紅蓮型不育系綠3A原種商業(yè)化提純繁殖技術(shù)研究

高勝?gòu)摹渭恿帧〈迺?huì)會(huì)　劉明健　蘇祥忠　朱昌棟　王傳軍　潘華　李濤　史昆

摘要：針對(duì)紅蓮型不育系綠3A在大規(guī)模繁殖時(shí)可能遇到的親本種子純度問(wèn)題，創(chuàng)新地融合了“株系循環(huán)法”和“三系七圃法”進(jìn)行提純，并開展了后期繁殖的商業(yè)化配套技術(shù)研究，成功實(shí)現(xiàn)了年產(chǎn)親本原原種10萬(wàn)kg的目標(biāo)，不僅解決了提純的技術(shù)難題，更為紅蓮型不育系的大規(guī)模商業(yè)化原種提純繁殖提供了寶貴的參考。

關(guān)鍵詞：紅蓮型；綠3A；提純復(fù)壯；商業(yè)化；株系循環(huán)；動(dòng)態(tài)平衡

Research on Commercial Purification and Propagation Techniques of Original Seeds of Honglian-Type Sterile Line Lv3A

GAO Shengcong，LYU Jialin，CUI Huihui，LIU Mingjian，SU Xiangzhong，

ZHU Changdong，WANG Chuanjun，PAN Hua，LI Tao，SHI Kun

（Anhui Win-All Hi-Tech Seed Co.，Ltd. /Key Laboratory of Hybrid Rice New Variety

Creation of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Hefei 230088）

20世紀(jì)70年代開始，中國(guó)農(nóng)業(yè)科技人員相繼成功實(shí)現(xiàn)“三系法”育種技術(shù)，促進(jìn)了雜交水稻的大面積推廣種植，取得了舉世矚目的成就。由朱英國(guó)院士團(tuán)隊(duì)育成的紅蓮型、野敗型和包臺(tái)型不育系被國(guó)際公認(rèn)為雜交水稻三大細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型。近年來(lái)，紅蓮型雜交水稻在基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究和產(chǎn)業(yè)化等方面均有突破[1]，但仍然面臨著親本提純制約大規(guī)模商業(yè)化推廣的問(wèn)題。

紅蓮型三系中秈稻不育系綠3A（原名9912A）是安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院綠色食品工程研究所于2002年育成，并在安徽適宜地區(qū)建立了相應(yīng)的原原種、原種和良種繁育體系，但只具有年產(chǎn)2萬(wàn)kg的供種能力[2]。隨著繁育世代的增加，特別是用種量急劇增加后，綠3A種子出現(xiàn)了育性不穩(wěn)定現(xiàn)象，變異株和同形可育株等雜株比例超標(biāo)，影響了其商業(yè)化應(yīng)用。本文針對(duì)綠3A在大規(guī)模繁殖時(shí)親本種子可能存在的純度問(wèn)題，對(duì)其采用多方法集成的不育性提純及配套繁殖技術(shù)研究，成功地實(shí)現(xiàn)了親本原原種年產(chǎn)10萬(wàn)kg。

1 綠3A提純的方法與基地選擇

1.1 提純與檢測(cè)的方法 綠3A（由安徽荃銀種業(yè)科技有限公司提供，以下簡(jiǎn)稱荃銀科技公司），經(jīng)多點(diǎn)田間鑒定純度為97.5%～98.9%，進(jìn)行綠優(yōu)1號(hào)（綠3A/綠稻24）等品種試制，收獲F1種子，純度為90.0%～94.8%，因此，綠3A 親本質(zhì)量的提升迫在眉睫?！昂?jiǎn)易法”“株系循環(huán)法”和“三系七圃法”都是原種提純的經(jīng)典方法，經(jīng)過(guò)多年摸索，本文采用了“株系循環(huán)法”和“三系七圃法”的融合，同時(shí)將“簡(jiǎn)易法”設(shè)為對(duì)照，并開展了后期繁殖的商業(yè)化配套技術(shù)研究[3]。采用NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR分子標(biāo)記法》中的48個(gè)水稻SSR標(biāo)記，對(duì)水稻樣品進(jìn)行DNA分析[4]。

1.2 基地的選擇與播期安排 基地選擇在江西省撫州市宜黃縣，利用春繁季節(jié)（7月12-20日）高溫時(shí)段，更有利于檢測(cè)淘汰和選擇高質(zhì)量個(gè)體。春繁試驗(yàn)播種時(shí)間：不育系播種時(shí)間（A）：4月8日；保持系Ⅰ期與Ⅱ期播種時(shí)間分別為（B1）：4月11日、（B2）：4月15日；移栽時(shí)間：5月10日；抽穗時(shí)段：7月12-17日；收割時(shí)間：8月5日。

2 不同方法提純的結(jié)果與比較

2.1 “三系七圃法”融合“株系循環(huán)法”實(shí)現(xiàn)對(duì)原種的精準(zhǔn)提純 利用大批量成對(duì)雜交株對(duì)，通過(guò)株行和株系淘汰、選擇和鑒定，以動(dòng)態(tài)平衡的方式，獲得合格的混系株對(duì)種子，從而穩(wěn)定質(zhì)量（純度），達(dá)到提純繁殖目標(biāo)。第1輪篩選：2019年建立選種圃，經(jīng)過(guò)典型性狀和育性檢測(cè)，完成成對(duì)交123對(duì)（編碼：綠3A19-n/綠3B19-n）。2020年正季種植株行圃選留29對(duì)。2021年種植株系圃，選留19對(duì)收獲株系種子（分系），于海南種植鑒定質(zhì)量（純度），同年，抽穗前10d于分系田間取葉片進(jìn)行室內(nèi)真實(shí)性檢測(cè)；見(jiàn)穗前在田間進(jìn)行A、B套袋自交；花期分系測(cè)交綠3A/R9311，收獲種子。第2輪篩選：2020年同步從第1輪株行圃和株系圃中選擇優(yōu)良單株，建立選種圃，進(jìn)行“株系循環(huán)法”第2、3……N輪篩選，截至2023年已經(jīng)完成3輪篩選。3輪提純株系圃分系海南種植純度鑒定情況具體見(jiàn)表1。

具體結(jié)果：第1輪篩選：完成成對(duì)交123對(duì)（編碼：綠3A19-n/綠3B19-n）；株行圃當(dāng)選比率（合格比例）23.5%；株系圃成對(duì)交當(dāng)選比率（合格比例）15.4%；收獲株系種子（分系）數(shù)量綠3A/綠3B：300kg/60kg，海南種植鑒定質(zhì)量（純度）99.95%/100%。

2021年分系DNA檢測(cè)全部合格，田間檢測(cè)不育株率100%，不育度99.83%，套袋自交結(jié)實(shí)0.17%；2022年種植測(cè)交種子，株系（19個(gè)混系）恢復(fù)度86%～94%，恢復(fù)株率達(dá)100%。持續(xù)用“株系循環(huán)法”進(jìn)行第2輪、第3輪篩選，提純?cè)N，結(jié)果均較滿意（表2）。

2.2 “簡(jiǎn)易法”繁殖原種，種子純度不穩(wěn)定 2019-2021年連續(xù)3年安排進(jìn)行小面積的原種繁殖，綠3A和綠3B同步進(jìn)行（表3）。技術(shù)程序：（1）在當(dāng)年的親本繁殖基地選擇肥力水平均勻、條件好的繁殖田0.13～0.20hm2，嚴(yán)格按照單株種植繁殖；（2）在苗期、分蘗期、生殖生長(zhǎng)始期、見(jiàn)穗期、抽穗期至種子收割前，多次進(jìn)行嚴(yán)格除雜除劣，將一切可疑的植株全部除掉，混收種子，作為原種；（3）在實(shí)施的過(guò)程中，注意對(duì)單株的選擇比較，嚴(yán)格把握親本的典型性標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)禁肥水、激素、農(nóng)藥和除草劑對(duì)性狀的影響，規(guī)避人為誤差[5]。通過(guò)技術(shù)人員持續(xù)的田間努力，混收種子質(zhì)量（純度）較繁殖前有顯著提升，增幅較大，但是幾代循環(huán)疊加，獲得純度99.8%以上的高質(zhì)量親本難度較大。

2.3 兩種方法結(jié)果比較 前者方法提純?cè)N，能夠精準(zhǔn)獲得高質(zhì)量種子，可控制性較強(qiáng)，從成對(duì)交株對(duì)至株系（分系），直觀掌握每一系的質(zhì)量情況，方便淘汰不合格成對(duì)交，混合保留的株系種子作為大田繁殖用種種源；操作過(guò)程中，每一季涵蓋成對(duì)交、株行和株系（分系）試驗(yàn)圃。相比較后者簡(jiǎn)便易于操作，但是無(wú)法收到高質(zhì)量（純度）原種，而且存在高世代個(gè)體出現(xiàn)“同質(zhì)恢”轉(zhuǎn)育結(jié)實(shí)的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。

3 “三系七圃法”融合“株系循環(huán)法”需注意問(wèn)題

3.1 選擇比率波動(dòng) 第1輪2019年成對(duì)交株行圃淘汰比率大于70%，分析原因是選種圃篩選時(shí)親本種源的純度較低，母本選種圃種植3200株，雜株達(dá)80株，比例達(dá)2.5%，雜株類型有早熟、晚熟、紫色稃尖、圓粒形、長(zhǎng)粒形和同形可育株。第2輪、第3輪趨于穩(wěn)定，每一階段逐步淘汰和修整輕微變異的成對(duì)株對(duì)，株行圃和株系圃的選擇比例大于50%，達(dá)到正常標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 高溫敏感株的自交結(jié)實(shí) 紅蓮型不育系屬于配子體不育，花粉表現(xiàn)為二核期敗育，敗育花粉粒呈現(xiàn)出中空?qǐng)A形，1%碘—碘化鉀溶液下不著色，屬圓敗類型。幾年來(lái)，在27.03°～27.43°N區(qū)域開展提純研究，為篩選出高溫轉(zhuǎn)育株，通過(guò)分析該區(qū)域多年的氣象資料，7月中下旬會(huì)有35～40℃高溫天氣，所以母本的抽穗揚(yáng)花期安排在7月下旬，使得母本育性敏感期處于高溫天氣，母本就會(huì)出現(xiàn)不同程度的高溫轉(zhuǎn)育，轉(zhuǎn)育個(gè)體俗稱同形可育株，人工套袋自交試驗(yàn)，結(jié)實(shí)比例達(dá)1‰～2.5‰，而且自交后代為正常結(jié)實(shí)的早熟類型雜株。

3.3 選擇方法由傳統(tǒng)的限值選擇改進(jìn)為眾數(shù)選擇[6] 育種上常用優(yōu)中選優(yōu)方法進(jìn)行系統(tǒng)選擇，其田間淘汰率較高，操作時(shí)人為因素影響很大。利用“株系循環(huán)”良種繁育方法，以維持優(yōu)良群體的穩(wěn)定性為主要目標(biāo)，掌握穩(wěn)步求進(jìn)的思路，可以使種子的質(zhì)量和數(shù)量得到提高。在大田正常環(huán)境下選擇植株，務(wù)必注重品種的典型性和群體性，只要不是雜株、劣株和病株都可以選用。

3.4 降低不育系用種代數(shù) 株系圃鑒定后的種子（原原種）混合后繁殖原種，將原種種子直接作為大田用種親本用于制種生產(chǎn)，可以減少親本中“同質(zhì)恢”恢復(fù)基因的可育個(gè)體，隨著 F1雜株及其分離后代的花粉進(jìn)一步滲入到不育系和保持系中，產(chǎn)生大量的“同質(zhì)恢”雜株，造成生物學(xué)混雜，導(dǎo)致恢復(fù)基因進(jìn)一步擴(kuò)散[7]。實(shí)踐中，采取循環(huán)進(jìn)行“選擇—種植鑒定—選擇”的提純繁殖方式，持續(xù)獲得原種，提供合格大田用種供制種生產(chǎn)環(huán)節(jié)使用，是一種可行的策略。

3.5 建立基礎(chǔ)群體，用“株系循環(huán)法”逐步淘汰育種剩余變異[6] 根據(jù)單株選擇理論，自花授粉作物只須進(jìn)行一次單株鑒定選擇，就可最大程度地除雜去劣，對(duì)生育期、株高等數(shù)量性狀加以有效控制，就能選留到具有品種典型性和整齊一致的數(shù)個(gè)株行小區(qū)。工作人員在操作的過(guò)程中，首先將成對(duì)交進(jìn)行株行比較鑒定試驗(yàn)，合格后的成對(duì)株行，再進(jìn)行一季株系試驗(yàn)，就建立了株系循環(huán)基礎(chǔ)群體。株系循環(huán)基礎(chǔ)群體的株系數(shù)量一般不低于100個(gè)，以保證基因庫(kù)的完整和穩(wěn)定。依據(jù)該品種在一定的栽培條件和生態(tài)條件下自然形成的特性，田間選擇時(shí)，保留群體中符合本品種典型性的多數(shù)或大多數(shù)個(gè)體，通過(guò)逐年的少量淘汰，有目的地提高有利基因頻率。

4 商業(yè)化配套技術(shù)研究

4.1 增加專業(yè)技術(shù)力量，持續(xù)開展親本育性研究 穩(wěn)定在高溫生態(tài)區(qū)域建立和發(fā)展原種提純繁殖試驗(yàn)基地，利用高溫氣候環(huán)境誘導(dǎo)不育系中高溫敏感株個(gè)體表現(xiàn)型顯現(xiàn)，逐步淘汰不利基因型，穩(wěn)步年產(chǎn)優(yōu)良株系種650kg，分系海南種植鑒定檢測(cè)，混系使用，繁殖用種純度99.95%，制種用種純度99.80%。

4.2 穩(wěn)固適宜的生態(tài)繁殖基地 依托國(guó)家政策農(nóng)業(yè)項(xiàng)目支撐，在江西省撫州市發(fā)展1～2個(gè)縣、4～5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，建立起穩(wěn)固的水稻親本種子提純繁殖基地，不育系年繁殖面積達(dá)133.3hm2。

4.3 采用“公司+基地+農(nóng)戶”的產(chǎn)業(yè)化模式 派駐專業(yè)技術(shù)人員全程督導(dǎo)；基地組建除雜專業(yè)隊(duì)伍，人均除雜面積小于0.26hm2，保障繁殖質(zhì)量；對(duì)農(nóng)戶進(jìn)行繁殖過(guò)程技術(shù)監(jiān)控和技術(shù)指導(dǎo)，確保環(huán)節(jié)合格。

4.4 繁殖過(guò)程中嚴(yán)格把關(guān) 抽穗授粉期安排在低溫季節(jié)，以春繁、秋繁和海南春繁為主；實(shí)施空間隔離，杜絕用時(shí)間和距離隔離；及時(shí)清除田間再生苗；抽穗前組織人員去除明顯雜株；花期重點(diǎn)拔除同形可育株，務(wù)必在散粉前完成，當(dāng)天露雜當(dāng)天去除；父本授粉完成立即低位割除，反復(fù)檢查直至驗(yàn)收合格；收割母本前進(jìn)行最后驗(yàn)收；收割機(jī)械仔細(xì)檢查，防止機(jī)械混雜。

5 總結(jié)和展望

綠3A原種大規(guī)模商業(yè)化提純繁殖遇到的問(wèn)題，是很多紅蓮型雜交水稻同樣面臨的問(wèn)題，也反映出當(dāng)前我國(guó)雜交水稻研究重育種、輕提純繁殖的現(xiàn)狀。以產(chǎn)業(yè)化思維為引領(lǐng)，通過(guò)對(duì)親本特征特性及前人相關(guān)研究進(jìn)行深入了解，并腳踏實(shí)地去投入、去攻關(guān)，才能保質(zhì)保量生產(chǎn)出合格種子，才能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化推廣。當(dāng)前，紅蓮型雜交稻在國(guó)內(nèi)種植面積已達(dá)200多萬(wàn)hm2，并已逐步打開國(guó)外市場(chǎng)，在越南、老撾、孟加拉、非洲幾內(nèi)亞等國(guó)家種植均表現(xiàn)優(yōu)異[8]。希望通過(guò)本文的研究，能夠?yàn)榇蠹姨峁┮恍┙梃b，共同實(shí)現(xiàn)雜交水稻產(chǎn)業(yè)未來(lái)更大的發(fā)展。

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（收稿日期：2024-03-01）