木質(zhì)素降解真菌的篩選與鑒定

劉佳莉　成于恒

摘 要：【目的】篩選具有降解木質(zhì)素功能的真菌。【方法】通過(guò)對(duì)林草地采集的土壤樣品進(jìn)行梯度稀釋、加速分離純化實(shí)驗(yàn)、愈創(chuàng)木酚平板上的顯色實(shí)驗(yàn)和苯胺藍(lán)平板上褪色實(shí)驗(yàn)，篩選出了可以降解木質(zhì)素的真菌?！窘Y(jié)果】篩選菌株中菌株X1可以產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶，其Lac活力為38.4U/ml，MnP活力為104.9U/ml，在pH值為4.0的條件下培養(yǎng)6d產(chǎn)酶能力最強(qiáng)?！窘Y(jié)論】真菌X1明顯具有木質(zhì)素降解能力，為木質(zhì)素降解、利用和秸稈還田提供新的菌株資源。

關(guān)鍵詞：木質(zhì)素降解真菌；降解能力；酶活測(cè)定；影響產(chǎn)酶條件

木質(zhì)素是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜而穩(wěn)定的有機(jī)聚合物，它結(jié)實(shí)堅(jiān)韌，不容易腐爛，同時(shí)賦予植物作為植物細(xì)胞壁形成中特別重要的剛性成分。木質(zhì)素還是自然界僅次于纖維的第二大可再生生物資源，全球年產(chǎn)量可達(dá)1500億t[1]。

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)量在世界居于領(lǐng)先地位，每年會(huì)產(chǎn)生大量的農(nóng)業(yè)廢棄物——秸稈，但由于我國(guó)對(duì)秸稈的集中處理設(shè)施和技術(shù)規(guī)范還遠(yuǎn)沒(méi)有到位，絕大多數(shù)都是以焚燒的形式處理，此種方法利用率低，同時(shí)還會(huì)排出大量的有害氣體和煙塵，導(dǎo)致空氣質(zhì)量下降，造成了嚴(yán)重的空氣污染，影響人體健康，不利于農(nóng)業(yè)和環(huán)境的協(xié)調(diào)發(fā)展。木質(zhì)素是秸稈的主要組成部分，它在自然環(huán)境中降解緩慢，所以尋找一種可以高效利用木質(zhì)素的方法變得尤為迫切。

目前，常用于降解木質(zhì)素的方法有物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法、生物法，但是物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法都對(duì)反應(yīng)條件比較苛刻，對(duì)設(shè)備要求高[2]。而通過(guò)微生物法來(lái)處理木質(zhì)素，具有反應(yīng)條件溫和、低耗能的特點(diǎn)，所以生物降解法為我們提供了更具體更有效的選擇，微生物當(dāng)中能分解木質(zhì)素的大多是真菌。20世紀(jì)80年代，科學(xué)家們先后從真菌的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了漆酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶，這三種類酶都被證實(shí)對(duì)木質(zhì)纖維具有降解作用[3－4]。本文通從秦皇島海濱國(guó)家森林公園中的土壤中，篩選出具有高效降解木質(zhì)素的真菌，然后對(duì)其酶活性進(jìn)行測(cè)定，最后對(duì)影響產(chǎn)酶的條件進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)土樣

從秦皇島海濱國(guó)家森林公園中選取三塊10m×10m的樣地，取樣時(shí)刨除土層表面凋落物等雜質(zhì)，使用五點(diǎn)取樣法，用土鉆采集5個(gè)深度約20cm的土芯，挑除細(xì)根，去除肉眼可見(jiàn)的作物殘留物及石頭等細(xì)小雜質(zhì)，徹底混合形成一個(gè)均勻的混合樣品放置于自封袋中，然后將樣品放在裝有冰袋的保溫箱中，立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理分析。

1.2 菌株的篩選

稱取10g土壤于錐形瓶中，加入90ml滅菌處理的蒸餾水，200rpm，30min，取10-3、10-4、10-5濃度懸液涂布于固體培養(yǎng)基上，挑取真菌菌落進(jìn)行純化。經(jīng)過(guò)6輪純化后，菌株放于4℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

參考李靈靈等人的方法[5]挑取在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后經(jīng)純化菌株的菌絲，接種到PDA-愈創(chuàng)木酚固體培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察其是否顯現(xiàn)出紅色；接種于苯胺藍(lán)固體培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察有無(wú)透明圈出現(xiàn)。

1.3 酶活測(cè)定

將篩選出的真菌置于PDA固體培養(yǎng)基中28℃下培養(yǎng)5d后，制備菌塊，接種于含有液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基[6]的100ml錐形瓶中，接種量3%，放于30℃，150rpm的水浴搖床中培養(yǎng)5d。提取發(fā)酵培養(yǎng)5d的產(chǎn)酶培養(yǎng)液置于滅菌處理后的離心管中。在28℃，4500rpm條件下離心15min，靜置10min后的上層清澈液體為粗酶液。

漆酶（Lac）活性測(cè)定使用愈創(chuàng)木酚方法[7]。每1min催化1nmol/L愈創(chuàng)木酚的酶量為1個(gè)酶活，單位為U。

錳過(guò)氧化物酶（Mnp）活性測(cè)定反應(yīng)體系為3ml，使用50mmol/L，pH=4.5的酒石酸-酒石酸鈉緩沖液2ml，15mmol/L硫酸錳1ml，粗酶液0.4ml，在37℃加入0.1ml的10mmol/L H2O2溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，測(cè)定在240nm處3min吸光度的變化[8-9]。

每種酶活測(cè)定做5次重復(fù)。

1.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將菌株用接種針接于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后，吸取100μl菌液于新的液體培養(yǎng)基中，每2h在600nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d，觀察菌落形態(tài)并在顯微鏡下觀察菌絲，然后結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》區(qū)分真菌種類。

1.6 木質(zhì)素降解率的測(cè)定

將菌株接種到200ml液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，然后從中吸取100μl菌液接于木質(zhì)素降解液體培養(yǎng)基中。每?jī)商煳?ml液態(tài)培養(yǎng)物并離心（7500rpm/min，5min），將稀釋10倍后的上層清液置于275nm波長(zhǎng)下，測(cè)定其OD值。同一菌株做三個(gè)重復(fù)。

1.7 初始pH值對(duì)酶活性的影響

設(shè)置液體培養(yǎng)基初始pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0五組，于30℃，150rpm恒溫培養(yǎng)，每?jī)商烊∫淮螛樱?500rpm下離心15min，分別取不同pH值下的培養(yǎng)液上清液測(cè)定酶活。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016對(duì)菌株各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、計(jì)算并制作圖表。使用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)差異性進(jìn)行Duncan分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 愈創(chuàng)木酚顯色和苯胺藍(lán)褪色

愈創(chuàng)木酚是一種木質(zhì)素苯環(huán)單元特征類似物，能降解木質(zhì)素的真菌會(huì)產(chǎn)生漆酶（Lac），漆酶可以使愈創(chuàng)木酚變?yōu)榧t色，若菌株可以分泌漆酶，則會(huì)在PDA-愈創(chuàng)木酚平板上顯現(xiàn)出紅色顯色圈，顯色圈的大小可以衡量產(chǎn)酶量與活性。

但由于愈創(chuàng)木酚的特殊物理化學(xué)性質(zhì)，使用愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基無(wú)法檢出錳過(guò)氧化物酶（MnP）與木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Lip）。而錳過(guò)氧化物酶（MnP）與木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Lip）可以使偶氮染料苯胺藍(lán)發(fā)生褪色，所以使用苯胺藍(lán)平板可以檢測(cè)出錳過(guò)氧化物酶和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶。褪色圈大小可以衡量?jī)煞N酶的酶量與酶活力。

本實(shí)驗(yàn)共篩選出6株真菌，其中只有菌株X1具有產(chǎn)木質(zhì)素降解酶能力。X1在PDA-愈創(chuàng)木酚平板（圖1A）上顯紅色效果強(qiáng)烈；與未接種的苯胺藍(lán)平板（圖1C）對(duì)比，菌株X1在PDA-苯胺藍(lán)平板上培養(yǎng)使藍(lán)色全部褪色（圖1B），說(shuō)明菌株X1可以產(chǎn)生降解木質(zhì)素的酶，且產(chǎn)酶效果好。

2.2 酶活測(cè)定

將菌株X1接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d，吸取菌液離心，取上層清澈液體測(cè)定三種酶的酶活力。測(cè)定結(jié)果表明Lac活力為38.4U/ml，MnP活力為104.9U/ml，如表1。

2.3 菌株生長(zhǎng)曲線

由于培養(yǎng)液中的菌株量增加可以降低透光率、增加吸光值（OD值），所以我們以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以培養(yǎng)液在600nm下的OD值為縱軸繪制圖像，結(jié)果見(jiàn)圖2，由于含菌量少，在6h前變化較緩，在6h之后生長(zhǎng)速率加快，10h后趨于穩(wěn)定不再增長(zhǎng)，此時(shí)菌株數(shù)量達(dá)到最大值。

2.4 菌株形態(tài)學(xué)觀察

將菌株點(diǎn)接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d，X1的菌落外表為白色，呈平面擴(kuò)散生長(zhǎng)，形狀為扁平圓形，菌落中心略微突出，菌絲易于挑取為短絨毛狀，菌落干燥，底部與培養(yǎng)基的結(jié)合緊密，菌落邊緣與培養(yǎng)基結(jié)合處較為堅(jiān)硬。通過(guò)在顯微鏡下觀察其菌絲，發(fā)現(xiàn)其為單菌絲，菌絲上有橫隔，末端呈鈍圓形（圖3）。同時(shí)結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》判斷其為半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，地霉屬。

2.5 菌株木質(zhì)素降解率測(cè)定

通過(guò)對(duì)菌株X1木質(zhì)素降解真菌解木質(zhì)素量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在測(cè)定的前兩天對(duì)于堿性木質(zhì)素的降解率變化較小，可能由于菌株在前期生長(zhǎng)緩慢且先利用培養(yǎng)基中的碳源和氮源，第三天開(kāi)始降解木質(zhì)素，第四天降解速率達(dá)到最高，第五天降解率達(dá)到峰值并基本維持峰值，菌株X1對(duì)于堿性木質(zhì)素降解率為44.55%（圖4）。

2.6 初始pH對(duì)漆酶、錳過(guò)氧化物酶活性的影響

在菌株生長(zhǎng)前2d時(shí)，不同pH對(duì)于酶活力的影響并不算大，但在第2d之后顯現(xiàn)出差異。當(dāng)菌株在初始pH值為4.0，培養(yǎng)2d后漆酶活力迅速上升，直到培養(yǎng)6d漆酶活力達(dá)到最大值45.6 U，之后由于含菌量達(dá)最大值，培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分被消耗，菌株活力下降甚至死亡，酶活力降低（圖5）。在初始pH值為4.0時(shí)，培養(yǎng)2d后錳過(guò)氧化物酶活力迅速上升，也在培第養(yǎng)6d時(shí)酶活力達(dá)到峰值為133.0 U，在pH值為4.5時(shí)酶活性在第6d接近峰值，但在前期和后期低于pH值為4.0的酶活，pH值處于3.0和3.5時(shí)，明顯對(duì)酶活力產(chǎn)生抑制（圖6）。真菌X1在pH為4.0的情況下生長(zhǎng)發(fā)育最好，在培養(yǎng)第6d時(shí)，產(chǎn)酶性能最佳。

3 結(jié)論與討論

菌株X1可以產(chǎn)漆酶、錳過(guò)氧化物酶、木質(zhì)素氧化酶等三種可以降解木質(zhì)素的酶。當(dāng)培養(yǎng)基pH為4時(shí)菌株的酶能力最強(qiáng)，最佳產(chǎn)酶時(shí)間為第6天，與劉梁濤等人的結(jié)論一致，但漆酶活性低于劉梁濤的結(jié)論[10]。該菌株對(duì)于堿木質(zhì)素的降解率隨著時(shí)間的增加而增加，在培養(yǎng)7d后可達(dá)到44.55%，在第4d之后降解率趨于穩(wěn)，該菌株對(duì)于堿木質(zhì)素的降解率44.55%低于王福玲實(shí)驗(yàn)得到 的65.4%[11]，高于喬喬報(bào)道的36.4%[12]，降解效率適中。

本實(shí)驗(yàn)篩選出的真菌X1具有木質(zhì)素降解能力，可以進(jìn)一步應(yīng)用于化工生產(chǎn)領(lǐng)域、環(huán)保領(lǐng)域、農(nóng)林領(lǐng)域等，可為木質(zhì)素的降解、利用和秸稈還田提供新的微生物材料。

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