藻藍(lán)蛋白對小鼠皮膚損傷的治療效果

邵麗林 解佑銀 張雷芳

摘要：為探討藻藍(lán)蛋白（CPC）對小鼠皮膚損傷的治療效果，將ICR小鼠分為正常對照組（Con）、模型組（Mod）、空白敷料組（BD）、藻藍(lán)蛋白敷料組（CPC TDD）和藻藍(lán)蛋白敷料+藻藍(lán)蛋白腹腔注射組（CPC+ip.）5個處理組進(jìn)行小鼠燙傷試驗。結(jié)果表明，CPC TDD組和CPC+ip.組傷口愈合時間最短，可以降低血清中丙二醛（MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）含量，降低血清中炎癥因子TNF-α和IL-6的水平。藻藍(lán)蛋白通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，降低炎癥因子水平，從而對皮膚損傷的愈合起到促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：藻藍(lán)蛋白；小鼠；皮膚損傷；傷口愈合；燙傷；海水浸泡

中圖分類號：R965? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）06-0141-10

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.023 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

The therapeutic effect of phycocyanin on skin damage in mice

SHAO Li-lin， XIE You-yin， ZHANG Lei-fang

（School of Food and Pharmacy， Zhejiang Ocean University/Zhejiang Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Biomedical Products ， Zhoushan? 316022， Zhejiang， China）

Abstract：To investigate the therapeutic effect of C-phycocyanin （CPC） on skin injuries in mice， ICR mice were divided into five groups： normal control group （Con）， model group （Mod）， blank dressing group （BD）， CPC-treated dressing group （CPC TDD）， and CPC-treated dressing plus intraperitoneal injection of CPC group （CPC+ip.） for conducting mouse scalding experiments. The results showed that the wound healing time was the shortest in the CPC TDD and CPC+ip. groups， which could reduce the content of malondialdehyde （MDA） in serum， increase the content of superoxide dismutase （SOD）， and decrease levels of inflammatory factors TNF-α and IL-6 in serum. Phycocyanin could promote skin injury healing by enhancing antioxidant capacity and reducing levels of inflammatory factors.

Key words： C-phycocyanin； mice； skin injury； wound healing； scalding； seawater immersion

隨著中國海洋事業(yè)活動日益頻繁，周邊海洋局勢較為復(fù)雜，海上事故合并燒傷發(fā)生率日益增高［1，2］。海水具有高滲、堿性、低溫、有菌等特殊理化性質(zhì)，燒傷合并海水浸泡會造成機(jī)體高滲狀態(tài)、電解質(zhì)紊亂、血流動力學(xué)紊亂以及創(chuàng)面組織微循環(huán)障礙；繼發(fā)損傷較重，易造成多臟器功能衰竭，如急性肺損傷［3］。

藻藍(lán)蛋白（C-phycocyanin，CPC）呈藍(lán)色粉末狀，溶于水，不溶于脂類物質(zhì)。藻藍(lán)蛋白分子由開鏈四吡咯化合物和脫輔蛋白經(jīng)硫醚鍵結(jié)合形成［4］。螺旋藻的藻藍(lán)蛋白生產(chǎn)率和單位生物量中藻藍(lán)蛋白含量均為相對較高［5］。在藥學(xué)研究中，CPC已被應(yīng)用于治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的疾病以及作為強(qiáng)大的抗炎劑［6-8］和抗氧化劑［9-11］。近幾年，關(guān)于藻藍(lán)蛋白的研究主要有色素藻藍(lán)蛋白，藻藍(lán)蛋白熒光性，藻藍(lán)蛋白的抗氧化、抗癌活性以及藻藍(lán)蛋白改性與穩(wěn)定性研究等［12］。目前，國內(nèi)外已有報道藻藍(lán)蛋白具有強(qiáng)大的傷口愈合效果，安全系數(shù)很高。Madhyastha等［13］證實了CPC加速傷口愈合，一方面通過細(xì)胞周期依賴性激酶CDK1和CDK2誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖；另一方面促進(jìn)細(xì)胞向傷口遷移，后續(xù)制備可生物降解的CPC支架［14］，在小鼠皮膚損傷中應(yīng)用加速傷口愈合的第一階段。Manconi等［15］的研究發(fā)現(xiàn)常規(guī)磷脂微囊能夠提高CPC在小鼠體內(nèi)抗炎活性，并呈劑量依賴關(guān)系，而脂質(zhì)體僅使用1/2的CPC劑量就能產(chǎn)生與游離蛋白相同的抗炎反應(yīng)；Madhyastha等 ［16］將藻藍(lán)蛋白（CPC）作為原材料合成了毒性較低的真皮創(chuàng)面修復(fù)材料銀納米顆粒（AgCPCNPs），具有CPC作為創(chuàng)面修復(fù)劑和Ag納米金屬作為抗菌劑的雙重優(yōu)勢。

本研究將藻藍(lán)蛋白制備成敷料，通過小鼠皮膚損傷試驗對其抗炎、抗氧化、加速創(chuàng)面愈合等治療效果進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性ICR小鼠90只（合格證號：20201130Abzz0105999214 SPF級），小鼠全身皮膚完好無損傷，體重20～25 g。飼養(yǎng)小鼠所用的60Co滅菌飼料和滅菌墊料均由浙江省實驗動物中心提供。

1.1.2 儀器 YP1002N型電子天平、BT125D型分析天平（上海民僑精密科學(xué)儀器有限公司），UPT-II-60L型落地式超純水機(jī)（上海四科儀器設(shè)備有限公司），CF16RN型高速臺式冷凍離心機(jī)（日本HITACHI公司），DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司），DHG-9140A型鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.1.3 試劑 PVA-124、藻藍(lán)蛋白（CPC）、乙醇、羥苯乙酯、丙二醇、氮酮、水合氯醛、硫化鈉、氯化鈉、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈣、溴化鈉、碳酸氫鈉、氯化鉀均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；白介素-6（IL-6）試劑盒、腫瘤壞死因子（TNF-α）試劑盒購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藻藍(lán)蛋白敷料的制備 稱取0.9 g PVA-124和0.03 g羥苯乙酯加入純水中，置于90 ℃水浴中溶脹24 h，膠體冷卻備用。稱取0.03 g CPC加入膠體中溶解，再加入5 mL 無水乙醇、0.3 mL 1%丙二醇溶液及0.3 mL 1%氮酮溶液混合均勻，加入ddH2O定容至30 mL備用。

1.2.2 海水條件 所用海水按照國家海洋局第三海洋研究所配方配制（表1），主要成分及含量接近于中國東南沿海海水，pH 8.2、相對密度1.05、滲透壓 1 300 mmol/L，利用0.22 μm過濾膜過濾后置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 動物模型的制備分組及給藥

1）小鼠試驗分組及給藥。將小鼠隨機(jī)分為正常對照組（Control group，Con）、模型組（Model group， Mod）、空白敷料對照組（Blank dressing group， BD）、藻藍(lán)蛋白敷料組（C-phycocyanin transdermal drug delivery group， CPC TDD）、藻藍(lán)蛋白敷料+藻藍(lán)蛋白腹腔注射組（CPC transdermal drug delivery+CPC intraperitoneal injection group，CPC+ip.）。給藥方法如表2所示。

2）燙傷試驗。①取30只小鼠，自由進(jìn)食和飲水，飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境條件下［溫度（24±2） ℃，40%～60%濕度和12 h光-暗循環(huán)］，適應(yīng)1周后進(jìn)行試驗。②脫毛：使用8 g NaS與100 mL ddH2O制作脫毛劑，給小鼠脫毛，放置24 h使其自然恢復(fù)。③造模：每只小鼠腹腔注射10%的水合氯醛溶液（0.04 mL/10 g），麻醉小鼠。然后將已預(yù)熱的直徑為1.5 cm的圓形砝碼［（95±2） ℃］，用攝子夾緊放在小鼠背部脫毛區(qū)域燙傷10 s，造成小鼠皮膚燙傷，保持每只小鼠燙傷區(qū)域一致。

3）燙傷后海水浸泡試驗。重復(fù)上述燙傷試驗，將燙傷后的小鼠馬上捆綁固定，在預(yù)先準(zhǔn)備的海水中浸泡1 h。將小鼠打撈出來后，用生理鹽水沖洗傷口。

4）創(chuàng)傷后海水浸泡試驗。小鼠脫毛區(qū)域用75%的乙醇溶液消毒，背部脊柱切割一個1 cm×1 cm的正方形傷口，傷口深至皮膚黏膜層。小鼠致傷后海水浸泡1 h，將小鼠打撈出水后，擦干體表的海水，用生理鹽水沖洗傷口。

1.2.4 指標(biāo)檢測

1）體重。檢測傷口愈合過程中小鼠體重變化，觀察小鼠體重變化趨勢。

2）傷口愈合時間。從致傷時開始，至創(chuàng)傷表面開始結(jié)痂傷口基本愈合為止，記錄各組小鼠的傷口愈合時間。

3）傷口面積及傷口愈合率變化。在第3、7、14天記錄小鼠創(chuàng)后的傷口面積，計算傷口愈合率。傷口愈合率=［（傷口初始面積-測量當(dāng)日面積）/傷口初始面積］×100%。

4）組織學(xué)分析。在致傷后第3、7、14天，將小鼠麻醉后，于創(chuàng)傷表面切取大小為1 cm×1 cm，厚度不超過3 mm的組織標(biāo)本，采用HE染色法觀察皮膚組織學(xué)變化，評估其病理變化。

5）測定血清中炎癥因子和抗氧化因子水平。測定血清中的TNF-α、IL-6、MDA和SOD含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示。組內(nèi)多重比較采用t 檢驗方法，然后采用紐曼-科伊爾斯檢驗。P<0.05時，對比組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 燙傷試驗結(jié)果

2.1.1 造模效果 造模效果見圖1。

2.1.2 藻藍(lán)蛋白對小鼠體重的影響 如圖2所示，Con組小鼠體重平穩(wěn)增長，除Con組外，其他處理組小鼠體重總體初期都有先降低后升高的趨勢；CPC+ip.組體重恢復(fù)最快，CPC TDD組其次；燙傷后期CPC+ip.組恢復(fù)接近Con組。結(jié)果表明，由于燙傷初期，小鼠出現(xiàn)脫水、食欲降低、炎癥等癥狀而導(dǎo)致小鼠體重下降，藻藍(lán)蛋白治療具有促進(jìn)小鼠體重恢復(fù)的作用。

2.1.3 藻藍(lán)蛋白對傷口面積變化影響 由圖3、圖4可知，Mod組傷口愈合速度最慢，在第14天時仍未完全愈合，BD組與Mod組狀態(tài)相似。與Mod組相比，CPC TDD組愈合速度快，在第14天時傷口基本愈合。與其他組相比，CPC+ip.組的傷口愈合速度最快，在第14天時傷口已完全愈合并且體毛開始恢復(fù)。結(jié)果表明，小鼠背部燙傷后，組織液大量滲出，繼而組織液干燥硬化，形成痂皮?？瞻追罅蠈ζつw愈合幾乎無作用，藻藍(lán)蛋白對皮膚愈合具有促進(jìn)作用，并且輔以腹腔注射效果更佳。

2.1.4 組織學(xué)變化結(jié)果 如圖5所示，在創(chuàng)面愈合過程中，早期大量的血小板聚集形成凝塊，逐漸硬化形成痂皮。創(chuàng)緣毛細(xì)血管通透性增加，大量炎性細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞）滲出，主要集中于創(chuàng)緣周圍。3 d時各組上皮細(xì)胞明顯破壞，上皮組織大部分脫落；7 d時CPC TDD組和CPC+ip.組已經(jīng)有較多愈合和即將愈合的部分；14 d時CPC TDD和CPC+ip.組鏡下表皮細(xì)胞排列整齊、連續(xù)，上皮細(xì)胞著色良好，真皮層組織及附屬結(jié)構(gòu)清晰完整，真皮膠原細(xì)胞排列整齊。Mod和BD組可見表皮層次尚清楚，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，層次結(jié)構(gòu)尚清楚，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不清。結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白能促進(jìn)燙傷傷口結(jié)構(gòu)修復(fù)，保護(hù)皮膚組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。

2.1.5 藻藍(lán)蛋白對燙傷小鼠血清中MDA和SOD含量影響 由圖6可知，與Mod組相比，CPC+ip.組血清中MDA含量顯著減少，SOD含量顯著增加（P<0.05），而CPC TDD組血清中MDA含量也有減少，SOD含量增加，但不顯著。結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白能促進(jìn)小鼠的SOD表達(dá)，降低MDA含量來提高小鼠抗氧化能力，從而促進(jìn)傷口愈合。

2.1.6 藻藍(lán)蛋白對燙傷小鼠血清中TNF-α和IL-6含量影響 如圖7所示，與Con組相比，Mod組血清中TNF-α和IL-6含量增加。與Mod組相比，CPC+ip.組血清中TNF-α和IL-6含量顯著減少（P<0.05）。由此可見，藻藍(lán)蛋白通過下調(diào)炎癥因子表達(dá)來減輕燙傷小鼠的炎癥反應(yīng)。

2.2 燙傷后海水浸泡試驗結(jié)果

2.2.1 造模效果 造模效果如圖8所示。

2.2.2 藻藍(lán)蛋白對小鼠體重的影響 如圖9所示，Con組體重基本呈平穩(wěn)增長趨勢，Mod組、BD組和CPC TDD組體重先下降再上升，CPC+ip.組體重呈上升趨勢，明顯高于其他處理組。結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白可以促進(jìn)小鼠體重恢復(fù)，且輔以腹腔注射效果更佳。

2.2.3 藻藍(lán)蛋白對傷口面積變化影響 如圖10、圖11所示，Mod組和BD組14 d時傷口仍未愈合，傷口愈合率比其他兩組都低，并還有結(jié)痂存在。CPC TDD和CPC+ip.兩組小鼠掉痂所用時間均低于Mod和Con組，并且CPC+ip.組用時最短。CPC+ip.組在第14天時傷口已基本完全愈合。結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白可以促進(jìn)小鼠損傷皮膚愈合，并且輔以腹腔注射效果最佳。

2.2.4 組織學(xué)變化結(jié)果 由圖12可知，小鼠致傷? ?3 d后所有處理組小鼠的創(chuàng)面組織都出現(xiàn)不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜下層疏松，毛囊被破壞。Mod組和BD兩組創(chuàng)面組織的炎癥程度較CPC+ip.和CPC TDD兩組明顯加重，黏膜上皮細(xì)胞脫落情況嚴(yán)重，細(xì)胞排列稀疏且不規(guī)整。第7天，CPC+ip.組小鼠炎癥程度明顯減輕，毛囊增多，表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整且增殖旺盛，其他處理組表皮細(xì)胞還較稀疏，排列不規(guī)整。第14天，CPC+ip.和CPC TDD兩組的小鼠創(chuàng)面已接近愈合，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整且排列整齊。第21天，所有處理組小鼠創(chuàng)面表皮細(xì)胞均排列緊密且組織完整。

2.2.5 藻藍(lán)蛋白對燙傷后海水浸泡小鼠血清中MDA和SOD含量影響 如圖13所示，與Mod組相比，CPC TDD組和CPC+ip.組SOD含量上升，MDA含量下降，而CPC+ip.組有顯著差異（P<0.05）。結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白可以增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，輔以腹腔注射效果更佳。

2.2.6 藻藍(lán)蛋白對燙傷小鼠血清中TNF-α和IL-6含量影響 如圖14所示，與Con組相比，Mod組血清中TNF-α和IL-6含量增加。與Mod組相比，CPC TDD和CPC+ip.組血清中TNF-α和IL-6含量下降，其中，CPC+ip.組血清中TNF-α和IL-6含量顯著低于Mod組（P<0.05）。結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白可以下調(diào)炎癥因子表達(dá)。

2.3 創(chuàng)傷后海水浸泡試驗

2.3.1 造模效果 造模效果如圖15所示。

2.3.2 小鼠體重變化結(jié)果 如圖16所示，Con組體重呈平穩(wěn)增長趨勢，CPC TDD組和CPC+ip.組的小鼠體重在5 d內(nèi)出現(xiàn)一個平臺期，之后體重開始迅速增長。

2.3.3 傷口愈合時間結(jié)果 如圖17、圖18所示，Mod組和BD組在14 d時傷口仍未愈合，傷口愈合率比其他兩組都低，結(jié)痂所有組均都脫落。CPC TDD和CPC+ip.兩組小鼠掉痂所用時間均低于Mod和Con組，并且與Mod組相比，CPC+ip.組有顯著差異（P<0.05）。CPC+ip.組在第14天時傷口基本愈合。結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白可以促進(jìn)小鼠損傷皮膚愈合。

2.3.4 組織學(xué)變化結(jié)果 由圖19可知，在第7天時，Mod組創(chuàng)面組織水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤，表皮細(xì)胞壞死，創(chuàng)面表面不完整。CPC TDD組和CPC+ip.組炎性細(xì)胞浸潤減輕，表皮逐漸恢復(fù)。第14天時，Mod組部分創(chuàng)面壞死，表皮仍不完整，有疤痕和新生組織出現(xiàn)。CPC TDD組和CPC+ip.組表皮加厚且創(chuàng)面完整，皮膚結(jié)構(gòu)層次清晰，可見肉芽組織形成。

2.3.5 藻藍(lán)蛋白對燙傷后海水浸泡小鼠血清中MDA和SOD含量影響 如圖20所示，與Con組相比，Mod組血清中SOD含量下降，MDA含量增加。與MOD組相比，CPC TDD組和CPC+ip.組SOD含量上升，MDA含量下降，其中CPC+ip.組有顯著差異（P<0.05）。結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白可以增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，輔以腹腔注射效果更佳。

2.3.6 藻藍(lán)蛋白對燙傷小鼠血清中TNF-α和IL-6含量影響 如圖21所示，與Con組相比，Mod組血清中TNF-α和IL-6含量增加。與Mod組相比，CPC TDD和CPC+ip.組TNF-α和IL-6含量下降。其中，CPC+ip.組血清中TNF-α和IL-6含量顯著低于Mod組（P<0.05）。結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白可以下調(diào)炎癥因子表達(dá)。

3 小結(jié)與討論

SOD在機(jī)體內(nèi)能夠有效清除氧化自由基、維持機(jī)體自由基的均衡、保護(hù)組織免受氧化損傷。SOD含量低，氧自由基會大量堆積，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物MDA，損害機(jī)體。劉琪等［17］發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白對X射線輻射所引起的小鼠氧化系統(tǒng)損傷模型具有預(yù)防作用。與模型組相比，藻藍(lán)蛋白預(yù)防組血清和肝組織中的SOD含量上升，MDA含量下降，肝組織中ROS和GSH-PX含量上升，表明藻藍(lán)蛋白可以保護(hù)體內(nèi)的氧化系統(tǒng)，提高機(jī)體的抗氧化能力。本研究使用藻藍(lán)蛋白敷料的小鼠機(jī)體內(nèi)SOD含量增加，MDA含量下降，并且輔以腹腔注射藻藍(lán)蛋白的效果更顯著。

TNF-α在受傷小鼠體內(nèi)能誘導(dǎo)IL-1、IL-10、IFN-γ等細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)。IL-6和TNF-α含量越高，表明小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)更劇烈，傷口愈合越慢。Grover等［18］發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白可以抑制炎癥細(xì)胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-13、IFN-c、TNF-a）產(chǎn)生，從而增加機(jī)體的免疫力。本研究證明CPC可以降低小鼠皮膚損傷模型血清中的IL-6和TNF-a的合成，減輕小鼠炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)小鼠皮膚愈合，達(dá)到治療作用。

藻藍(lán)蛋白還具有抗腫瘤、抗纖維化、增強(qiáng)免疫力等功能活性［19］。孫英新［20］的研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白可以減輕百草枯誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化，并降低血清和肺組織中的MDA含量，增加SOD抗氧化酶的含量，抑制TNF-α的活性并降低TGF-β1水平。翟詩翔［21］的研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白可以緩解在LPS誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞纖維化以及CCL4誘導(dǎo)的大鼠體內(nèi)肝纖維化，并且發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白可以增加大鼠體內(nèi)具有抗炎活性的腸道菌群豐度。韓敏敏［22］的研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白明顯抑制人肝癌細(xì)胞、人胰腺癌細(xì)胞等8種腫瘤細(xì)胞的生長，能夠促進(jìn)小鼠免疫器官發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。張昕等［23］的研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白及其α、β亞基對人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞有明顯的抑制生長作用，并且細(xì)胞存活率與濃度呈反比。褚靜等［24］的研究發(fā)現(xiàn)C-藻藍(lán)蛋白誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，主要機(jī)制可能與激活p38MAPK和JNK信號傳導(dǎo)有關(guān)。

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