基于數(shù)字全息的光場動態(tài)顯微定量探測系統(tǒng)

卞可歆 畢鈺瑩 任雙文 田璐妤

摘 ?要：該文提出一種新型檢測顯微樣本光學(xué)參數(shù)的方法，將顯微數(shù)字全息術(shù)與相位解包裹的方法相結(jié)合，搭建實驗光路并編寫相關(guān)算法，從而由數(shù)字全息圖像獲得光場物體振幅及相位信息，利用折射率計算可以得到微米級樣本的真實形狀與厚度。該文采用光纖的纖芯驗證試驗系統(tǒng)的準(zhǔn)確性，將洋蔥鱗片表皮細(xì)胞作為實驗對象，結(jié)果證實該實驗方法的有效性以及可行性。

關(guān)鍵詞：顯微定量測量；相位解包裹；折射率；光場；數(shù)字全息

中圖分類號：O438.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? ? ?文章編號：2095-2945（2024）18-0063-04

Abstract： This paper proposes a new method for detecting optical parameters of microscopic samples. It combines digital holography with phase unwrapping techniques， establishes an experimental optical setup， and develops relevant algorithms. Consequently， it extracts both the amplitude and phase information of the object's optical field from digital holographic images. By calculating the refractive index， it provides accurate measurements of the real shape and thickness of micrometer-scale samples. The accuracy of the proposed experimental system is validated using the core of an optical fiber， and the effectiveness and feasibility of the experimental method are demonstrated using onion epidermal cells.

Keywords： microscopic quantitative measurement; phase unwrapping; refractive index; optical field; digital holography

微觀物體的三維形狀測量在生物學(xué)、微電子工業(yè)和微機電系統(tǒng)工程等許多領(lǐng)域都具有重要的意義。掃描共聚焦顯微鏡已被用于這一目的，但三維掃描的過程是相當(dāng)耗時的。顯微電子散斑干涉術(shù)可以提供全場測量的三維信息，但需要一個聚焦機制來記錄不同場深下的散斑圖。這一問題使它無法應(yīng)用于觀測具有相當(dāng)大厚度或軸向運動的物體。

目前利用數(shù)字全息方法來對光場物體進行振幅與相位的探測是主流探測手段之一。數(shù)字全息術(shù)采用高質(zhì)量的電荷耦合器件（CCD）記錄全息圖像，并存儲于計算機中，利用計算機程序進行處理，并將拍攝的圖像輸出為再現(xiàn)的全息圖像。并對實驗結(jié)果進行進一步處理，可以快速得到物體的振幅與相位信息。數(shù)字全息術(shù)具備多種優(yōu)勢，如高靈敏度、快速成像速度、便于數(shù)字處理和可實現(xiàn)定量測量。因此，在顯微觀察、粒子動態(tài)過程監(jiān)測、信息加密等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

現(xiàn)階段，仍缺乏能實時探測顯微光場的測量系統(tǒng)。而提高再現(xiàn)像質(zhì)量、加快數(shù)字全息圖再現(xiàn)運算速度、物體動態(tài)變化實時測量、數(shù)字全息實時再現(xiàn)顯示等關(guān)鍵技術(shù)仍然值得深入研究。在此基礎(chǔ)上，本文提出一項實時探測光場振幅、相位信息的探測系統(tǒng)，并編寫處理算法對實驗結(jié)果進行處理。

1 ?微觀光場參數(shù)探測基本原理

1.1 ?基于圓偏振光的數(shù)字全息測量原理

1.2 ?微觀光場的顯微探測原理

微觀光場參數(shù)探測裝置是采用顯微物鏡來對物體進行放大，在理想的成像條件下時，物體的復(fù)振幅信息可以用以下公式表示

式中：d1表示物距，d2表示像距，M表示放大的倍率，有M=-d2/d1，f表示顯微物鏡的焦距，？姿表示波長，uoi表示物平面的光波分布。由公式可知，像素空間的光場頻率與系統(tǒng)的放大倍率之間存在反比關(guān)系，所以，系統(tǒng)要在滿足CCD相機的采樣的條件下來選擇合適數(shù)值孔徑的物鏡。

1.3 ?相位探測與解包裹原理

相位測量中，直接獲取的相位通常會被折疊進[-？仔，？仔）區(qū)間的包裹相位圖，當(dāng)相位的變化范圍超過2？仔時會出現(xiàn)跳變，形成條紋圖案，因此需要使用解包裹算法對折疊的相位信息展開恢復(fù)為連續(xù)的相位。相位圖本身具有連續(xù)性，將一張圖分割成多個部分，在一定范圍內(nèi)2個部分解包裹前的相位差與解包裹后的相位差相等，因此可以采用相位展開算法解出其中一個部分的原相位，再將已解包裹的相位信息與解包裹前的相位差進行運算，即可得到另一個部分的原相位?；诖吮疚氖褂昧艘环N質(zhì)量引導(dǎo)路徑的路徑跟蹤算法，并編寫了相關(guān)程序?qū)D像進行相位解包裹，該算法具有高效準(zhǔn)確特征的同時，也具有較好的魯棒性。

在質(zhì)量引導(dǎo)路徑展開算法中，關(guān)鍵在于如何確定解包裹路徑，確保選擇的解包路徑在可靠度更高的像素之間，從而避免選擇了噪聲較大或者相位跳變區(qū)域?qū)е鲁霈F(xiàn)較大誤差進而影響到整個圖像。因此選用了像素的二階差分值確定可靠度。初始時每個像素自己為一組，根據(jù)邊的可靠度大小對邊進行排序，算法解包裹路徑為邊的可靠度從大到小降序依次遍歷所有邊。在對應(yīng)情況下分別處理對應(yīng)邊。最終可以在兼顧速度和質(zhì)量的情況下進行解包裹得到連續(xù)的相位圖。

通過相位解包裹，我們得到了物體的相位信息，若需要得到物體的真實厚度信息，還需要相應(yīng)的計算。由于本系統(tǒng)光路物光是垂直入射進入物體與垂直出射，所以不用考慮入射角度對干涉造成的影響，可知

2 ?實驗系統(tǒng)搭建

如圖1所示，為實驗搭建的基于四步相移的顯微光場探測光路。圖1中Laser表示激光器，HWP為半波片，PBS為消偏振分光棱鏡，M表示反射鏡，L1表示匯聚透鏡，MO表示顯微物鏡，BS表示分光棱鏡，QWP為四分之一波片，P-CCD為偏振CCD。激光由波長為532 nm的半導(dǎo)體激光器射出，先經(jīng)過線偏振片將橢圓偏振光變?yōu)榫€偏振光，再經(jīng)過由20倍顯微物鏡與10 μm針孔組成的擴束準(zhǔn)直系統(tǒng)，到達(dá)PBS偏振分光棱鏡，由偏振分光棱鏡分為水平偏振光參考光（R光）與豎直偏振光物光（O光）。其中參考光（R光）通過衰減片以控制強度，物光經(jīng)過一個放大倍數(shù)為10、數(shù)值孔徑為0.25的顯微物鏡后經(jīng)過待測物體，之后經(jīng)過一個分光棱鏡合束后經(jīng)過一個1/4波片由偏振CCD記錄。實驗采用的普通CCD型號為BFS-U3-51S5M-C，偏振CCD型號為BFS-U3-51S5P-C，分辨率為2 448×2 048，像素大小為3.45 μm×3.45 μm。

3 ?實驗裝置定標(biāo)測量與結(jié)果分析

3.1 ?探測光纖纖芯相關(guān)參數(shù)

使用搭建的顯微探測光路得到圖像后，計算得到光纖的振幅、相位圖。振幅圖像邊緣明確，圖像清晰，能夠還原目標(biāo)物體原始信息。解包裹得到的相位分布連續(xù)，從相位圖中，能看到光纖纖芯的正面外形特征與側(cè)面厚度特征。通過計算結(jié)果與原數(shù)據(jù)對比，可驗證系統(tǒng)探測的準(zhǔn)確性。

根據(jù)拍攝到的4幅固定相位差的圖像，可以得到物體的強度信息，圖2為還原光纖的強度信息。由于在計算相位信息時，需要用到反正切函數(shù)，從而導(dǎo)致相位被包裹在-π到π之間，無法得到物體的準(zhǔn)確相位信息，因此需要對其進行相位解包裹，得到的結(jié)果如圖3所示。這樣就求得了光纖準(zhǔn)確的相位信息。根據(jù)公式（8），可求得光纖的厚度信息。

本文采用的光纖纖芯半徑為4.1 μm，折射率為1.458 0，在本實驗中，根據(jù)折射率，測得纖芯半徑范圍為4.15 μm，誤差只有1.2%左右，說明本實驗系統(tǒng)可靠性是非常高的。

3.2 ?探測洋蔥鱗片表皮細(xì)胞

采用洋蔥細(xì)胞來驗證偏振測量的輪廓，細(xì)胞形狀已知，厚度清晰，并探測細(xì)胞厚度的數(shù)量級。

為消除振幅重構(gòu)圖像中由于計算殘留的干涉條紋，在程序中增加了基于二維巴特沃斯帶阻濾波器的圖像優(yōu)化算法。采用圖像優(yōu)化算法可以選擇性地減小或抑制特定頻率范圍內(nèi)的信號，從而可以有效地去除噪聲或干擾信號，同時保留有用的圖像細(xì)節(jié)。這有助于提升振幅重構(gòu)圖像的可讀性。此外，在數(shù)字全息術(shù)中，由于采樣和重構(gòu)等因素，可能會引入偽影或其他干擾，導(dǎo)致圖像質(zhì)量下降。算法通過特定頻率的圖像濾波可以有效地抑制特定頻率范圍內(nèi)的偽影或干擾，從而改善圖像的真實性和準(zhǔn)確性。

由于濾波器會帶來一定圖像清晰度的損失，為了清晰觀察微觀物體全息圖的振幅重建圖像的邊緣特征，我們對濾波處理過的振幅重構(gòu)圖像進行銳化處理和邊緣提取，這將進一步改善數(shù)字全息術(shù)中的圖像質(zhì)量和信息提取能力，提升應(yīng)用的可靠性和實用性。

如圖4所示，為經(jīng)過圖像處理后，系統(tǒng)探測洋蔥細(xì)胞得到的結(jié)果。其中振幅圖像邊緣明確，圖像清晰，能夠還原洋蔥細(xì)胞原始信息，能清晰觀察到細(xì)胞結(jié)構(gòu)狀況。解包裹得到的相位分布連續(xù)，從相位圖中，能分析得到洋蔥表皮細(xì)胞在三維空間內(nèi)的立體形狀特征。

4 ?結(jié)論

綜上所述，本文簡述了顯微光場振幅、相位特性實時探測系統(tǒng)的實驗成果與相應(yīng)算法的測試結(jié)果。經(jīng)過數(shù)據(jù)驗證與算法改進，本文搭建的探測系統(tǒng)能實現(xiàn)對顯微物體的振幅和相位信息進行實時、準(zhǔn)確的測量。該技術(shù)現(xiàn)階段可用于顯微測量等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。

這些研究成果的意義不僅僅局限于實驗上的成功。通過深入了解顯微樣本的光學(xué)參數(shù)，這種方法為顯微鏡領(lǐng)域提供了更精確的測量手段，提升了顯微測量的精度和能力。

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