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    番茄LeGlyⅠ基因的生物信息學(xué)特征與表達(dá)模式分析

    2024-08-22 00:00:00孫曉輝張?jiān)虏?/span>蔣健石勇志孫秀東
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2024年6期

    關(guān)鍵詞:LeGlyⅠ基因:番茄;生物信息學(xué)分析;氧化脅迫:基因表達(dá):亞細(xì)胞定位

    中圖分類號(hào):S641.2:Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2024)06-0001-06

    番茄(Solanum lycopersicum L.)是一年生或多年生草本植物,屬于雙子葉植物綱茄科茄屬。番茄果實(shí)有很高的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,不僅富含鉀、鈣、鎂等礦物質(zhì)和多種維生素等營(yíng)養(yǎng)成分,而且風(fēng)味獨(dú)特,可蔬菜和水果兼用,在全球廣泛種植,是重要的經(jīng)濟(jì)作物。但在自然條件下,番茄植株的生長(zhǎng)發(fā)育易遭受各種逆境脅迫,導(dǎo)致產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益降低。因此,研究抗逆機(jī)制,挖掘抗逆基因,選育抗逆品種,對(duì)于保障番茄高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效生產(chǎn)具有重要意義。

    逆境脅迫主要分為生物脅迫和非生物脅迫。當(dāng)遭受逆境脅迫時(shí),植物體內(nèi)會(huì)過量累積活性氧(ROS)、甲基乙二醛(MG)等有害物質(zhì),造成代謝紊亂,損傷生物膜系統(tǒng),從而影響植株生長(zhǎng)發(fā)育。研究表明,植物體內(nèi)的乙二醛酶(glyoxalase,Gly)系統(tǒng)能夠通過酶促反應(yīng)將醛類有毒化合物轉(zhuǎn)化為無毒代謝物,降低過量MG對(duì)植物細(xì)胞的損傷,維持植物體的正常狀態(tài)。Gly系統(tǒng)包含協(xié)同作用的GlyⅠ和GlyⅡ,以及獨(dú)立反應(yīng)的Gly Ⅲ。GlyⅠ又稱作乳酰谷胱甘肽裂解酶(lactoylglutathione lyase),是Gly系統(tǒng)中發(fā)揮作用的第一個(gè)酶,其主要以谷胱甘肽為底物,催化MG轉(zhuǎn)化為S-D-乳酰谷胱甘肽,從而降低MG的生理活性濃度。許多植物的研究都表明GlyⅠ能夠參與抵御多種非生物脅迫,如:蕓苔屬GlyⅠ基因在煙草中的異源表達(dá)可以增強(qiáng)煙株對(duì)MG和高鹽的耐受性;GlyⅠ基因在黑豆中過表達(dá)后也能使植株獲得耐鹽性:將小麥GlyⅠ基因和水稻OsGLYⅠ-11.2基因在煙草中異位表達(dá),都能使煙株獲得對(duì)多種非生物脅迫和重金屬毒性的耐受性;過表達(dá)OsGlyl基因可提高水稻的非生物耐受力和籽粒產(chǎn)量;過表達(dá)玉米ZmGLYI-8基因能增強(qiáng)擬南芥苗期對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性??梢?,GlyⅠ基因參與了植物對(duì)多種逆境的抵抗,但有關(guān)其在番茄中的功能研究鮮有報(bào)道。

    我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),在番茄遭受多種非生物脅迫前后,LeGlyⅠ基因的表達(dá)量有所差異,推測(cè)該基因參與了番茄抵抗多種非生物脅迫的過程。為進(jìn)一步研究該基因在番茄抵御非生物脅迫中的功能,本研究從番茄葉片中克隆了LeGlyⅠ基因,分析了其生物信息學(xué)特征、組織表達(dá)特性及在Mv模擬氧化脅迫下的表達(dá)情況,并對(duì)其進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析,以期為深入研究Le GlyⅠ基因在番茄抵御逆境脅迫中的分子機(jī)制和選育抗逆品種提供理論依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1植物材料及試驗(yàn)處理方法

    本試驗(yàn)所用番茄品種為野生型番茄‘Heinz1706’。種子經(jīng)28℃恒溫催芽后,于2021年9月30日將其定植于裝有育苗基質(zhì)(營(yíng)養(yǎng)土與蛭石的比例為3:1)的穴盤中,于光照培養(yǎng)箱中在25℃光照18h、18℃黑暗6h、濕度60%、光照12000lx條件下培養(yǎng)。

    于2021年11月10日取六葉一心番茄的根、莖、葉在液氮中速凍后-80℃保存,用于LeGlyⅠ基因的組織表達(dá)分析。2021年11月15日選取六葉一心期長(zhǎng)勢(shì)良好且一致的番茄幼苗,用20μmol/L Mv水溶液進(jìn)行灌根處理,以清水灌根作為對(duì)照,分別在處理0、2、4、8、12、24、48 h取相同部位的番茄葉片,液氮速凍后-80℃保存,用于分析氧化脅迫對(duì)Le GlyⅠ基因表達(dá)的影響。

    1.2LeGlyⅠ基因的克隆

    取番茄葉片材料,經(jīng)液氮研磨后,采用Trizol法提取總RNA,并用HiScriptⅡQ RT SuperMixfor qPCR(+g DNA wiper)試劑盒(VazymmeTM)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以獲得的番茄cDNA為模板,用DNA Club設(shè)計(jì)引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50μL):cDNA模板4μL,2×Phanta FlashMaster Mix 25μL,前后引物各2μL,ddH2O 17μL。PCR反應(yīng)程序:98℃預(yù)變性30s;98℃變性10s,52℃(Tm值)退火5s,72℃延伸4s,共35個(gè)循環(huán);72℃后延伸1min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,約25 min后觀察目的條帶,拍照并回收:將膠回收得到的目的片段與克隆載體pMD19-T連接,轉(zhuǎn)人大腸桿菌DH5α,篩選陽性菌落送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

    1.3 LeGly Ⅰ蛋白的生物信息學(xué)分析

    利用NCBI(https://www.ncbi. nlm,nih.gov/)進(jìn)行序列查詢;采用SWISS-MODEL網(wǎng)站(ht-tps://swissmodel.expasy.org/)對(duì)蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè);利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)對(duì)蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析;利用Con-served Domain(https://www. ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析;利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行啟動(dòng)子分析;利用CELLO(http://cello.life. nctu. edu.tw/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

    1.4 LeGlyⅠ的亞細(xì)胞定位分析

    利用Bam HⅠ和KpnⅠ兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切,將酶切的目的基因片段連接到含有GFP(綠色熒光蛋白)標(biāo)簽的融合表達(dá)載體pROKⅡ-GFP上,轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404菌株中。取200μL含有目的片段的農(nóng)桿菌菌液,加到10 mL YEP液體培養(yǎng)基(每百毫升含1g胰蛋白胨、一g酵母粉、0.5 g NaCl)中,28℃、200r/min搖床培養(yǎng)12 h:取1 mL培養(yǎng)后的菌液以及10mLYEP液體培養(yǎng)基相同條件下進(jìn)行二次活化:在YEP誘導(dǎo)液(含MES、MgCl2、AS)中加入1 mL二次活化過的農(nóng)桿菌菌液,28℃、200r/min培養(yǎng)4~5h;培養(yǎng)完成后,收集菌體,調(diào)OD600nm=1.5,黑暗條件下28℃靜置3h:等比例混合含有目的基因的重懸液和P19(沉默抑制因子)重懸液,注射在煙草葉片背面;室溫培養(yǎng)3d,撕下葉片表皮,利用激光共聚焦顯微鏡觀察亞細(xì)胞定位。

    1.5 Le GlyⅠ基因表達(dá)分析

    利用Biosharp公司的SYBR Green qPCR Mix試劑盒檢測(cè)LeGlyⅠ基因表達(dá)情況,每組樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù),采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。運(yùn)用GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

    2結(jié)果與分析

    2.1 LeGlyⅠ基因的克隆

    以野生型番茄品種‘Heinz 1706’的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了489 bp的條帶(圖1A)。連接克隆載體pMD19-T并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選陽性質(zhì)粒測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明該基因包含489 bp的CDS序列,得到了與預(yù)期結(jié)果完全匹配的陽性質(zhì)粒。

    2.2 LeGlyⅠ蛋白的生物信息學(xué)分析

    2.2.1LeGlyⅠ蛋白理化性質(zhì) LeGlyⅠ共編碼162個(gè)氨基酸,蛋白分子式為C798 H1226N214O235S4,分子量為17706.05 Da,等電點(diǎn)為6.51,親水性平均值(GRAVY)為-0.386,不穩(wěn)定系數(shù)為39.32,疏水性分析結(jié)果顯示最大值為1.400、最小值為-2.756(圖2A),預(yù)測(cè)為親水性穩(wěn)定蛋白,其三維結(jié)構(gòu)見圖2B。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),在第25~151個(gè)氨基酸處存在一個(gè)VOC-like結(jié)構(gòu)域(圖2C);該結(jié)構(gòu)域存在于多種金屬蛋白中,而此類蛋白的激活需要結(jié)合金屬離子,該結(jié)構(gòu)域中即具有2~3個(gè)開放或容易接近配位位點(diǎn)的金屬配位環(huán)境,能夠促進(jìn)催化反應(yīng)中金屬離子的直接親電參與。

    2.2.2 LeGlyⅠ的系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用MEGA 5.0軟件,將LeGlyl蛋白序列與其他物種的GlyⅠ蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)化樹分析表明LeGly Ⅰ蛋白與Lactuca sativa(萵苣)、Solanum verrucosum(野生馬鈴薯)、Solanum pennellii(野生番茄)的GlyⅠ同源性最高(圖3)。

    2.2.3 LeGlyⅠ啟動(dòng)子順式作用元件分析 利用在線軟件PlantCare分析Le GlyⅠ基因上游2000bp的啟動(dòng)子序列,發(fā)現(xiàn)其中包含多種順式作用元件,包括無氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、干旱響應(yīng)元件以及茉莉酸甲酯、脫落酸、生長(zhǎng)素、赤霉素等激素響應(yīng)元件(表2)。

    2.3LeGlyⅠ在不同器官中的表達(dá)模式分析

    利用qRT-PCR對(duì)野生番茄不同器官中的LeGlyⅠ基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果(圖4)顯示,LeGlyⅠ基因在番茄的根、莖、葉中均有表達(dá),且在葉中的表達(dá)量最高,是莖中的4.7倍,是根中的8.7倍,差異達(dá)顯著水平。

    2.4 LeGlyⅠ在Mv模擬氧化脅迫下的表達(dá)分析

    利用qRT-PCR對(duì)Mv模擬氧化脅迫處理不同時(shí)間后番茄葉片中的Le GlyⅠ基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果(圖5)顯示,LeGlyⅠ基因受到氧化脅迫的誘導(dǎo)表達(dá),在氧化脅迫處理8h和12 h時(shí)顯著上調(diào)表達(dá),表達(dá)量分別是對(duì)照的2.8倍、3.1倍;在24h時(shí)表達(dá)量最低。

    2.5 LeGlyⅠ的亞細(xì)胞定位分析

    CELLO預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LeGlyⅠ可能存在于線粒體和過氧化物酶體中。通過構(gòu)建LeGlyⅠ-GFP融合表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404,與融合了RFP的線粒體marker共侵染本生煙葉片,通過激光共聚焦顯微鏡觀察到細(xì)胞中線粒體和細(xì)胞核均有比較強(qiáng)的熒光信號(hào),且GFP信號(hào)與RFP信號(hào)高度重合(圖6)。證明LeGlyⅠ定位在番茄細(xì)胞的線粒體與細(xì)胞核上。

    3討論與結(jié)論

    Glyl作為清除MG系統(tǒng)中第一個(gè)作用酶,在植物抵抗多種非生物脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。本研究成功在番茄葉片中克隆出LeGlyⅠ基因,通過生物學(xué)信息分析,LeGlyⅠ基因CDS全長(zhǎng)為489bp,共編碼162個(gè)氨基酸,蛋白預(yù)測(cè)為親水性穩(wěn)定蛋白。Gly Ⅰ作為金屬酶類,需要金屬離子作為輔因子發(fā)揮功能,通過保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)存在VOC-like結(jié)構(gòu)域。

    GlyⅠ廣泛存在于各類生物中,GlyⅠ基因表達(dá)具有組織特異性。例如在蕓薹屬(Brassica)植物中,GlyⅠ在種子、根、下胚軸、子葉和花中均有表達(dá),但主要在子葉中表達(dá):玉米ZmGLyⅠ-8基因在根、莖、葉中均有表達(dá),但在葉中的表達(dá)量最高,根中最低。本研究結(jié)果也顯示Le GlyⅠ基因在番茄根、莖、葉中均有表達(dá),且在葉中的表達(dá)量顯著高于莖和根中,根中的表達(dá)量最低??梢?,GlyⅠ的器官分布在不同物種間存在相似性。研究表明,GlyⅠ在亞細(xì)胞定位上存在一定種間差異,玉米ZmGLYⅠ-8在細(xì)胞質(zhì)中定位,水稻OsGLYⅠ-8、擬南芥AtGLYⅠ-2蛋白均被發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞核中。本研究發(fā)現(xiàn),番茄LeGlyⅠ定位在線粒體和細(xì)胞核中,推測(cè)其可能主要在線粒體和細(xì)胞核中發(fā)揮功能。

    MG與ROS的代謝調(diào)控密切相關(guān)。逆境脅迫誘導(dǎo)的MG水平上升可以通過抗氧化酶失活、GSH(谷胱甘肽)競(jìng)爭(zhēng)、脂質(zhì)過氧化等方式促使ROS積累,引發(fā)植物細(xì)胞氧化損傷:而MG和ROS水平的上升又可反饋激活Gly的過量表達(dá),進(jìn)而通過蛋白互作等方式提高抗氧化酶活性,來降低ROS水平,從而提高植物抗逆境脅迫的能力。本研究結(jié)果顯示,LeGlyⅠ基因的表達(dá)量在Mv模擬氧化脅迫處理8、12 h顯著上升,24 h顯著下降,表明其參與了番茄植株對(duì)氧化脅迫的應(yīng)答。

    綜上,LeGlyⅠ基因在番茄抵抗氧化脅迫過程中發(fā)揮了重要作用,這為后續(xù)深入研究Gly參與抵抗非生物脅迫以及提高番茄抗逆能力提供理論參考依據(jù)。

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