莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）ZLX10對(duì)發(fā)酵雪茄煙葉中性致香成分的影響

趙曉超 李林林 施友志 張貝貝 周亞彬 禹言 張靜亞 瞿歡 普倩 黃友誼 潘勇

摘要：為探究煙草源微生物單菌發(fā)酵對(duì)雪茄煙葉揮發(fā)性致香成分的影響，采用GC-MS檢測(cè)莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）ZLX10發(fā)酵雪茄煙葉中性致香成分，篩選差異致香成分，并與感官評(píng)價(jià)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)合ROAV值變化，明確ZLX10提升雪茄煙葉感官品質(zhì)的關(guān)鍵致香成分。結(jié)果表明， ZLX10發(fā)酵雪茄煙葉后，香氣總量和大多數(shù)中性致香成分含量均顯著提高，共篩選得到15種差異中性致香成分，共有10種致香成分顯著上調(diào)（P<0.05），其中巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮、茄酮和植物醇與煙葉香氣呈顯著正相關(guān)（P<0.05），可認(rèn)為是增加煙葉干香和花香的關(guān)鍵差異致香成分；共有5種致香成分顯著下調(diào)（P<0.05），其中苯乙醛和2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚與煙葉刺激性呈顯著正相關(guān)（P<0.05），對(duì)煙葉香氣有較大的負(fù)面影響。由此可知，ZLX10發(fā)酵能促進(jìn)雪茄煙葉香氣質(zhì)和香氣量得到提升，這為人工接菌發(fā)酵雪茄煙葉提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雪茄煙葉；莫海威芽孢桿菌；煙葉發(fā)酵；中性致香成分

中圖分類號(hào)：S572? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）06-0173-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.028 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of Bacillus mojavensis ZLX10 on the neutral aroma components of

fermented cigar tobacco leaves

ZHAO Xiao-chao1， LI Lin-lin1， SHI You-zhi1， ZHANG Bei-bei2a， ZHOU Ya-bin2a， YU Yan2a，

ZHANG Jing-ya2a， QU Huan2a， PU Qian2b， HUANG You-yi2b， PAN Yong1

（1. China Tobacco Hubei Industrial Co.， Ltd.， Wuhan? 430040， China；2a. College of Life Science and Technology； 2b. College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University，Wuhan? 430070， China）

Abstract：To investigate the effect of mono-bacterial fermentation of tobacco-derived microorganisms on volatile aroma components of cigar tobacco leaves， the neutral aroma components of cigar tobacco leaves fermented by Bacillus mojavensis ZLX10 were detected by GC-MS， the differential neutral aroma components were screened， and the correlation analysis was done with the sensory scores. Combined? with the change of ROAV value， the key aroma components to improve the sensory quality of cigar tobacco leaves by ZLX10 were identified. The results showed that after ZLX10 fermented cigar tobacco leaves， the total aroma and the contents of most neutral aroma components obviously increased. A total of 15 differential neutral aroma components were screened， and a total of 10 aroma components were significantly increased （P<0.05）. Among them， megastigmatrienone A， megastigmatrienone B， 6-methyl-5-hepten-2-one， 2，6，6-trimethyl-2-cyclohexene-1，4-dione， solanone and phytoalcohol were significantly positively correlated with the aroma of cigar tobacco leaves （P<0.05）， which could be considered as the key differential aroma components to increase the dry aroma and floral aroma of cigar tobacco leaves. Five aroma components significantly decreased （P<0.05）， among which phenylacetaldehyde and 2，4-di-tert-butyl-6-nitrophenol were significantly positively correlated with cigar irritability （P<0.05）， and had a greater negative impact on the aroma of tobacco leaves. It could be seen that ZLX10 fermentation could promote the quality and quantity of cigar tobacco leaves aroma， which provided a basis for the fermentation of cigar tobacco leaves by artificial inoculation.

Key words： cigar tobacco leaves； Bacillus mojavensis； tobacco fermentation； neutral aroma components

雪茄煙是最古老的傳統(tǒng)煙草產(chǎn)品之一［1］，經(jīng)過發(fā)酵后的雪茄煙葉香氣更加濃郁、刺激性降低、煙香特征更加顯露［2］。雪茄煙葉發(fā)酵的方法一般分為人工發(fā)酵和自然發(fā)酵，通過人工添加有益微生物可以有效縮短發(fā)酵時(shí)間、降低成本。已有研究表明，微生物能夠改善煙葉香氣，其中芽孢桿菌（Bacillus）和小球菌（Pediococcus）效果尤為突出［3］。李寧等［4］將一株蠟樣芽孢桿菌接種于雪茄煙葉發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)該菌增香提質(zhì)作用明顯。薛磊等［5］將一株可降解β-胡蘿卜素的芽孢桿菌YN14接種于煙絲表面發(fā)酵，煙絲香氣質(zhì)、香氣量等感官品質(zhì)均得到改善。羅家基等［6］將從煙葉中篩選出的優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌隨機(jī)混合用于煙葉發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后煙葉煙香更加明顯。帥瑤等［7］使用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵煙葉，在縮短發(fā)酵時(shí)間的同時(shí)顯著提升了煙葉感官質(zhì)量。黃曉春［8］利用一株具有降煙堿的節(jié)桿菌發(fā)酵煙葉后煙葉香氣量提高、香氣質(zhì)改善、刺激性減弱。李勇等［9］將一株從紅大煙葉表面篩選到的出芽短梗霉菌用于發(fā)酵煙葉，有效降低煙葉雜氣和減少刺激性。黃申等［10］將一株嗜麥芽窄食單胞菌接種于新鮮煙葉后茄酮含量有效提升2倍，香氣品質(zhì)大大提升。多項(xiàng)研究表明，接種微生物發(fā)酵煙葉是改善煙葉品質(zhì)的重要方式。研究表明，莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）親緣關(guān)系密切，區(qū)別僅在于全細(xì)胞脂肪酸組成和DNA序列的差異等［11］。當(dāng)前莫海威芽孢桿菌主要被廣泛報(bào)道于多種植物真菌病害的防治，其對(duì)小麥赤霉病菌Fusarium graminearum、馬鈴薯壞疽病菌Phoma foveata、褐腐病菌Stysanus stemonitis、干腐病菌Fusarium oxysporum和早疫病菌Alternaria solani等多種病原菌均有較好的抑制效果［12，13］。此外，莫海威芽孢桿菌還具有高產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶特性，將其用于山西老陳醋發(fā)酵，可明顯提高風(fēng)味品質(zhì)［14-16］。目前尚未見將莫海威芽孢桿菌用于煙葉發(fā)酵的報(bào)道，為此，將從進(jìn)口雪茄煙支中篩選到的一株莫海威芽孢桿菌ZLX10接種發(fā)酵雪茄煙葉，探究其對(duì)雪茄煙葉中性致香成分的影響，為人工接種發(fā)酵雪茄煙葉提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙葉：原料由湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供，品種：Criollo 98，葉位：上二棚；供試菌株：分離自古巴產(chǎn)羅密歐朱麗葉短身丘吉爾雪茄煙支的莫海威芽孢桿菌ZLX10菌株。培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L，pH 7.0～7.2。乙酸苯乙酯（98%）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；C7-C40正構(gòu)烷烴混標(biāo)為色譜純（BR），購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種制備 將ZLX10菌株接種至牛肉膏液體培養(yǎng)基，于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。菌液以4 000 r/min離心5 min，收集菌體。菌體用無菌水清洗2次，無菌水重懸得菌液，菌劑濃度調(diào)為5.0×108 CFU/mL備用。

1.2.2 發(fā)酵雪茄煙葉 挑取完整片狀雪茄煙葉原料，每份40 g。將ZLX10菌液直接均勻噴灑至雪茄煙葉表面，至接種量為1.0×108 CFU/g煙葉。噴灑無菌水，使雪茄煙葉含水率為40%，參照文獻(xiàn)［17］所述方法進(jìn)行水分測(cè)定。將接種后的雪茄煙葉裝于無菌袋中，密封，于37 ℃恒溫發(fā)酵15 d，取出發(fā)酵雪茄煙葉進(jìn)行分析。對(duì)照組（CK）雪茄煙葉不添加菌，僅添加無菌水至含水率為40%，置于同樣條件發(fā)酵15 d。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 中性致香成分提取與測(cè)定 雪茄煙葉中性致香成分用水蒸氣蒸餾-二氯甲烷溶劑萃取法測(cè)定［18］。發(fā)酵好的雪茄煙葉先剪切，后用植物粉碎機(jī)粉碎，過孔徑0.425 mm篩，低溫保存?zhèn)溆?。? 000 mL圓底燒瓶中加入5.0 g煙樣、0.5 g 檸檬酸、500 mL去離子水和50 μL乙酸苯乙酯（濃度2.23 μg/μL），使用恒溫電熱套進(jìn)行加熱；裝置的另一端接盛有40 mL二氯甲烷的250 mL圓底燒瓶，該端燒瓶置于恒溫水浴鍋中加熱，水浴溫度為60 ℃。同時(shí)蒸餾萃取2.5 h，萃取完成后，加入過量無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到茄形瓶，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至約1 mL，即得煙葉精油。將煙葉精油轉(zhuǎn)移至2 mL棕色氣相瓶中，用于GC-MS分析。

色譜柱：TG-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。載氣He，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，傳輸線溫度280 ℃。離子源溫度177 ℃。升溫程序：初始溫度60 ℃保留2 min，然后以2 ℃/min的升溫速度升至230 ℃，保留15 min，分流比10∶1，進(jìn)樣量為2 μL，電離能70 eV，電離方式EI。質(zhì)量數(shù)范圍35～500 amu，溶劑延遲6 min。

由GC-MS得出正構(gòu)烷烴標(biāo)樣C7-C40和發(fā)酵樣品中各香氣成分色譜峰的保留時(shí)間（RT），計(jì)算物質(zhì)的保留指數(shù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)通過NIST譜庫(kù)進(jìn)行檢索匹配，以匹配值>600，保留指數(shù)誤差不超過15為鑒定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)中的匹配度進(jìn)行定性揮發(fā)物的含量計(jì)算公式如下。

含量=[內(nèi)標(biāo)含量×目標(biāo)物質(zhì)的峰面積/內(nèi)標(biāo)的峰面積煙葉含量]? ?（1）

1.2.4 發(fā)酵后的雪茄茄芯煙葉感官評(píng)析 將發(fā)酵好的雪茄煙葉由6名評(píng)審專家進(jìn)行感官評(píng)析，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括煙葉香氣、刺激性、色澤，各指標(biāo)按檔次分別賦予不同分值，滿分依次為15、15、10分（表1）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有鑒定出的中性致香成分利用TBtools（version 1.0682）進(jìn)行可視化轉(zhuǎn)換。利用|log2FC|>1和獨(dú)立t檢驗(yàn)中P<0.05篩選出顯著變化的物質(zhì)作為差異代謝物并作火山圖。煙葉香氣、刺激性與色澤得分與差異中性致香成分之間采用皮爾遜相關(guān)性方法分析（Pearson correlation coefficient）［19］，通過SPSS 23計(jì)算，利用TBtools（version 1.0682）進(jìn)行可視化。關(guān)鍵中性致香成分采用相對(duì)香氣活力值（Relative odor activity value，ROAV）進(jìn)行比較，閾值查詢采用文獻(xiàn)［20］提供的空氣介質(zhì)覺察閾值，優(yōu)先使用最新年份的閾值數(shù)據(jù)。一般認(rèn)為ROAV≥1的組分為關(guān)鍵香氣成分，0.1≤ROAV<1的組分為修飾香氣成分［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 莫海威芽孢桿菌ZLX10發(fā)酵的雪茄煙葉中性致香成分

為了解莫海威芽孢桿菌ZLX10對(duì)雪茄煙葉香氣品質(zhì)的影響，采用GC-MS檢測(cè)接種ZLX10發(fā)酵后雪茄煙葉中性致香成分?；谡龢?gòu)烷烴（C7-C40）混合標(biāo)準(zhǔn)的保留指數(shù)，共檢測(cè)出43種中性致香成分，根據(jù)結(jié)構(gòu)可以分為烯烴類、酮類、醇類、酯類、醛類和酚類六大類（表2）。各類中性致香成分占比如圖1所示，不同處理雪茄煙葉各類中性致香成分占比均以烯烴類、酮類和醇類致香成分為主，其中烯烴類和醇類致香成分經(jīng)ZLX10發(fā)酵后占比增加最明顯，分別增加7.06個(gè)百分點(diǎn)和5.78個(gè)百分點(diǎn)。經(jīng)ZLX10發(fā)酵后與對(duì)照相比，各類中性致香成分的香氣量及種類有一定改變（表2），對(duì)致香成分相對(duì)含量進(jìn)行Z-score歸一化處理并繪制聚類熱圖如圖2所示。雪茄煙葉中性致香成分總量由1 104.18 μg/g提高至1 606.62 μg/g，提升45.50%；中性致香成分的種類均為39種，但具體種類發(fā)生改變；中性致香成分含量增加的種類主要是烯烴類、酮類、醇類和酚類，分別由295.95、293.76、233.33、33.10 μg/g增加至543.94、401.36、427.95、67.99 μg/g，分別增加83.8%、36.6%、85.8%和105.4%。含量增加的烯烴類主要包括正十五烷、新植二烯、正二十五烷和正二十七烷，分別從5.45、143.30、22.64、116.18 μg/g增加至30.27、301.59、33.83、171.87 μg/g。含量增加的酮類共10種，包括香葉基丙酮、2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮、茄酮、β-大馬酮、巨豆三烯酮A和巨豆三烯酮B等與香氣質(zhì)有較大正面影響的物質(zhì)［22］，分別增加15.0%、34.8%、76.8%、12.5%、175.8%和253.3%。醇類含量增加的共有7種，包括（S）-氧化芳樟醇、2，6-二甲基環(huán)己醇、反-橙花叔醇、異植醇、香葉基芳樟醇、2，7，11-西柏三烯-4-醇和植物醇；植物醇含量從176.08 μg/g提高至340.93 μg/g，是含量最高的醇類成分。酯類和醛類的總量分別減少14.9%和85.8%，減少的成分包括（R）-二氫獼猴桃內(nèi)酯、苯乙醛、2，6，10-三甲基-9-烯-十一醛、3-（2，6，6-三甲基-1-環(huán)己烯基）-2-丙烯醛和十五烷醛。此外，經(jīng)ZLX10發(fā)酵后中性致香成分種類增加了酮類6-甲基-5-庚烯-2-酮、醇類（S）-氧化芳樟醇和香葉基芳樟醇、酯類4，8，12，16-四甲基十七烷-4-內(nèi)酯，而存在對(duì)照中的2，6二甲基壬烷、苯乙醛、（R）-二氫獼猴桃內(nèi)酯和2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚則未檢出。從以上可知，經(jīng)ZLX10發(fā)酵后雪茄香氣總量及多種致香成分的含量呈增加趨勢(shì)，主要為烯烴類、酮類、醇類和酚類，包括2種葉綠素降解物新植二烯和植物醇，西柏烷類降解物茄酮，7種類胡蘿卜素降解物6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮、β-大馬酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、香葉基丙酮、金合歡基丙酮；減少的成分主要為酯類和醛類，包括苯丙氨酸降解物苯乙醛，類胡蘿卜素降解物（R）-二氫獼猴桃內(nèi)酯。

2.2 莫海威芽孢桿菌ZLX10發(fā)酵雪茄煙葉中差異中性致香成分

差異致香成分的篩選能夠更加明確莫海威芽孢桿菌ZLX10發(fā)酵對(duì)雪茄煙葉中性致香成分的影響，為此根據(jù)發(fā)酵后致香成分的含量，通過倍數(shù)變化分析（Fold change，F(xiàn)C）和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以|log2FC|>1和P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異致香成分，分析了ZLX10發(fā)酵后雪茄煙葉中具有顯著變化的致香成分，結(jié)果如圖3所示。共篩選出15種差異中性致香成分，顯著上調(diào)（P<0.05）的有10種，包括酮類的巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮、茄酮，醇類的（S）-氧化芳樟醇、香葉基芳樟醇、植物醇，烯烴類的新植二烯，酯類的4，8，12，16-四甲基十七烷-4-內(nèi)酯；顯著下調(diào)（P<0.05）有5種成分，包括2，6二甲基壬烷、 （R）-二氫獼猴桃內(nèi)酯、苯乙醛、3-（2，6，6-三甲基-1-環(huán)己烯基）-2-丙烯醛和2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚。差異致香成分以酮類、醇類為主，這與之前的研究類似［23，24］。

2.3 莫海威芽孢桿菌ZLX10發(fā)酵雪茄煙葉關(guān)鍵差異中性致香成分

對(duì)發(fā)酵雪茄煙葉香氣、刺激性、色澤進(jìn)行感官評(píng)析，結(jié)果如表3所示。與對(duì)照組相比，經(jīng)ZLX10發(fā)酵后煙葉香氣、色澤得分提高，刺激性減少，總體得分高于未接菌雪茄煙葉，說明ZLX10發(fā)酵后雪茄煙葉的整體品質(zhì)有所提升。中性致香成分含量與煙葉感官品質(zhì)關(guān)系密切，為明晰ZLX10發(fā)酵雪茄煙葉差異致香成分與煙葉品質(zhì)的相關(guān)性，采用皮爾遜相關(guān)性系數(shù)分析差異中性致香成分與煙葉色澤、香氣、刺激性評(píng)分之間的相關(guān)性并作熱圖，結(jié)果如圖4所示。共有11種差異致香成分與香氣呈正相關(guān)，其中巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、茄酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮、植物醇和新植二烯達(dá)顯著正相關(guān)（P<0.05）。另一方面，共有5種成分與刺激性呈正相關(guān)，其中苯乙醛和2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚達(dá)顯著正相關(guān)（P<0.05）。從兩種處理雪茄煙葉中性致香成分與感官評(píng)分相關(guān)性明顯可知，巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、植物醇、茄酮、新植二烯、2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮可認(rèn)為是ZLX10發(fā)酵雪茄煙葉后的關(guān)鍵差異中性致香成分，這些關(guān)鍵差異致香成分的增加對(duì)改善煙葉香氣發(fā)揮了重要的作用。

為確定雪茄煙葉中性致香成分對(duì)整體的香氣貢獻(xiàn)，根據(jù)相對(duì)定量結(jié)果和各致香成分閾值計(jì)算了ROAV值，結(jié)果如表4所示。未接菌發(fā)酵樣共鑒定出12種ROAV值大于1的致香物質(zhì)，包括酮類5種（異佛爾酮、2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮、香葉基丙酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B），醇類3種（芳樟醇、反-橙花叔醇、植物醇），酯類2種（（R）-二氫獼猴桃內(nèi)酯、鄰苯二甲酸二丁酯），醛類1種（苯乙醛），酚類1種（2，4-二叔丁基苯酚）。其中2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮（100.000）、巨豆三烯酮A（42.156）和香葉基丙酮（40.533）貢獻(xiàn)最大，ROAV均大于40，被認(rèn)為對(duì)未接菌雪茄煙葉香氣具有重要貢獻(xiàn)；其次是苯乙醛（38.376）、巨豆三烯酮B（30.111）、反-橙花叔醇（20.510）、植物醇（15.559）、（R）-二氫獼猴桃內(nèi)酯（13.404）和異佛爾酮（15.685），其ROAV均大于10，同樣對(duì)雪茄煙葉香氣具有重要貢獻(xiàn)。而ZLX10發(fā)酵煙葉中共有11種ROAV值大于1的致香物質(zhì)，包括酮類6種（異佛爾酮、2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮、茄酮、香葉基丙酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B），醇類3種（芳樟醇、反-橙花叔醇、植物醇），酯類1種（鄰苯二甲酸二丁酯），酚類1種（2，4-二叔丁基苯酚）。其中2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮（100.000）、巨豆三烯酮A（85.977）和巨豆三烯酮B（79.189）貢獻(xiàn)最大，ROAV均大于40，被認(rèn)為對(duì)ZLX10發(fā)酵茄芯煙葉香氣具有重要貢獻(xiàn)；其次是香葉基丙酮（37.570）、反-橙花叔醇（19.017）、植物醇（22.858）和異佛爾酮（11.540），其ROAV均大于10。從以上可知，經(jīng)過ZLX10發(fā)酵雪茄煙葉后，具有干果香和花香的致香成分貢獻(xiàn)增大，而具有清涼感和樟腦氣味的致香成分貢獻(xiàn)減少，關(guān)鍵差異中性致香成分中巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、植物醇、茄酮、2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮對(duì)雪茄煙葉香氣品質(zhì)的貢獻(xiàn)增大，可增加雪茄煙葉的干果香、花香香韻，進(jìn)一步闡明了ZLX10發(fā)酵后關(guān)鍵差異致香成分的重要性。

3 討論與結(jié)論

酮類中性致香成分對(duì)煙葉品質(zhì)具有重要作用［25］，接種莫海威芽孢桿菌ZLX10后增加的酮類中茄酮有新鮮胡蘿卜香氣，可使煙氣醇和、增加甜潤(rùn)感、香氣豐滿細(xì)膩、掩蓋雜氣、降低刺激性［26，27］；香葉基丙酮、β-大馬酮具有玫瑰特征香氣，能減少刺激性，是增加卷煙清甜香的關(guān)鍵成分，廣泛應(yīng)用于卷煙加香［28，29］；2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮具有干草香，可作為煙用香精［30，31］；巨豆三烯酮類具有煙草香和辛香底韻，可使煙氣和順、有效改善側(cè)流煙氣并增加舒適度，還可增加煙葉中的花香和木香特征，是煙草中重要的香氣成分，其含量的增加對(duì)煙葉香味品質(zhì)提升具有重要作用［28，32，33］；6-甲基-5-庚烯-2-酮能增加雪茄煙花果香韻［34］。增加的醇類中香葉基芳樟醇和植物醇具有花香和木香香調(diào)［35］，能增加雪茄花香風(fēng)味；反-橙花叔醇的風(fēng)味特征以清香、花果香為主［36］。由以上可知，ZLX10發(fā)酵雪茄煙葉提高的致香成分多具有煙草干香、花果香等特征，研究表明莫海威芽孢桿菌具有蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶等多種碳水化合物活性酶，而淀粉酶可將淀粉水解成小分子還原糖，糖類成分又與氨基酸縮合生成煙葉香氣前體物，提升煙葉香氣品質(zhì)［37］。在多種酶促作用下，煙葉中的大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、β-胡蘿卜素、葉綠素和西柏烷發(fā)生降解生成香味物質(zhì)進(jìn)而提升煙葉香氣品質(zhì)［24］。

使用進(jìn)口雪茄煙支優(yōu)勢(shì)菌ZLX10發(fā)酵與未接菌發(fā)酵雪茄煙葉處理相比，共篩選得到15種差異致香成分，其中10種呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，同時(shí)與雪茄煙葉香氣呈正相關(guān)，其中巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、茄酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮、植物醇和新植二烯達(dá)顯著正相關(guān)（P<0.05）。于建軍等［31］采用多元統(tǒng)計(jì)典型相關(guān)分析煙葉各類中性致香成分與香氣關(guān)系結(jié)果表明巨豆三烯酮A對(duì)香氣影響最大，并表現(xiàn)為顯著的正相關(guān)；2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1，4-二酮是影響香氣量的主要成分，且與香氣呈正相關(guān)［31，38］；類西柏烷類降解產(chǎn)物茄酮對(duì)香氣質(zhì)有較大的正面影響［39］；姜慧娟等［40］對(duì)中性致香物質(zhì)與煙葉香氣質(zhì)量關(guān)系研究表明，6-甲基-5-庚烯-2-酮對(duì)香氣質(zhì)的正面影響最大；新植二烯是煙草中性揮發(fā)物中含量最高的成分，也是煙葉主要致香成分的前體［41］，其本身不具香氣或香氣較弱，但對(duì)香氣質(zhì)、柔細(xì)度、透發(fā)性等影響較大，可作為捕集煙氣氣溶膠中香氣的載體，具有攜帶煙葉中揮發(fā)性香氣物質(zhì)進(jìn)入煙氣的能力［42，43］，本研究與前人研究一致。共有2種中性致香成分與雪茄煙葉香氣呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），分別為苯乙醛和2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚。苯乙醛具有花香，可增加煙葉的清甜香和青香，但是和焦甜香和焦香香韻呈顯著負(fù)相關(guān)［44］，而在本研究中苯乙醛含量的減少并未導(dǎo)致雪茄煙葉香氣削減，這可能與煙葉中其他致香成分的增加有關(guān)，更加說明煙葉香氣品質(zhì)的提升是多種致香成分共同協(xié)調(diào)的結(jié)果，單一物質(zhì)含量的增減對(duì)煙葉香氣影響有限；2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚常見于酒類飲品揮發(fā)性物質(zhì)中［45-47］，但目前并未見其與感官品質(zhì)相關(guān)性的研究，本研究結(jié)果表明其與雪茄煙葉刺激性呈顯著正相關(guān)（P<0.05），對(duì)煙葉香氣存在較大的負(fù)面影響， ZLX10發(fā)酵后未檢測(cè)到2，4-二叔丁基-6-硝基苯酚，該成分的消減可能對(duì)煙葉香氣起到了積極的作用。此外，顯著降低的香氣成分中，未檢測(cè)到類胡蘿卜素降解產(chǎn)物（R）-二氫獼猴桃內(nèi)酯，推測(cè)ZLX10可能抑制了相關(guān)降解途徑。

本研究通過接種進(jìn)口雪茄優(yōu)勢(shì)菌ZLX10，提升雪茄煙葉感官品質(zhì)，結(jié)果表明處理后的煙葉香氣量及豐富性增加，干香和花香增加，刺激性減少，莫海威芽孢桿菌（Bacillus? mojavensis）ZLX10有望成為提升雪茄煙葉品質(zhì)的優(yōu)良菌種。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 牛 浩，周中宇，白金瑩，等.雪茄煙發(fā)酵的研究進(jìn)展［J］.湖南文理學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2020，32（4）：60-63，68.

［2］ SRIVASTAVA R P. Biochemical transformations in leaf pigments and chemical constituents during air-curing of cigar wrapping tobacco［J］.Tobacco research，1988，14（2）：83-88.

［3］ 張玉姣，宋金鵬，郭學(xué)民，等.煙葉微生物菌群變化及微生物在煙葉中的應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.中國(guó)釀造，2022，41（6）：31-36.

［4］ 李 寧，汪長(zhǎng)國(guó)，曾代龍，等.蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）篩選鑒定及在雪茄煙葉發(fā)酵中的應(yīng)用研究［J］.中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2012，18（2）：65-69.

［5］ 薛 磊，鄭澤浩，郭志剛，等.煙草增香細(xì)菌的篩選及其作用效果［J］.中國(guó)煙草科學(xué)，2019，40（5）：60-67.

［6］ 羅家基，朱子高，羅 毅，等.微生物在煙葉發(fā)酵過程中的作用［J］.煙草科技，1998（1）：6.

［7］ 帥 瑤，陶 菡，田運(yùn)霞，等.復(fù)合菌種發(fā)酵煙葉產(chǎn)酶及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，49（10）：162-175.

［8］ 黃曉春.降堿增香微生物制劑改善煙葉品質(zhì)研究與應(yīng)用［D］.長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［9］ 李 勇，王 猛，陳劍明，等.出芽短梗霉OF-01菌株的篩選及其在煙草香料中的應(yīng)用［J］.輕工學(xué)報(bào)，2017，32（4）：49-57.

［10］ 黃 申，夏 璠，錢玉梅，等.西柏三烯-4，6-二醇降解產(chǎn)香菌培養(yǎng)基條件優(yōu)化［J］.煙草科技，2017，50（12）：55-60，69.

［11］ ROBERTS M S，NAKAMURA L K，COHAN F M. Bacillus mojavensis sp.nov.，distinguishable from Bacillus subtilis by sexual isolation，divergence in DNA sequence，and differences in fatty acid composition［J］.International journal of systematic bacteriology，1994，44（2）：256-264.

［12］ 劉 龍，榮 華，鄭童童，等.莫海威芽孢桿菌對(duì)梨腐爛病的抑菌防病效果［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2022，38（18）：140-146.

［13］ 馮中紅，暢 濤，楊成德，等.一株抗馬鈴薯壞疽病莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis ZA1）培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2016，25（2）：77-86.

［14］ 郭宏萍.優(yōu)良菌株組合發(fā)酵對(duì)食醋大曲和釀造過程中的代謝調(diào)控［D］.山西晉中：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2021.

［15］ 李曉梅.山西老陳醋源優(yōu)良芽孢桿菌的篩選、互作及原位強(qiáng)化研究［D］.山西晉中：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

［16］ 孫建平.山西老陳醋釀造川芎嗪的生成規(guī)律及菌株代謝調(diào)控［D］.山西晉中：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2021.

［17］ YC/T 31—1996，煙草及煙草制品 試樣的制備和水分的測(cè)定 烘箱法［S］.

［18］ 趙曉丹，史宏志，錢 華，等.不同類型煙草常規(guī)化學(xué)成分與中性致香物質(zhì)含量分析［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，27（3）：234-238.

［19］ 馬京民，劉國(guó)順，時(shí)向東，等.主成分分析和聚類分析在煙葉質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用［J］.煙草科技，2009（7）：57-60.

［20］ 里奧·范海默特.化合物嗅覺閾值匯編（第二版）［M］. 北京：科學(xué)出版社，2018.

［21］ 劉登勇，周光宏，徐幸蓮.確定食品關(guān)鍵風(fēng)味化合物的一種新方法：“ROAV”法［J］.食品科學(xué)，2008（7）：370-374.

［22］ 陶 陶，來 苗，姬小明，等.烤煙類胡蘿卜素及其降解產(chǎn)物與香氣特性的關(guān)系研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，29（2）：294-297.

［23］ 王 芳，歐明毅，楊 超，等.茅臺(tái)酒致香微生物對(duì)煙葉致香成分影響［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（6）：89-93，97.

［24］ 毛多斌，黃曉玉，周利峰，等.枯草芽孢桿菌分離鑒定及其對(duì)煙葉化學(xué)成分和吸味品質(zhì)的影響［J］.煙草科技，2022，55（8）：10-19.

［25］ 薛 云，寧振興，蘇 贊，等.基于芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵技術(shù)提高廣西河池C4F煙葉品質(zhì)的研究［J］.輕工學(xué)報(bào)，2022，37（5）：76-84.

［26］ 毛多斌，賈春曉，張峻松，等.茄酮及其降解產(chǎn)物系列香料合成研究進(jìn)展［J］.鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998（2）：59-63.

［27］ 孔寧川，陳永寬，楊偉祖，等.異茄酮——5-異丙基-8-甲基-5，8-壬二烯-2-酮的合成及在煙草加香中的應(yīng)用［J］.云南化工，2002（3）：4-6.

［28］ 趙銘欽，劉金霞，黃永成，等.煙草質(zhì)體色素與煙葉品質(zhì)的關(guān)系綜述［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007（7）：135-138.

［29］ 劉 哲.基于香氣活力值的煙葉、卷煙、煙草添加劑主要香氣成分研究［D］.昆明：昆明理工大學(xué)，2020.

［30］ 謝劍平.煙草香原料［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009.

［31］ 于建軍，楊寒文，畢慶文，等.烤煙中性致香成分與香氣質(zhì)量的典型相關(guān)分析［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44（2）：72-76，104.

［32］ 王能如，李章海，王東勝，等.我國(guó)烤煙主體香味成分研究初報(bào)［J］.中國(guó)煙草科學(xué)，2009，30（3）：1-6.

［33］ 劉 金，劉復(fù)初，朱洪友.巨豆三烯酮的合成研究概況［J］.云南化工，2006（1）：38-40.

［34］ 于 航，劉硯婷，尚夢(mèng)琦，等.基于致香成分分析的雪茄煙產(chǎn)地間差異［J］.煙草科技，2021，54（9）：58-71.

［35］ 貊志杰，鄧帥軍，史素娟，等.烤煙品種中煙特香301烤后煙葉石油醚提取物分析［J］.中國(guó)煙草科學(xué)，2022，43（3）：71-77.

［36］ 嵇偉彬，劉盼盼，許勇泉，等.幾種烏龍茶香氣成分比較研究［J］.茶葉科學(xué)，2016，36（5）：523-530.

［37］ 田永峰，楊 柳，董高峰，等.解淀粉芽孢桿菌GUHP-86在口含煙煙草原料發(fā)酵中的提質(zhì)降害研究［J］.中國(guó)釀造，2019，38（10）：133-137.

［38］ 周富臣，戚萬敏，張紅雙，等.氧化異佛爾酮及其在卷煙加香中的作用［J］.煙草科技，1997（1）：27.

［39］ 于建軍，龐天河，章新軍，等.鄂西南烤煙吸食質(zhì)量與致香物質(zhì)的關(guān)系［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006（4）：355-358.

［40］ 姜慧娟，趙銘欽，任 偉，等.濃香型烤煙中性致香成分及多酚含量與香氣質(zhì)量的關(guān)系研究［J］.中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2014，20（5）：25-30.

［41］ 許美玲，焦芳嬋，吳興富，等.烤煙種質(zhì)資源致香成分分析［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2022，34（2）：127-139.

［42］ 李許濤，武廣鵬，高相彬，等.平頂山煙區(qū)烤煙中性香氣成分與感官評(píng)吸質(zhì)量分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（31）：48-51，57.

［43］ 周 昆，周清明，胡曉蘭.烤煙香氣物質(zhì)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)煙草科學(xué)，2008（2）：58-61.

［44］ 王鵬澤，來 苗，陶 陶，等.不同香型烤煙主要香味物質(zhì)成分與香韻指標(biāo)的關(guān)系研究［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2015，17（3）：126-135.

［45］ 劉 歡，李 皓，陳長(zhǎng)武，等.β-葡萄糖苷酶對(duì)‘雙優(yōu)干紅葡萄酒理化性質(zhì)和香氣物質(zhì)的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2018，? ? ?44（11）：138-146.

［46］ 謝春梅，焦紅茹，曹芳玲.寧夏青銅峽小產(chǎn)區(qū)不同品種干紅葡萄酒的香氣成分分析［J］.中國(guó)釀造，2018，37（1）：170-176.

［47］ 姚燁岑，郭 明，葉 博，等.新型水果時(shí)尚黃酒中風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS檢測(cè)分析及指紋圖譜構(gòu)建［J］.釀酒科技，2022（4）：127-131.