柚皮素抗腫瘤作用的研究進(jìn)展

王 丹，彭 莉，周燕紅

1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100

2.湖北科技學(xué)院五官醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100

腫瘤是嚴(yán)重影響全球人民身體健康的主要疾病之一[1]。隨著人口老齡化不斷增長，以及越來越多不良生活方式，如吸煙、缺乏鍛煉和不健康的食物等，全球各國的腫瘤負(fù)擔(dān)不斷增加。雖然癌癥預(yù)防、檢測和治療的技術(shù)不斷進(jìn)步和發(fā)展，使其死亡率有所下降，但目前常規(guī)腫瘤治療方法和手段，如化療和放療，往往會導(dǎo)致嚴(yán)重毒副作用的發(fā)生。目前腫瘤研究的目標(biāo)之一是開發(fā)對人體危害較小的新療法和新藥物。因此近年來天然產(chǎn)物備受關(guān)注。

柚皮素是從薔薇科植物櫻花Prunus yedoensisMate.花蕾和漆樹科植物梗樹Amacardi-um occidentaleL.果實的核殼中提取分離的一種苷元，屬黃酮類化合物[2]。其化學(xué)名稱為5,7,4′-三羥基黃烷酮，相對分子質(zhì)量為272.252 78，分子式為C15H12O5，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。柚皮素是一種廣泛存在于各種水果和中草藥的黃酮類化合物[3]，如橙子、番茄皮、枳實、石斛、枳殼等。柚皮素可溶解于有機溶劑，如乙醇、二甲基甲酰胺和二甲基亞砜，微溶于水。隨著藥物包封材料的發(fā)展和制備工藝的改進(jìn)，柚皮素被發(fā)現(xiàn)具有多種生物活性，如抗癌、抗突變、抗炎、抗氧化、抗增殖和抗動脈粥樣硬化等[4]。近年來，有大量文獻(xiàn)報道柚皮素在抗腫瘤方面有良好的活性，本文對柚皮素抗腫瘤作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

圖1 柚皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of naringenin

1 抗腫瘤活性

研究表明，柚皮素對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1、G-401細(xì)胞，肺癌H23細(xì)胞，人大腸癌HT-29、SW1116、SW837細(xì)胞，人腦膠質(zhì)瘤U251-MG、LNZ308細(xì)胞，人胎盤絨毛膜癌JAR、JEG3細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞具有良好的抑制作用，并呈時間-劑量相關(guān)性。近幾年，柚皮素的抗腫瘤作用成為研究熱點，新靶點和通路的發(fā)現(xiàn)為其在臨床癌癥治療中的早期應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

1.1 抗乳腺癌活性

研究表明，腫瘤細(xì)胞增殖減少和凋亡增加是抗腫瘤活性的重要標(biāo)志[5]。Zhao等[6]研究顯示，柚皮素抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，調(diào)控細(xì)胞周期，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，并誘導(dǎo)其凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[5]，柚皮素可增強含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-3/7活性，并加速DNA的分解，這些效應(yīng)均呈濃度相關(guān)性；體內(nèi)研究也表明，柚皮素（10 mg/kg）顯著增強了Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）、Caspase-3、Caspase-9、抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤蛋白2（B-cell lymphoma protein 2，Bcl-2）和Bcl-2同源剪接變異體（Bcl-2 homologue splice variants，Bcl-xL）的蛋白水平，這表明柚皮素可以促進(jìn)乳腺癌凋亡。通過驗證各種抗氧化酶的水平表明柚皮素可降低大鼠腦缺血再灌注損傷硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、蛋白質(zhì)羰基（protein carbonyl，PCO）和硝酸鹽的水平，并上調(diào)谷胱甘肽（glutathione，GSH）、維生素C（vitamin C，VC）、維生素E（vitamin E，VE）和糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptors，GR）的表達(dá)?？梢?，柚皮素可通過阻止G0/G1期細(xì)胞進(jìn)展抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，還可通過誘導(dǎo)線粒體依賴的細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

1.2 抗腎母細(xì)胞瘤活性

柚皮素在體內(nèi)、外對人腎母細(xì)胞瘤WT細(xì)胞均有抑制作用。研究表明Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）家族的關(guān)鍵成員TLR4可以激活核因子κB（nuclear factor kappaB，NF-κB），從而誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和一系列腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展[7-9]。Li等[10]研究表明柚皮素劑量和時間相關(guān)性地抑制人SK-NEP-1和G-401細(xì)胞的生長，抑制WT細(xì)胞中TLR4mRNA和蛋白的表達(dá)以及NF-κB中p65磷酸化；證實在WT細(xì)胞中，過表達(dá)TLR4部分逆轉(zhuǎn)柚皮素誘導(dǎo)的WT細(xì)胞生長抑制。在體內(nèi)，柚皮素（15、30 mg/kg）也是通過調(diào)控TLR4的表達(dá)和p65的磷酸化來抑制WT細(xì)胞的生長，與體外結(jié)果一致。由此可證明，柚皮素通過TLR4/NF-κB通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

1.3 抗肺癌活性

蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）蛋白是磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路活動的主要介質(zhì)，在大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌病例中常過度表達(dá)[11]。文獻(xiàn)報道柚皮素與放療聯(lián)合給藥能促進(jìn)H23細(xì)胞凋亡。Baruah等[12]發(fā)現(xiàn)柚皮素單獨給藥也能劑量相關(guān)性地抑制H23細(xì)胞的增殖，降低H23細(xì)胞的存活率，并進(jìn)一步顯示了柚皮素對H23細(xì)胞的化療和放射增敏潛力，增加了促氧化劑的能力；柚皮素降低了磷酸化的Akt（p-Akt）、Akt、p21蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表達(dá)，并促進(jìn)DNA的損傷。在柚皮素治療組中，Bax、Caspase-3mRNA水平升高，而Bcl-2、Bcl-xLmRNA水平降低。可見，柚皮素能通過下調(diào)Akt表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來增加肺癌細(xì)胞對輻射的敏感性。

1.4 抗大腸癌活性

柚皮素目前已制成納米乳化制劑，這種劑型更有利于藥效的發(fā)揮。近年來，柚皮素納米粒制劑在癌癥化學(xué)預(yù)防、潰瘍性結(jié)腸炎等領(lǐng)域的研究越來越多，因其在臨床應(yīng)用中具有低毒性等優(yōu)勢[13]。Raeisi等[14]發(fā)現(xiàn)，柚皮素的新制劑（納米粒）能促進(jìn)DNA斷裂、核濃縮和細(xì)胞收縮，并對腫瘤細(xì)胞壁造成高度破壞；進(jìn)一步研究證明使用Annexin VFITC/PI染色進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)制成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的柚皮素可顯著增加凋亡細(xì)胞的數(shù)量；利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)研究促凋亡和抗凋亡基因的表達(dá)，結(jié)果表明，柚皮素可降低Survivin和Bcl-2mRNA的表達(dá)。此外，在空白納米顆粒處理的HT-29細(xì)胞中證實沒有細(xì)胞毒性，半數(shù)抑制濃度（half-inhibitory concentration，IC50）為（150.00±11.04）μmol/L。Abaza等[15]研究表明，柚皮素通過促進(jìn)S期和G2/M期細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)SW1116和SW837細(xì)胞凋亡，且呈時間和劑量相關(guān)性。柚皮素可顯著下調(diào)大腸癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白基因Cdk4、Cdk6和Cdk7表達(dá)，同時顯著上調(diào)細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑基因p18、p19和p21表達(dá)。這些結(jié)果說明柚皮素可通過調(diào)控細(xì)胞周期抑制細(xì)胞生長。另外研究還發(fā)現(xiàn)促凋亡相關(guān)基因Caspases-3、7、8、9，Bak，AIF，Bax表達(dá)顯著上調(diào)；而抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2、x-IAP和c-IAP-2等表達(dá)顯著下調(diào)?？梢?，柚皮素的抗大腸癌活性是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促凋亡基因上調(diào)和抗凋亡基因下調(diào)來實現(xiàn)的。

1.5 抗膠質(zhì)瘤活性

載脂蛋白2配體（apolipoprotein 2 ligand，APO2L）可通過與死亡受體相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)[16]，柚皮素能選擇性抑制APO2L，促進(jìn)U251-MG和LNZ308細(xì)胞凋亡，抑制U251-MG和LNZ308細(xì)胞增殖；同時，柚皮素（80 μmol/L）、APO2L（30 ng/mL）或柚皮素＋APO2L處理均沒有明顯的細(xì)胞毒性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素是以通過Caspase-9和Caspase-3信號通路觸發(fā)APO2L誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。柚皮素治療組中抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL水平略有降低，而單獨使用柚皮素或柚皮素＋APO2L的聯(lián)合用藥會增加促凋亡的細(xì)胞激動劑Bad、BakmRNA水平；此外，單獨使用柚皮素或柚皮素＋APO2L聯(lián)合作用于細(xì)胞后可增強凋亡相關(guān)因子DR4、DR5、TRADD、p21和p53mRNA的表達(dá)。在小鼠體內(nèi)，單獨用柚皮素（50 mg/kg）或柚皮素＋APO2L（50 mg/kg＋100 μg）給藥時，DR4、DR5、TRADD、p21、p53mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)。由此表明，柚皮素和APO2L的聯(lián)合療法通過胱天蛋白酶和p53的信號通路激活細(xì)胞凋亡，從而在體外和體內(nèi)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。

1.6 抗人胎盤絨毛膜癌活性

Park等[17]研究表明，柚皮素可抑制人胎盤絨毛膜癌細(xì)胞的增殖和遷移。為了研究柚皮素對絨癌細(xì)胞的凋亡作用，采用TUNEL染色檢測柚皮素處理過的JAR和JEG3細(xì)胞，結(jié)果表達(dá)了很強的紅色信號，而在未處理過的絨癌組織中未檢測到信號。此外，柚皮素誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生和活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，以及JAR和JEG3細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化和谷胱甘肽的耗竭?；钚匝跽T導(dǎo)的細(xì)胞死亡效應(yīng)主要通過調(diào)節(jié)JAR和JEG3細(xì)胞中的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2-絲裂原活化蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases1/2-mitogen-activated protein kinase，ERK1/2-MAPK）和p38絲裂原激活蛋白激酶（p38 MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來實現(xiàn)。通過蛋白質(zhì)印跡分析確定了柚皮素對JAR和JEG3細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的劑量相關(guān)性作用，顯著增加了JAR和JEG3細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化。因此，結(jié)果表明柚皮素通過調(diào)控絨毛膜癌細(xì)胞的增殖和凋亡發(fā)揮抗癌活性，這使其成為治療胎盤絨毛膜癌的潛在補充劑。

柚皮素的抗腫瘤活性見表1。

表1 柚皮素的抗腫瘤活性Table 1 Antitumor activity of naringenin

2 抗腫瘤作用機制

腫瘤的發(fā)生經(jīng)歷了起始、發(fā)展和演化3個階段，而柚皮素主要從化學(xué)預(yù)防的角度控制腫瘤的起始和發(fā)展，通過實現(xiàn)抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗炎、細(xì)胞凋亡、線粒體功能等途徑來預(yù)防和治療腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

2.1 抗氧化

柚皮素具有較好的緩蝕性能，是一種化學(xué)基團(tuán)和超氧化物歧化酶的清除劑，具有清除自由基、抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、環(huán)氧合酶、脂氧合酶、黃嘌呤氧化酶和金屬離子螯合等促氧化酶活性的作用。柚皮素的抗氧化活性歸因于其結(jié)構(gòu)中的羥基，這些羥基活性氧有很高的反應(yīng)性[18]。當(dāng)促氧化活性和抗氧化防御之間的細(xì)胞動態(tài)平衡被破壞時，活性氧的產(chǎn)生增加，自由基積累產(chǎn)生的大量活性氧會引起氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激參與炎癥過程的發(fā)展，導(dǎo)致許多退行性疾病和癌癥[19]。除此之外，柚皮素還能提高幾種抗氧化酶水平。在氧化還原反應(yīng)不平衡的過程中，會產(chǎn)生白細(xì)胞介素和炎癥介質(zhì)。

2.2 免疫調(diào)節(jié)和抗炎

柚皮素通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞、抑制趨化因子、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、細(xì)胞因子和促炎轉(zhuǎn)錄因子、抑制PI3K/Akt、κ激酶抑制劑/c-Jun N端激酶（IκB kinase/c-JunN-terminal kinase，IKK/JNK）發(fā)揮抗炎作用[20]。柚皮素可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB來調(diào)節(jié)蛋白激酶[21]。該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)炎癥中涉及的幾種細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞黏附分子。抑制蛋白κB（inhibitor of NF-κB，I-κB）是NF-κB的抑制分子，但在炎癥過程中，I-κB被磷酸化和降解。據(jù)報道，柚皮素能調(diào)節(jié)IκB和NF-κB的活性，直接影響細(xì)胞活化[22]?？烧{(diào)節(jié)CD4+T輔助2（Th2）細(xì)胞因子（如GATA結(jié)合蛋白3）以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6的主要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子[23]。柚皮素可以抑制磷酸二酯酶，如環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）磷酸二酯酶。cAMP是炎癥過程中調(diào)節(jié)不同細(xì)胞功能的第二信使分子。高水平的cAMP與抗炎功能有關(guān)。磷酸二酯酶可以水解cAMP以保持正常水平。柚皮素對磷酸二酯酶的抑制作用有可能阻止cAMP降解并延長cAMP信號傳導(dǎo)[24-25]。此外，體外研究和體內(nèi)動物模型的結(jié)果表明，柚皮素可以通過抑制NF-κB通路和激活與抑制多種促炎信號通路有關(guān)的AMPK，下調(diào)幾種炎癥標(biāo)志物的表達(dá)，如TLR4、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和COX-2[26]。

2.3 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

癌細(xì)胞對凋亡具有抵抗力，通常由一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、促凋亡蛋白和Caspase以及Bcl-2家族蛋白誘導(dǎo)[27-28]。凋亡有2個主要的信號級聯(lián)（圖2）：內(nèi)源性的線粒體途徑，Bcl-2家族蛋白啟動Caspases-9、3和7的激活；外源性受體途徑，與腫瘤壞死因子超家族有關(guān)，主要的信號蛋白是Caspase-8。癌基因（如c-Myc）過表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和p53抑制，并在癌細(xì)胞中激活Bcl-2家族的抗凋亡蛋白[29]，而促凋亡蛋白和Caspase可能下調(diào)。柚皮素可以靶向調(diào)節(jié)凋亡信號級聯(lián)刺激細(xì)胞死亡途徑[30]。柚皮素可通過上調(diào)p53表達(dá)、Bax和Caspase-3裂解，下調(diào)Bcl-2和Survivin，誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡[31]。柚皮素誘導(dǎo)的外源性凋亡途徑與腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族蛋白的過表達(dá)有關(guān)。因此，柚皮素可以通過激活抗凋亡蛋白和抑制促凋亡蛋白和Caspase雙重機制激活癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡信號通路。

圖2 柚皮素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑Fig.2 Pathways of apoptosis induced by naringenin in tumor cells

2.4 影響腫瘤線粒體的功能

腫瘤細(xì)胞由于線粒體功能高度異常，其代謝與正常細(xì)胞相比發(fā)生了改變[32]。因此，最近對天然化合物使線粒體恢復(fù)正常模式進(jìn)行了研究，柚皮素也作為潛在的候選藥物進(jìn)行了測試[33]。線粒體至少可通過3種主要機制促成惡變：（1）線粒體活性氧有助于積累潛在的致癌DNA缺陷，以激活潛在的致癌信號通路；（2）特定線粒體代謝物的異常積累，包括反丁烯二酸、琥珀酸和2-羥基戊二酸，具有顯著的轉(zhuǎn)化作用；（3）線粒體外膜通透性或線粒體通透性轉(zhuǎn)變的功能缺陷是新形成的惡性前體細(xì)胞生存所必需的，否則將趨于調(diào)控細(xì)胞死亡[34]。線粒體中Bcl-2家族抗凋亡蛋白的過度表達(dá)導(dǎo)致對凋亡途徑的抵抗。柚皮素相應(yīng)地降低了SGC-7901細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，從而進(jìn)一步驗證了柚皮素的抗腫瘤機制[35]。

3 結(jié)語

柚皮素是一種有效、安全、耐受性好、口服可用的生物黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤和抗炎等多方面作用。柚皮素對乳腺癌、人腎母細(xì)胞瘤、肺癌、人大腸癌、人腦膠質(zhì)瘤和人胎盤絨毛膜癌等有抗增殖和遷移能力。其Caspase家族、Bak、Bax及MAPK通路等機制在柚皮素誘導(dǎo)后，生長凋亡調(diào)控相關(guān)的表達(dá)在癌細(xì)胞中活性增強，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。另外，研究表明柚皮素的納米制劑對人正常細(xì)胞是安全的，但抑制腫瘤惡性表型等方面的研究較少，因此對疾病預(yù)防和腫瘤靶向治療的具有重要臨床意義。許多研究仍在進(jìn)行中，無論是柚皮素原藥還是納米制劑，都應(yīng)指向性地展開臨床試驗，以明確人體給藥劑量與有效性。綜上所述，柚皮素單獨或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用可以減輕以往藥物的毒副反應(yīng)，其多靶點抗腫瘤臨床療效值得進(jìn)一步研究，使其有益于人類腫瘤的防治，為人類抗腫瘤藥物的開發(fā)應(yīng)用提供思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突