表達特性及在Mv模擬氧化脅迫下的表達情況，并對其進行了亞細胞定位分析，以期為深入研究Le GlyⅠ基因在番茄抵御逆境脅迫中的分子機制和選育抗逆品種提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1植物材料及試驗處理方法

本試驗所用番茄品種為野生型番茄‘Heinz1706’。種子經(jīng)28℃恒溫催芽后，于2021年9月30日將其定植于裝有育苗基質(zhì)（營養(yǎng)土與蛭石的比例為3：1）的穴盤中，于光照培養(yǎng)箱中在25℃光照18h、18℃黑暗6h、濕度60%、光照12000lx條件下培養(yǎng)。

于2021年11月10日取六葉一心番茄的根、莖、葉在液氮中速凍后-80℃保存，用于LeGlyⅠ基因的組織表達分析。2021年11月15日選取六葉一心期長勢良好且一致的番茄幼苗，用20μmol/L Mv水溶液進行灌根處理，以清水灌根作為對照，分別在處理0、2、4、8、12、24、48 h取相同部位的番茄葉片，液氮速凍后-80℃保存，用于分析氧化脅迫對Le GlyⅠ基因表達的影響。

1.2LeGlyⅠ基因的克隆

取番茄葉片材料，經(jīng)液氮研磨后，采用Trizol法提取總RNA，并用HiScriptⅡQ RT SuperMixfor qPCR（+g DNA wiper）試劑盒（Vazymme^TM）反轉錄合成cDNA。以獲得的番茄cDNA為模板，用DNA Club設計引物（表1）進行擴增。PCR反應體系（50μL）：cDNA模板4μL，2×Phanta FlashMaster Mix 25μL，前后引物各2μL，ddH₂O 17μL。PCR反應程序：98℃預變性30s;98℃變性10s，52℃（Tm值）退火5s，72℃延伸4s，共35個循環(huán)；72℃后延伸1min。反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，約25 min后觀察目的條帶，拍照并回收：將膠回收得到的目的片段與克隆載體pMD19-T連接，轉人大腸桿菌DH5α，篩選陽性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 LeGly Ⅰ蛋白的生物信息學分析

利用NCBI（https：//www.ncbi. nlm，nih.gov/）進行序列查詢；采用SWISS-MODEL網(wǎng)站（ht-tps：//swissmodel.expasy.org/）對蛋白三維結構進行預測；利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）對蛋白理化性質(zhì)進行分析；利用Con-served Domain（https：//www. ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對蛋白結構域進行分析；利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行啟動子分析；利用CELLO（http：//cello.life. nctu. edu.tw/）進行亞細胞定位預測。

1.4 LeGlyⅠ的亞細胞定位分析

利用Bam HⅠ和KpnⅠ兩種限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒DNA進行雙酶切，將酶切的目的基因片段連接到含有GFP（綠色熒光蛋白）標簽的融合表達載體pROKⅡ-GFP上，轉化到農(nóng)桿菌LBA4404菌株中。取200μL含有目的片段的農(nóng)桿菌菌液，加到10 mL YEP液體培養(yǎng)基（每百毫升含1g胰蛋白胨、一g酵母粉、0.5 g NaCl）中，28℃、200r/min搖床培養(yǎng)12 h：取1 mL培養(yǎng)后的菌液以及10mLYEP液體培養(yǎng)基相同條件下進行二次活化：在YEP誘導液（含MES、MgCl₂、AS）中加入1 mL二次活化過的農(nóng)桿菌菌液，28℃、200r/min培養(yǎng)4～5h；培養(yǎng)完成后，收集菌體，調(diào)OD_600nm=1.5，黑暗條件下28℃靜置3h：等比例混合含有目的基因的重懸液和P19（沉默抑制因子）重懸液，注射在煙草葉片背面；室溫培養(yǎng)3d，撕下葉片表皮，利用激光共聚焦顯微鏡觀察亞細胞定位。

1.5 Le GlyⅠ基因表達分析

利用Biosharp公司的SYBR Green qPCR Mix試劑盒檢測LeGlyⅠ基因表達情況，每組樣品進行3次生物學重復，采用2^-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。運用GraphPad Prism 6.01軟件進行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2結果與分析

2.1 LeGlyⅠ基因的克隆

以野生型番茄品種‘Heinz 1706’的cDNA為模板進行PCR擴增，獲得了489 bp的條帶（圖1A）。連接克隆載體pMD19-T并轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性質(zhì)粒測序，測序結果表明該基因包含489 bp的CDS序列，得到了與預期結果完全匹配的陽性質(zhì)粒。

2.2 LeGlyⅠ蛋白的生物信息學分析

2.2.1LeGlyⅠ蛋白理化性質(zhì) LeGlyⅠ共編碼162個氨基酸，蛋白分子式為C₇₉₈ H₁₂₂₆N₂₁₄O₂₃₅S₄，分子量為17706.05 Da，等電點為6.51，親水性平均值（GRAVY）為-0.386，不穩(wěn)定系數(shù)為39.32，疏水性分析結果顯示最大值為1.400、最小值為-2.756（圖2A），預測為親水性穩(wěn)定蛋白，其三維結構見圖2B。保守結構域分析結果發(fā)現(xiàn)，在第25～151個氨基酸處存在一個VOC-like結構域（圖2C）；該結構域存在于多種金屬蛋白中，而此類蛋白的激活需要結合金屬離子，該結構域中即具有2～3個開放或容易接近配位位點的金屬配位環(huán)境，能夠促進催化反應中金屬離子的直接親電參與。

2.2.2 LeGlyⅠ的系統(tǒng)進化分析 利用MEGA 5.0軟件，將LeGlyl蛋白序列與其他物種的GlyⅠ蛋白序列構建系統(tǒng)進化樹，進化樹分析表明LeGly Ⅰ蛋白與Lactuca sativa（萵苣）、Solanum verrucosum（野生馬鈴薯）、Solanum pennellii（野生番茄）的GlyⅠ同源性最高（圖3）。

2.2.3 LeGlyⅠ啟動子順式作用元件分析 利用在線軟件PlantCare分析Le GlyⅠ基因上游2000bp的啟動子序列，發(fā)現(xiàn)其中包含多種順式作用元件，包括無氧誘導響應元件、光響應元件、低溫響應元件、干旱響應元件以及茉莉酸甲酯、脫落酸、生長素、赤霉素等激素響應元件（表2）。

2.3LeGlyⅠ在不同器官中的表達模式分析

利用qRT-PCR對野生番茄不同器官中的LeGlyⅠ基因表達量進行測定，結果（圖4）顯示，LeGlyⅠ基因在番茄的根、莖、葉中均有表達，且在葉中的表達量最高，是莖中的4.7倍，是根中的8.7倍，差異達顯著水平。

2.4 LeGlyⅠ在Mv模擬氧化脅迫下的表達分析

利用qRT-PCR對Mv模擬氧化脅迫處理不同時間后番茄葉片中的Le GlyⅠ基因表達量進行測定，結果（圖5）顯示，LeGlyⅠ基因受到氧化脅迫的誘導表達，在氧化脅迫處理8h和12 h時顯著上調(diào)表達，表達量分別是對照的2.8倍、3.1倍；在24h時表達量最低。

2.5 LeGlyⅠ的亞細胞定位分析

CELLO預測發(fā)現(xiàn)LeGlyⅠ可能存在于線粒體和過氧化物酶體中。通過構建LeGlyⅠ-GFP融合表達載體，轉化農(nóng)桿菌LBA4404，與融合了RFP的線粒體marker共侵染本生煙葉片，通過激光共聚焦顯微鏡觀察到細胞中線粒體和細胞核均有比較強的熒光信號，且GFP信號與RFP信號高度重合（圖6）。證明LeGlyⅠ定位在番茄細胞的線粒體與細胞核上。

3討論與結論

Glyl作為清除MG系統(tǒng)中第一個作用酶，在植物抵抗多種非生物脅迫時發(fā)揮重要作用。本研究成功在番茄葉片中克隆出LeGlyⅠ基因，通過生物學信息分析，LeGlyⅠ基因CDS全長為489bp，共編碼162個氨基酸，蛋白預測為親水性穩(wěn)定蛋白。Gly Ⅰ作為金屬酶類，需要金屬離子作為輔因子發(fā)揮功能，通過保守結構域分析發(fā)現(xiàn)存在VOC-like結構域。

GlyⅠ廣泛存在于各類生物中，GlyⅠ基因表達具有組織特異性。例如在蕓薹屬（Brassica）植物中，GlyⅠ在種子、根、下胚軸、子葉和花中均有表達，但主要在子葉中表達：玉米ZmGLyⅠ-8基因在根、莖、葉中均有表達，但在葉中的表達量最高，根中最低。本研究結果也顯示Le GlyⅠ基因在番茄根、莖、葉中均有表達，且在葉中的表達量顯著高于莖和根中，根中的表達量最低?？梢姡珿lyⅠ的器官分布在不同物種間存在相似性。研究表明，GlyⅠ在亞細胞定位上存在一定種間差異，玉米ZmGLYⅠ-8在細胞質(zhì)中定位，水稻OsGLYⅠ-8、擬南芥AtGLYⅠ-2蛋白均被發(fā)現(xiàn)定位于細胞核中。本研究發(fā)現(xiàn)，番茄LeGlyⅠ定位在線粒體和細胞核中，推測其可能主要在線粒體和細胞核中發(fā)揮功能。

MG與ROS的代謝調(diào)控密切相關。逆境脅迫誘導的MG水平上升可以通過抗氧化酶失活、GSH（谷胱甘肽）競爭、脂質(zhì)過氧化等方式促使ROS積累，引發(fā)植物細胞氧化損傷：而MG和ROS水平的上升又可反饋激活Gly的過量表達，進而通過蛋白互作等方式提高抗氧化酶活性，來降低ROS水平，從而提高植物抗逆境脅迫的能力。本研究結果顯示，LeGlyⅠ基因的表達量在Mv模擬氧化脅迫處理8、12 h顯著上升，24 h顯著下降，表明其參與了番茄植株對氧化脅迫的應答。

綜上，LeGlyⅠ基因在番茄抵抗氧化脅迫過程中發(fā)揮了重要作用，這為后續(xù)深入研究Gly參與抵抗非生物脅迫以及提高番茄抗逆能力提供理論參考依據(jù)。