高效液相色譜法與膠體金快速定量法測(cè)定玉米中嘔吐毒素的對(duì)比

盧慧勇

摘要：使用高效液相色譜法與膠體金快速定量法分別檢測(cè)28個(gè)玉米樣品的嘔吐毒素含量，比較發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)96.4%；通過(guò)在空白基質(zhì)中加標(biāo)分別使用兩種方法檢測(cè)對(duì)比兩種方法檢測(cè)的準(zhǔn)確度均符合國(guó)標(biāo)要求；與高效液相色譜法相比，膠體金快速定量法簡(jiǎn)單、快捷，定性相符率高，可以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求；當(dāng)樣本量比較大時(shí)，可用膠體金快速定量法作為初篩，再用高效液相色譜法進(jìn)一步檢測(cè)，可達(dá)到降本提效的目的。

關(guān)鍵詞：玉米；嘔吐毒素；高效液相；膠體金

中圖分類(lèi)號(hào)：TS210.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20240118

Comparison of high performance liquid chromatography and colloidal gold rapid quantitative method for the determination of vomitoxin in corn

Lu Huiyong

（ China grain storage （Shanxi） Quality Inspection Center Co.， LTD.， Taiyuan， Shanxi 030000 ）

Abstract： The content of vomitoxin in 28 corn samples was determined by high performance liquid chromatography （HPLC） and colloidal gold rapid quantitative method. The coincidence rate of the two methods was 96.4%. The accuracy of the two methods met the requirements of the national standard by adding marks to the blank matrix. Compared with high performance liquid chromatography （HPLC）， the colloidal gold rapid quantitative method is simple， fast， and has high qualitatively consistent rate， which can meet the experimental requirements. When the sample size is relatively large， the colloidal gold rapid quantitative method can be used as the primary screening， and then the high performance liquid chromatography can be used for further detection， which can achieve the purpose of reducing cost and improving efficiency.

Key words： corn； vomitoxin； high performance liquid phase； colloidal gold

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）又稱(chēng)嘔吐毒素，主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌組成，是F鐮刀菌的二級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于糧食作物和加工品中[1-2]。嘔吐毒素主要污染小麥、大麥、玉米等谷類(lèi)作物，也污染糧食制品。人畜攝入了被嘔吐毒素污染的食物或飼料后，會(huì)導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)p害造血系統(tǒng)而造成死亡[3-4]。目前無(wú)法避免嘔吐毒素污染糧食作物，而且其在研磨和加工過(guò)程中很難被降解，可能對(duì)人畜造成潛在的危害[5-6]。

糧食的嘔吐毒素主要產(chǎn)生于田間種植、收貨及儲(chǔ)藏階段，如田間種植階段赤霉病流行，收獲時(shí)遭遇陰雨天氣造成的濕度過(guò)高，儲(chǔ)藏階段的溫度和濕度管理不善均為導(dǎo)致嘔吐毒素產(chǎn)生的因素。嘔吐毒素的產(chǎn)生與菌株、溫度、濕度、通風(fēng)及日照等眾多因素有關(guān)，其中以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為代表的真菌毒素受到社會(huì)的廣泛關(guān)注，已成為糧食檢測(cè)部門(mén)出入庫(kù)檢驗(yàn)、抽檢普查的必檢項(xiàng)目之一。

檢測(cè)嘔吐毒素的方法有很多種，而且高度靈敏的儀器方法和快速有效的免疫方法正逐步應(yīng)用于嘔吐毒素檢測(cè)，包括嘔吐毒素?zé)晒舛靠焖贆z測(cè)法、嘔吐毒素酶聯(lián)免疫定量快速檢測(cè)法、嘔吐毒素膠體金定量定性快速檢測(cè)法、嘔吐毒素免疫親和層析柱檢測(cè)法[7-10]。比較經(jīng)典且已經(jīng)形成國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)予以實(shí)施的檢測(cè)方法主要包括同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、免疫親和層析凈化高效液相色譜法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法、膠體金快速定量法。

目前，專(zhuān)門(mén)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室多采用GB 5009.111—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y(cè)定》第二法：免疫親和層析凈化高效液相色譜法，糧庫(kù)收購(gòu)一線多采用LS/T 6113—2015《糧油檢驗(yàn) 糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測(cè)定 膠體金快速定量法》。為更好地服務(wù)基層糧庫(kù)，本實(shí)驗(yàn)擬將兩種方法作對(duì)比，考察二者在定性定量方面的符合性。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

扦取山西轄區(qū)庫(kù)存玉米28份，涵蓋不同品種、不同產(chǎn)地、不同收貨年度、不同入庫(kù)時(shí)間、不同倉(cāng)房類(lèi)型等可能對(duì)嘔吐毒素在儲(chǔ)存階段產(chǎn)生影響的因素。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

稀釋緩沖液：CHARM；甲醇中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品（100.7±3.2） μg/mL）：國(guó)家糧食與物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院；甲醇（色譜純）：天津科密歐實(shí)驗(yàn)試劑有限公司；純凈水（符合GB/T 6682中一級(jí)水的要求）：實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

Charm型真菌毒素定量檢測(cè)系統(tǒng)（包含渦旋振蕩器、離心機(jī)、孵育器、讀數(shù)儀）：中檢環(huán)貿(mào)生物技術(shù)（北京）有限公司；3310型盤(pán)式保水磨：瑞典波通儀器有限公司；VX-III型多管渦旋振蕩器：安簡(jiǎn)（北京）科技有限公司；YP502N型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Agilent 1260 II型液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；3100型錘式旋風(fēng)磨：瑞典波通儀器有限公司；HX-01溶劑過(guò)濾器（帶無(wú)油真空泵）：天津華鑫儀器有限公司；ZD-9624型搖床：常州易晨?jī)x器制造有限公司；QL-866型渦旋振蕩器：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；NDK-12W型水浴氮吹儀：上海皓莊儀器有限公司；Milli-Q direct8型純水/超純水一體化系統(tǒng)：南京金穗分析技術(shù)有限公司。

1.4 膠體金快速定量法

1.4.1 樣品處理

將原始樣品充分混勻，分取有代表性的樣品500 g，除去雜質(zhì)后，用盤(pán)式保水磨（出粉過(guò)20目篩）粉碎，充分混勻，用分樣器縮分至200 g備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取10.00 g試樣于100 mL離心管中，加入50.0 mL純凈水，旋緊離心管蓋，渦旋振蕩器上以2 000 r/min振蕩1.5 min后取出，靜置1～2 min后取1 000 μL上清液于1.5 mL離心管中， 4 000 r/min離心1 min。取離心后的上清液100 μL于另一個(gè)1.5 mL離心管中，加入1.0 mL稀釋緩沖液，充分混勻待測(cè)。

1.4.2 檢測(cè)方法

將孵育器預(yù)熱到45 ℃后，放入檢測(cè)條備用。準(zhǔn)確移取300 μL待測(cè)溶液，加入檢測(cè)條加樣孔中，關(guān)閉加樣孔，在孵育器中孵育5 min，取出檢測(cè)條觀察一條C線（質(zhì)控線）和兩條T線（檢測(cè)線）顯色情況。在確定質(zhì)控線和檢測(cè)線正常顯色的情況下，選擇讀數(shù)儀的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢測(cè)頻道并設(shè)定基質(zhì)為00（MATRIX 00），將檢測(cè)條塞入讀數(shù)槽，開(kāi)始樣品測(cè)定，讀數(shù)儀自動(dòng)顯示脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量。為不影響檢測(cè)結(jié)果，建議單個(gè)檢測(cè)條在15 s內(nèi)完成讀數(shù)。

1.5 免疫親和層析凈化高效液相色譜法

1.5.1 樣品處理

將原始樣品充分混勻，分取有代表性的樣品1 kg，用錘式旋風(fēng)磨（出粉過(guò)30目篩）粉碎，再次充分混勻，用分樣器縮分至200 g備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取25.00 g試樣于250 mL具塞三角瓶中，加入100 mL純凈水，旋緊瓶塞，置于搖床上。將搖床調(diào)節(jié)至230 r/min，振蕩20 min后靜置1～2 min，先用中速定性濾紙過(guò)濾，再用玻璃纖維濾紙過(guò)濾。收集濾液2 mL過(guò)免疫親和柱，保持每秒1～2滴的速度，直至空氣進(jìn)入親和柱中，用水淋洗免疫親和柱2次，每次10 mL，保持每秒1～2滴的速度，直至空氣進(jìn)入免疫親和柱，棄去全部濾液，抽干免疫親和柱，用2 mL甲醇洗脫免疫親和柱，保持每秒1～2滴的速度。收集全部洗脫液至5 mL試管中，在50 ℃～60 ℃水浴中氮吹至近干，加入1.0 mL初始流動(dòng)相甲醇—水（V甲醇∶V水=20∶80）定容，渦旋30 s溶解殘留物，充分混勻后過(guò)0.22 μm濾膜，收集濾液于進(jìn)樣小瓶中以備進(jìn)樣。

1.5.2 色譜條件

色譜柱為C18柱長(zhǎng)150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5 μm；流動(dòng)相：甲醇—水（V甲醇∶V水= 20∶80）；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣體積50 μL；柱溫35 ℃。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

配置10.07 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取購(gòu)置的標(biāo)準(zhǔn)溶液（100.7 μg/mL，不確定度3.2 μg/mL）500 μL于5 mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相甲醇—水（V甲醇∶V水=20∶80）稀釋并定容到5 mL，渦旋振蕩10～15 s，充分混勻備用。

配置標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別取10.07 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10、20、50、100、200、500 μL，用初始流動(dòng)相甲醇—水（V甲醇∶V水=20∶80）稀釋到1 mL，形成質(zhì)量濃度為100.7、201.4、503.5、1 007、2 014、5 035 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，并按照1.5.2的色譜條件分別進(jìn)樣50 μL，上機(jī)檢測(cè)。以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析

由表1可知，膠體金快速定量法與高效液相色譜法的定性相符率達(dá)96.4%，但膠體金快速定量法與高效液相色譜法相比，簡(jiǎn)單、快速，對(duì)人員能力要求低，可以達(dá)到快速定性的目的。

2.2 定量分析

2.2.1 假陽(yáng)性樣例定量分析

通過(guò)分別應(yīng)用膠體金快速定量法與高效液相色譜法對(duì)28份玉米樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：在定量方面，膠體金快速定量法出現(xiàn)1例假陽(yáng)性，占樣品總量的5.6%；此例樣品兩種方法的差值為241 μg/kg，兩種方法的平均值為980 μg/kg，兩種方法的差值占平均值的24.6%?？紤]到此例樣品恰好處于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量臨界值附近和真菌毒素快速檢測(cè)儀器自身定量誤差20%（廠家提供），而且樣品總量有限，因此，對(duì)于假陽(yáng)性的出現(xiàn)，是偶然現(xiàn)象，還是方法本身存在的問(wèn)題，還需要加大樣本量，增加陽(yáng)性樣品，做進(jìn)一步研究。

2.2.2 兩種方法定量比較

通過(guò)分析兩種方法定量差值占平均值的比例，確定兩種方法定量的偏差（參考脫氧雪腐鐮刀菌烯醇國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法中對(duì)雙實(shí)驗(yàn)差的要求：雙實(shí)驗(yàn)差大于平均值的23%的情況超過(guò)5%）。兩種方法定量比較詳見(jiàn)表1。

對(duì)于樣品1、2、12、18的定量偏差均超過(guò)50%，4個(gè)樣品的共同點(diǎn)是均有一種方法的定量值低于或接近國(guó)標(biāo)的定量限（200 μg/kg），其余樣品的定量偏差未見(jiàn)明顯異常。對(duì)于是否國(guó)標(biāo)定量限以上，膠體金快速定量方法與高效液相色譜法相比，定量接近，需要加大樣本量，進(jìn)一步研究；是否國(guó)標(biāo)方法定量限以下，膠體金快速定量方法不能準(zhǔn)確定量，且與高效液相色譜法定量值相差較大，需要加大樣本量，進(jìn)一步研究。

2.3 準(zhǔn)確度分析

通過(guò)在玉米粉基質(zhì)中添加量為200、1 000、2 000 μg/kg的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平含量做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定含量平均值與真值相對(duì)偏差見(jiàn)表2、表3。

按照GB/T 27404—2008附錄F的要求，真值在10～10 000 μg/kg時(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在-20%～10%，根據(jù)表2和表3分析，高效液相色譜法和膠體金快速定量法測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差均處于國(guó)標(biāo)要求的范圍內(nèi)，符合準(zhǔn)確度要求。

3 討 論

（1） 膠體金快速定量法是嘔吐毒素最簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，檢測(cè)不需要配套儀器，樣品處理簡(jiǎn)單，5～10 min就可以看到檢測(cè)結(jié)果?？梢愿鶕?jù)質(zhì)控線（G線）、檢測(cè)線（T線），初步確定所測(cè)樣本嘔吐毒素含量范圍，能給出具體數(shù)值，但是結(jié)果準(zhǔn)確性不夠，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性，價(jià)格最低，可作為粗略判斷方法。高效液相色譜方法是以免疫親和柱為分離手段的色譜法，用高效液相色譜儀作為檢測(cè)工具的分析方法。該項(xiàng)技術(shù)靈敏度高，測(cè)定范圍廣泛，采用單克隆免疫技術(shù)，可以特效性地將嘔吐毒素和其他真菌毒素分離出來(lái)，分離效率和回收率高，正確性和可靠性強(qiáng)，有國(guó)標(biāo)支持。但檢測(cè)成本高，儀器維護(hù)成本高。一般作為檢測(cè)機(jī)構(gòu)終端判定方法，也有大型企業(yè)作為產(chǎn)品質(zhì)量衛(wèi)生指標(biāo)控制方法。

（2） 高效液相色譜法靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件有要求，試劑純度要求高，實(shí)驗(yàn)耗材和儀器維護(hù)所需成本高，適用于檢測(cè)機(jī)構(gòu)出具報(bào)告或者在結(jié)果存在爭(zhēng)議時(shí)作為仲裁方法。在日常糧油檢驗(yàn)中，本著把好出入庫(kù)關(guān)的原則，建議在入庫(kù)驗(yàn)收和出庫(kù)檢測(cè)中優(yōu)先使用高效液相色譜法。

（3） 膠體金快速定量法在進(jìn)行測(cè)定樣品時(shí)無(wú)需大型儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求低，無(wú)需接觸標(biāo)準(zhǔn)品（陽(yáng)性），方法簡(jiǎn)便快捷，適用于基層糧庫(kù)出入庫(kù)篩查。與高效液相色譜方法比較，可以在按照要求逐車(chē)檢驗(yàn)的同時(shí)，有效地降低檢驗(yàn)成本。

（4） 通過(guò)對(duì)28份玉米樣品的嘔吐毒素進(jìn)行高效液相色譜法和膠體金快速定量法的檢測(cè)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在定性方面，兩種方法的符合率達(dá) 96.4%；在定量方面，膠體金快速定量法出現(xiàn)一例假陽(yáng)性，占樣品總量的3.6%。關(guān)于兩種方法定量值的比較，需要加大樣本量，進(jìn)一步研究。

（5） 在實(shí)際工作中，應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況靈活運(yùn)用兩種方法，特別是在大型普查時(shí)，樣本量比較大，可用膠體金快速定量法作為初篩，再用高效液相色譜法進(jìn)一步檢測(cè)，可達(dá)到降本提效的目的。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 杜政，唐瑞明.糧食中真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)與檢驗(yàn)[M].長(zhǎng)沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2013：5-6.

[2] 許燁.免疫親和凈化高效液相色譜法測(cè)定糧食中鐮刀菌毒素分析方法的研究[D].沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006：5.

[3] 萬(wàn)小樂(lè).高效液相色譜法測(cè)定糧食中嘔吐毒素的方法研究[J].糧食加工，2016，41（4）：74-76.

[4] 徐冰濤，張勇，崔朝霞.嘔吐毒素生物降解的研究進(jìn)展[J].飼料研究，2022，45（17）：128-133.

[5] 譚洪波，牟沿華.白城市新收獲玉米真菌毒素污染狀況分析[J].糧食科技與經(jīng)濟(jì)，2023，48（1）：87-89.

[6] 于金旺，劉志斌，崔建，等.小麥中嘔吐毒素的成因及危害[J].糧食科技與經(jīng)濟(jì)，2019，44（9）：81-82.

[7] 謝婷婷.嘔吐毒素膠體金三線定量檢測(cè)條性能研究[J].糧食科技與經(jīng)濟(jì)，2017，42（5）：32-34.

[8] 孫安權(quán)，MIKAELLAN K，PHILLIPS T D.霉菌毒素研究新進(jìn)展[J].養(yǎng)殖與飼料，2006（10）：40-45.

[9] 劉紹偉，羅仕歡.淺談霉菌嘔吐毒素[J].湖南飼料，2006（2）：26-27+34.

[10] 袁克，龔燕，王俊雙，等.金標(biāo)試紙法和酶聯(lián)免疫法檢測(cè)嘔吐毒素的對(duì)比研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（18）：5341+5360.