Pre-miR172及miR172調(diào)控油菜AP2基因表達(dá)的規(guī)律分析

劉芳 郝小花 陳中元 何昊

DOI： 10.11931/guihaia.gxzw202305065

劉芳， 郝小花， 陳中元， 等， 2024.

Pre-miR172及miR172調(diào)控油菜AP2基因表達(dá)的規(guī)律分析 ［Ｊ］.

廣西植物， 44（5）： 936-950.

LIU F， HAO XH， CHEN ZY， et al.， 2024.

Analysis of expression regulation of AP2 gene by pre-miR172 and miR172 in rape ［J］.

Guihaia， 44（5）： 936-950.

摘? 要：? 為探究油菜miR172前體（pre-miR172）及成熟體（miR172）對(duì)AP2基因的調(diào)控功能，該研究通過生物信息學(xué)方法對(duì)miR172和AP2啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控元件預(yù)測(cè)，分析6條油菜AP2基因的進(jìn)化關(guān)系及miR172與AP2的靶向關(guān)系；通過qRT-PCR方法檢測(cè)AP2、miR172和pre-miR172在早熟和晚熟油菜不同組織的表達(dá)規(guī)律；比較分析miR172豐度和AP2表達(dá)量間的相關(guān)關(guān)系，以及比較分析 pre-miR172和miR172在表達(dá)水平上的相關(guān)關(guān)系；通過過表達(dá)pre-miR172，再次驗(yàn)證pre-miR172對(duì)成熟體miR172及AP2的作用。結(jié)果表明：（1）miR172和AP2啟動(dòng)子區(qū)均存在調(diào)控花發(fā)育的順式元件。（2）6條AP2序列均經(jīng)歷了強(qiáng)烈的純化選擇，均具備miR172的結(jié)合位點(diǎn)，屬miR172的靶基因。（3）miR172家族成員均可促進(jìn)早熟油菜AP2表達(dá)，但miR172d作用不明顯。在晚熟油菜中，miR172a和miR172c作用微弱，miR172b和miR172d二者共同發(fā)揮作用降低AP2的表達(dá)水平。（4）pre-miR172家族對(duì)于早熟油菜中miR172家族的表達(dá)水平均有促進(jìn)作用；在晚熟油菜中pre-miR172a和pre-miR172b對(duì)其成熟序列的形成發(fā)揮正調(diào)控作用，pre-miR172c和pre-miR172d則對(duì)于其成熟序列的形成發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。過表達(dá)pre-miR172后，miR172和AP2表達(dá)規(guī)律與上述結(jié)果保持一致，證實(shí)pre-miR172對(duì)miR172及AP2的調(diào)控功能。該研究結(jié)果豐富了油菜AP2基因的功能調(diào)控路徑，為基因的調(diào)控功能研究提供了新的思路。

關(guān)鍵詞： 油菜， AP2， miR172， pre-miR172， 表達(dá)規(guī)律

中圖分類號(hào)：? Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2024）05-0936-15

收稿日期：? 2023-09-12? 接受日期： 2023-11-30

基金項(xiàng)目：? 國(guó)家自然科學(xué)基金（32071930）； 湖南省自然科學(xué)基金（2022JJ40288）； 湖南文理學(xué)院博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（19BSQD22）。

第一作者： 劉芳（1988—），博士，講師，研究方向?yàn)橛筒朔肿佑N，（E-mail）g5n2a5f@163.com。

*通信作者：? 何昊，博士，講師，研究方向?yàn)楣麡湓耘?，（E-mail）271285785@qq.com。

Analysis of expression regulation of AP2 gene

by pre-miR172 and miR172 in rape

LIU Fang1，2， HAO Xiaohua1， CHEN Zhongyuan1，3， HE Hao1，2*

（ 1. College of Life and Environmental Science， Hunan University of Arts and Science， Changde 415000， Hunan， China; 2. Changde Research

Centre Agricultural Biological Macromolecule， Changde 415000， Hunan， China； 3. Hunan Provincial Key Laboratory

for Molecular Immunity Technology of Aquatic Animal Diseases， Changde 415000， Hunan， China ）

Abstract：? The appropriate flowering time is of great significance for crop yield. In the cropping pattern of “rice-rice-oil” in southern region， researching on the flowering period of Brassica napus can provide a theoretical basis for the breeding of early maturing rape varieties. The AP2 family transcription factors in rape are widely involved in the growth and development and play an important role during flower development. However， there are few studies exploring the regulation of AP2 at the microRNA level. In order to investigate the regulatory functions of the miR172 precursor （pre-miR72） and mature body （miR172） on AP2 gene in rape， the regulatory elements of miR172 and AP2 promoters were predicted based on bioinformatics， then the evolutionary relationship of six rape AP2 genes and the targeting relationship between miR172 and AP2 were analyzed， and the expression patterns of AP2， miR172 and pre-miR172 in different tissues of early and late maturing rape were detected by qRT-PCR. Finally， the correlation between miR172 abundance and AP2 expression level was studied， as well as the correlation between pre-miR172 and miR172. The results were as follows： （1） Both miR172 and AP2 promoter regions had cis-elements that regulated flower development. （2） The six AP2 sequences holded the strong purification selection， and they were the target genes of miR172 based on their binding sites for miR172. （3） miR172 family could promote the flowering of early maturing rape by increasing AP2 expression levels， except for miR172d. In late maturing rape， miR172a and miR172c performed weakly in flowering， while miR172b and miR172d worked together to reduce the expression level of AP2 to inhibit flowering. （4） The pre-miR172 family had a promoting effect on the expression level of miR172 family in early maturing rape; in late maturing rape， pre-miR172a and pre-miR172b exerted positive regulation on the formation of their mature bodies， while pre-miR172c and pre-miR172d exerted the opposite effects. After overexpression of pre-miR172， the expression patterns of miR172 and AP2 remained consistent with the above results， confirming the regulatory function of pre-miR172 on miR172 and AP2. The results of this study enrich the functional regulation pathway of rape AP2 gene， and provide new ideas for the study of gene regulatory function.

Key words： rape， AP2， miR172， pre-miR172， expression pattern

MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，一般長(zhǎng)度為18～36個(gè)核苷酸，參與基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控（張幸媛等，2021）。有研究表明，miRNA可以通過調(diào)控靶基因來(lái)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育（Huijser & Schmid， 2011）、開花時(shí)間（Spanudakis & Jackson，2014）和逆境脅迫（Liu & Axtell， 2015）。miRNA的形成先經(jīng)過RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級(jí)miRNA前體（primary miRNA precusor，pri-miRNA），再經(jīng)DCL1切割后保留70～500個(gè)核苷酸序列形成莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)，即miRNA前體（miRNA precusor，pre-miRNA），最后pre-miRNA通過相似剪切后形成成熟miRNA（Phillips et al.， 2007）。可見pre-miRNA對(duì)于成熟體miRNA的形成具有重要意義。

miR172廣泛存在于植物中，最早在擬南芥中被克隆出來(lái)，其對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起基礎(chǔ)作用（Park et al.， 2002），在植物的生殖轉(zhuǎn)換、花發(fā)育、響應(yīng)脅迫機(jī)制等方面具有重要作用（王幼寧等，2016；趙曉暉等，2017）。擬南芥中miR172過表達(dá)抑制AP2蛋白水平，同時(shí)抑制成花因子TOE1和TOE2，導(dǎo)致擬南芥提前開花（Aukerman & Sakai， 2003）。在水稻中光敏色素可降低miR172d的表達(dá)，從而抑制AP2家族中OsIDS1基因和SNB基因的表達(dá)，誘導(dǎo)開花（Lee et al.， 2014）。Li等（2019）在大巖桐中發(fā)現(xiàn)miR172過表達(dá)導(dǎo)致SsAP2-like基因表達(dá)量下降，促使其提前開花。此外，miR172通過靶向AP2類基因可以調(diào)控花器官形態(tài)的建成，如藏紅花（Tsaftaris et al.， 2012）、芥菜（Shivaraj & Singh， 2016）、玉米（Chuck et al.， 2007）、水稻（Hu et al.， 2009）、月季（Franois et al.， 2018）、苧麻（馬鑫，2017）等，可見miR172-AP2在花器官發(fā)育中發(fā)揮著重要作用（Ji et al.， 2011）。

AP2亞家族是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，包含2個(gè)重復(fù)的AP2保守結(jié)構(gòu)域，主要參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程（Trupiano et al.， 2013；Zhao et al.， 2015； Neogy et al.， 2019）。最早，AP2結(jié)構(gòu)域在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，其與花發(fā)育相關(guān)（Jofuku et al.， 1994），此后，陸續(xù)在水稻（Nakano et al.， 2006）、油菜（Ghorbani et al.， 2020）、蘋果（Cheng et al.， 2020）、葡萄（Licausi et al.， 2010）等多個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)，其參與花發(fā)育過程，但功能不盡相同。AP2的功能發(fā)揮會(huì)受到miRNA的調(diào)控，其調(diào)控開花時(shí)間的機(jī)制往往有miR172的參與來(lái)實(shí)現(xiàn)。

油菜miRNA的研究起步較晚，Shen等（2015）利用油菜基因組，鑒定到645個(gè)MIR基因，大部分miRNA具有高度保守性，調(diào)控油菜生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面，包括參與雜種優(yōu)勢(shì)調(diào)控、種子發(fā)育、植物病原互作、非生物脅迫和花發(fā)育等方面（陳麗等，2018）。Wang等（2019）分析早、晚花油菜中miR172或AP2類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式和功能特性，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)花器官發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用，其中BnaAP2-1、BnaAP2-5和BnaTOE1-2可能起到抑制花開的作用。Shivaraj 和Singh（2016）分析白菜型油菜和芥菜中AP2的表達(dá)水平，揭示其參與蕓薹屬植物花的發(fā)育；對(duì)miR172和靶基因AP2突變體間雜交能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)二者存在復(fù)雜的互作模式。突變miR172獲得的轉(zhuǎn)基因系均顯示出加速開花的現(xiàn)象（Shivaraj et al.， 2018）。目前，關(guān)于油菜中miRNA的研究大多集中在miRNA的挖掘與預(yù)測(cè)，而涉及miRNA與靶基因的調(diào)控關(guān)系，以及pre-miRNA對(duì)于miRNA調(diào)控的報(bào)道較少。

本文以油菜開花基因AP2的調(diào)控為研究區(qū)域，依托白菜和甘藍(lán)中已發(fā)現(xiàn)的AP2基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，進(jìn)行比對(duì)并獲得油菜的AP2基因，采用生物信息學(xué)方法、qRT-PCR方法、相關(guān)性分析及過表達(dá)載體侵染油菜子葉的方法，通過對(duì)AP2進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、選擇壓力、基序預(yù)測(cè)和順式調(diào)控元件分析；對(duì)miR172、pre-miR172和AP2表達(dá)規(guī)律及miR172和AP2之間及pre-miR172與miR172之間的相關(guān)性進(jìn)行分析；對(duì)過表達(dá)pre-miR172質(zhì)粒侵染油菜子葉后miR172和AP2表達(dá)水平進(jìn)行分析，擬探討以下問題：（1）預(yù)測(cè)miR172和AP2與花發(fā)育的關(guān)系；（2）miR172對(duì)AP2的調(diào)控功能；（3）pre-miR172對(duì)miR172的調(diào)控功能。

1? 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

早熟油菜品種為湘油420，晚熟油菜品種為湘油15，均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)肖鋼教授提供。將油菜種子種于大田，待其長(zhǎng)至5～7葉期，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致且完整的植株，取根和葉，液氮速凍保存于-80 ℃冰箱中備用，待油菜生長(zhǎng)至花期，取完整的花，液氮速凍保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 油菜中AP2基因的鑒定

從TAIR（http：//www.arabidopsis.org）和BRAD（http：//brassicadb.cn）下載白菜、甘藍(lán)的AP2基因和蛋白序列，經(jīng)過NCBI比對(duì)，選擇E-value≤10-10的序列作為目標(biāo)油菜序列。為進(jìn)一步明確候選油菜AP2家族成員，從miRBase（http：//www.mirbase.org/）下載油菜miR172成熟序列（miR172）和前體序列（pre-miR172），將miR172成熟序列與已獲得的油菜AP2序列通過TAPIR（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/tapir/）網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)，保留具有靶向關(guān)系的AP2序列；同時(shí)，基于miRNA和靶基因間高度同源，利用DNAMAN比對(duì)miR172與油菜AP2基因，保留堿基錯(cuò)配數(shù)小于3的AP2序列作為本研究的候選基因。

1.3 miR172家族和AP2基因啟動(dòng)子分析

分別截取pre-miR172和AP2基因上游2 000 bp作為啟動(dòng)子區(qū)，通過New PLACE（https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action=newplace）網(wǎng)站進(jìn)行順式調(diào)控元件預(yù)測(cè)，初步預(yù)測(cè)miR172對(duì)于油菜開花的作用。

1.4 AP2系統(tǒng)發(fā)育分析

1.4.1 油菜AP2蛋白性質(zhì)分析? 利用在線軟件Expasy（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)分析候選油菜AP2蛋白分子量、等電點(diǎn)（PI），通過Cell-PLoc網(wǎng)站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析。

1.4.2 系統(tǒng)進(jìn)化和選擇壓力分析? 利用MEGA11軟件的鄰接法進(jìn)行AP2、miR172和pre-miR172核苷酸序列的進(jìn)化樹分析，檢驗(yàn)方法為步長(zhǎng)檢驗(yàn)（bootstrap），抽樣次數(shù)1 000（1 000 replications）。利用DnaSp V6軟件分析AP2基因的非同義突變率（non-synonymous，ka）和同義突變率（synonymous，ks），計(jì)算非同義突變率和同義突變率比值（ka/ks），ka/ks <1，認(rèn)為有純化選擇作用，ka/ks >1，認(rèn)為有正選擇效應(yīng)，ka/ks =1，認(rèn)為存在中性選擇。

1.4.3 油菜AP2基因基序分析? 通過WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）繪制油菜AP2蛋白序列結(jié)構(gòu)域的序列標(biāo)志圖。通過MEME（http：//meme suite.org/）鑒定油菜AP2蛋白內(nèi)部的保守基序。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)AP2、miR172及pre-miR172表達(dá)規(guī)律

采用miRcute多糖多酚植物miRNA提取分離試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取油菜根、葉和花的miRNA。使用miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］合成cDNA，以此cDNA為模板，選擇U6作為內(nèi)參基因，采用miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。miR172家族成員的檢測(cè)引物見表1，具體反應(yīng)體系按照miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，每個(gè)樣本3次重復(fù)，在CFX96 （BIO-RAD）定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，運(yùn)行程序?yàn)?5 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析為65 ℃? 5 s， 95 ℃ 0.5 s。

采用RNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）提取油菜根、葉和花的總RNA，并合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板，以Actin為內(nèi)參基因，采用TaKaRa公司［寶生物工程（大連）有限公司］TB Green Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)AP2基因和pre-miR172表達(dá)情況，具體所用引物見表1。參照說(shuō)明書按照25 μL體系進(jìn)行配液，每個(gè)樣本3次重復(fù)，在CFX96 （BIO-RAD）定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析為65 ℃ 5 s，95 ℃ 0.5 s。

1.6 油菜pre-miR172家族成員二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過RNAfold（http：//rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）在線網(wǎng)站分析油菜pre-miR172家族成員，在默認(rèn)參數(shù)條件下，預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能。

1.7 Pre-miR172過表達(dá)對(duì)成熟miR172及AP2基因的影響

1.7.1 構(gòu)建pre-miR172過表達(dá)載體? 為鑒定pre-miR172對(duì)miR172成熟體表達(dá)水平的影響，克隆pre-miR172前體序列（包含發(fā)夾區(qū)域上下游各100 bp區(qū)域序列），并在序列5′端引入酶切位點(diǎn)XhoI，3′端引入EcoRI酶切位點(diǎn)。經(jīng)過XhoI和EcoRI雙酶切分別處理質(zhì)粒pGreen_GUS_competitor（addgene ID 55208）和含pre-miR172序列的T載體，將pre-miR172連接到pGreen_GUS_competitor上，構(gòu)建過表達(dá)載體。將已構(gòu)建的過表達(dá)載體（實(shí)驗(yàn)組）和空載體pGreen_GUS_competitor（對(duì)照組）分別轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101（成智博等，2019）。

1.7.2 農(nóng)桿菌瞬時(shí)侵染油菜子葉及體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的農(nóng)桿菌分別進(jìn)行瞬時(shí)侵染油菜子葉， 具體方法參照譚小力等 （2012）。侵染后于25 ℃條件下避光培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)移至25 ℃，光周期16 h/8 h條件下培養(yǎng)3 d后取樣，對(duì)miR172和AP2基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，具體方法同上。

1.8 數(shù)據(jù)處理

1.8.1 相關(guān)性分析? 通過Excel軟件分別對(duì)油菜AP2和miR172家族以及miR172家族和pre-miR172家族進(jìn)行相關(guān)性分析，在P<0.05的條件下，相關(guān)系數(shù)r絕對(duì)值越接近1，相關(guān)性越強(qiáng)。0≤|r|≤0.5，基本不相關(guān)或低度相關(guān)；0.5<|r|≤0.8，顯著相關(guān)；0.8<|r|<1，高度相關(guān)；|r|=1，完全相關(guān)。

1.8.2 差異顯著性分析? 利用Microsoft Excel 2010對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)算所得P值小于0.05為差異顯著。

2? 結(jié)果與分析

2.1 油菜中AP2基因的鑒定

油菜基因組來(lái)源于白菜和甘藍(lán)的雜交，選擇甘藍(lán)和白菜中已鑒定的AP2基因，通過BLAST獲得油菜中的同源序列，經(jīng)過篩選去除重復(fù)序列，得到9條序列；經(jīng)TAPIR網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR172和AP2的互補(bǔ)配對(duì)位點(diǎn)（表2），選擇錯(cuò)配堿基數(shù)小于3的序列保留，最終得到6條AP2候選序列。其中，根據(jù)白菜AP2序列比對(duì)得到2條序列XM_013887071和XM_048778068，其對(duì)應(yīng)的蛋白序列為XP_013742525和XP_048600981；根據(jù)甘藍(lán)AP2序列比對(duì)得到4條序列HQ637468、XM_048770445、XM_013887073和XM_048763426，其對(duì)應(yīng)的蛋白序列為ADU04499、CDY29538、XP_013742527和XP_048619383。

2.2 油菜miR172和AP2啟動(dòng)子區(qū)順式調(diào)控元件的預(yù)測(cè)分析

截取pre-miR172和AP2基因上游2 000 bp作為啟動(dòng)子區(qū)，經(jīng)NewPLACE網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析，在pre-miR172和AP2啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)存在TATA-box、CAAT-box等核心啟動(dòng)子元件，光應(yīng)答元件（G-box、AAAC-motif、Box4、GT-1等，用于響應(yīng)光照長(zhǎng)度和光周期刺激），激素應(yīng)答元件（ABRE、 W-box、GARE、CGTCA、TGACG等，用于響應(yīng)乙烯、脫落酸、赤霉素、生長(zhǎng)素、乙酰水楊酸、茉莉酸的刺激），生長(zhǎng)發(fā)育應(yīng)答元件（TATTAG，參與細(xì)胞分裂），逆境脅迫響應(yīng)元件（MYB2、UP1-motif等，參與響應(yīng)水脅迫、損傷脅迫等機(jī)制），此外，啟動(dòng)子區(qū)還存在組織特異性元件（root-motif、POLLEN-ELEMENT，調(diào)控相應(yīng)基因在根和花這些特定組織中表達(dá)）。這說(shuō)明miR172和AP2可能參與調(diào)控開花過程。

2.3 油菜AP2系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3.1 AP2蛋白性質(zhì)分析? 由表2可知，AP2蛋白由357～433個(gè)氨基酸組成；分子量為39.7～47.9 kDa；等電點(diǎn)為6.31～6.77，此外，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，6條油菜AP2均位于細(xì)胞核，說(shuō)明這6條AP2序列均屬核基因，在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮不同功能。

2.3.2 油菜AP2的選擇壓力分析? 對(duì)油菜中6個(gè)AP2候選序列與白菜（Bra017809和Bra011741）和甘藍(lán)（KC584094）中AP2進(jìn)行ka、ks計(jì)算，通過比較ka/ks進(jìn)行選擇壓力分析。由表3可知，旁系同源基因7對(duì)，直系同源基因6對(duì)，全部ka/ks<1，表明AP2家族在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了強(qiáng)烈的純化選擇。

2.3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析? 為進(jìn)一步確定油菜AP2、miR172和pre-miR172各自的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA6軟件對(duì)多種植物的AP2家族、miR172成熟序列和pre-miR172序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示油菜AP2序列

XM_013887071、XM_048770445、XM_013887073與白菜BraAP2-2關(guān)系較近，XM_048763426與甘藍(lán)BroAP2關(guān)系較近（圖1：A）。Pre-miR172 進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，bna-miR172a與bra-miR172a關(guān)系最近；bna-miR172b和bna-miR172c聚類在一組，和bra-miR172d、ath-miR172e關(guān)系較近；bna-miR172d和bra-miR172c關(guān)系較近（圖1：C）。miR172 成熟序列的進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)miR172b和miR172c聚類在一組（圖1：B），表明二者可能功能相似；miR172a和miR172d分別聚類在其他組（圖1：B），可能與miR172b、miR172c的功能存在差異。

2.3.4 AP2蛋白基序分析? 由圖2可知，所有油菜AP2蛋白候選序列均存在3個(gè)保守基序（圖2： A），基序1（Motif 1）和基序2（Motif 2）高度保守，基序3（Motif 3）有3個(gè)氨基酸位置保守性較低（圖2： B），說(shuō)明不同油菜AP2基因功能的差異可能依賴于基序3來(lái)發(fā)揮。

2.4 miR172家族與AP2表達(dá)水平及二者相關(guān)性分析

由圖3可知，AP2在根和葉中的表達(dá)水平呈現(xiàn)為早熟低于晚熟，但在花中則早熟明顯高于晚熟（圖3：A）。對(duì)于早熟油菜，根和葉中AP2表達(dá)量明顯低于花的表達(dá)量；對(duì)于晚熟油菜則相反，呈現(xiàn)根和葉中AP2表達(dá)量高于花的。早熟油菜花中AP2表達(dá)量顯著高于晚熟油菜花，初步推測(cè)AP2基因的綜合作用結(jié)果是促進(jìn)開花。

通過miRBase下載得到4條成熟油菜miR172家族成員，分別是bna-miR172a、bna-miR172b、bna-miR172c和 bna-miR172d。經(jīng)過多重比對(duì)miR172家族成員和AP2基因，發(fā)現(xiàn)4個(gè)家族成員高度保守，僅存在1個(gè)堿基的差異，AP2基因和miR172高度同源互補(bǔ)，僅有1～3個(gè)堿基的差異（圖3：F），初步推測(cè)這些AP2基因是miR172的靶基因。

通過qRT-PCR檢測(cè)miR172家族的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3：B-E所示，miR172家族在早熟和晚熟油菜的根、葉和花中均有表達(dá)，而且花中的表達(dá)水平普遍高于根和葉，只有miR172d在晚熟油菜花中的表達(dá)量低于根和葉。 miR172a、miR172b和miR172c在早熟油菜不同組織中的表達(dá)規(guī)律和AP2一致，花中表達(dá)量高于根和葉，說(shuō)明miR172a、miR172b和miR172c對(duì)于早熟油菜AP2基因有促進(jìn)表達(dá)的作用。在晚熟油菜中，miR172a和miR172c在花中表達(dá)水平顯著高于非花組織，但差距較小，說(shuō)明miR172a和miR172c對(duì)于AP2基因雖表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控，但作用較小；miR172b在花中表達(dá)量高于非花組織，與AP2表達(dá)規(guī)律相反，說(shuō)明在晚熟油菜中miR172b對(duì)于AP2起到負(fù)調(diào)控的作用。在早熟油菜中，miR172d在不同組織之間表達(dá)量差異不顯著，在晚熟油菜中miR172d表達(dá)規(guī)律和AP2一致，非花組織的表達(dá)量顯著高于花的表達(dá)量，說(shuō)明miR172d對(duì)于晚熟油菜AP2可能起正調(diào)控作用，而在早熟油菜中可能不發(fā)揮功能或作用微弱。

為進(jìn)一步確定miR172家族各成員與AP2基因的關(guān)系，分析AP2和miR172家族各成員表達(dá)規(guī)律之間的相關(guān)系數(shù)（r值）和差異顯著性（P值），結(jié)果如表4所示，在早熟油菜中miR172家族各成員與AP2均呈顯著或高度正相關(guān)，在晚熟油菜中miR172d與AP2呈高度正相關(guān)， miR172b與AP2呈負(fù)相關(guān)，miR172a和miR172c與AP2低度相關(guān)，說(shuō)明在早熟油菜中miR172家族促進(jìn)AP2表達(dá)，但在晚熟油菜中miR172b抑制AP2表達(dá)，miR172d促進(jìn)AP2表達(dá)。

綜上所述，油菜AP2基因可能促進(jìn)開花，而且其功能的發(fā)揮受到miR172的靶向調(diào)控。在早熟油菜中miR172家族促進(jìn)AP2表達(dá)水平增加進(jìn)而促進(jìn)開花，但其中miR172d作用不明顯。在晚熟油菜中，miR172a和miR172c對(duì)于AP2的調(diào)控作用較小，miR172b和miR172d二者共同發(fā)揮作用降低AP2的表達(dá)水平，從而抑制晚熟油菜的開花。

2.5 Pre-miR172的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

從miRBase下載到4個(gè)歐洲油菜pre-miR172家族成員，4個(gè)白菜pre-miR172家族成員，2個(gè)甘藍(lán)pre-miR172家族成員。利用 RNAfold（3.2）軟件預(yù)測(cè)油菜、白菜和甘藍(lán)的pre-miR172家族基因二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表5所示，pre-miR172的基本二級(jí)結(jié)構(gòu)均為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其自由能為40.3～67.7 kcal·mol-1，其中歐洲油菜pre-miR172c的二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能最高，歐洲油菜pre-miR172a的二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能最低。由圖4可知，白菜和甘藍(lán)pre-miR172a二級(jí)結(jié)構(gòu)一致，但由于5′端缺少CGUU 4個(gè)堿基，3′端缺少CGACG 5個(gè)堿基，導(dǎo)致其在油菜中的二級(jí)結(jié)構(gòu)缺少1個(gè)環(huán)區(qū)和部分莖部堿基配對(duì)，致使自由能下降3.1 kcal·mol-1；pre-miR172b在白菜和甘藍(lán)中的二級(jí)結(jié)構(gòu)一致，但歐洲油菜中則由于堿基差異，導(dǎo)致其莖部堿基配對(duì)數(shù)目增加，同時(shí)，雖然同為5個(gè)環(huán)區(qū)，但歐洲油菜中的環(huán)更小，因此二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能增加，穩(wěn)定性更強(qiáng)。與白菜相比，歐洲油菜pre-miR172c整體堿基數(shù)更多，莖部配對(duì)數(shù)目更多，導(dǎo)致自由能更高，二級(jí)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定；歐洲油菜pre-miR172d相較于白菜多形成了1個(gè)環(huán)區(qū)，自由能降低，二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性更弱一些。歐洲油菜中pre-miR172a的穩(wěn)定性最低，然后依次是pre-miR172d、pre-miR172b，pre-miR172c穩(wěn)定性最強(qiáng)。

2.6 miR172與pre-miR172功能的相關(guān)性分析

通過qRT-PCR檢測(cè)pre-miR172家族各成員的表達(dá)水平，將pre-miR172家族和miR172家族表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在早熟油菜和晚熟油菜花中pre-miR172a表達(dá)量高于根和葉，miR172a也隨之在花中呈現(xiàn)最高表達(dá)量（圖5： A），說(shuō)明pre-miR172a對(duì)于miR172a的形成有促進(jìn)作用；但在晚熟油菜中，miR172a的變化幅度明顯高于pre-miR172a的變化幅度（圖5： A），說(shuō)明除了pre-miR172a表達(dá)豐度對(duì)miR172a的形成發(fā)揮促進(jìn)作用，可能還存在其他加工層面的調(diào)控參與。 pre-miR172b與對(duì)應(yīng)的成熟體序列表達(dá)趨勢(shì)一致，不同組織中前體序列表達(dá)量增加，成熟序列的表達(dá)量也隨之增加（圖5： B），說(shuō)明pre-miR172b對(duì)miR172b的形成具有促進(jìn)作用。pre-miR172c和pre-miR172d早熟油菜花中表達(dá)量高于非花組織，miR172c和miR172d與其前體保持同樣的表達(dá)規(guī)律，說(shuō)明pre-miR172c和pre-miR172d對(duì)于早熟油菜miR172c和miR172d的形成同樣具有促進(jìn)作用；但在晚熟油菜中，pre-miR172c和pre-miR172d的表達(dá)規(guī)律與其相應(yīng)成熟體表達(dá)趨勢(shì)相反（圖5：C，D），說(shuō)明在晚熟油菜中pre-miR172c和pre-miR172d對(duì)于其成熟體的形成具有負(fù)作用。

為進(jìn)一步確定miR172的功能發(fā)揮與pre-miR172的關(guān)系，分析miR172和pre-miR172表達(dá)水平間的相關(guān)系數(shù)（表6），結(jié)果發(fā)現(xiàn)在早熟和晚熟品種中表現(xiàn)出一致的規(guī)律，miR172a和pre-miR172a間顯著正相關(guān)。miR172d和pre-miR172d間顯著相關(guān)，但在早熟品種中表現(xiàn)為正相關(guān)，在晚熟品種中表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)， 說(shuō)明成熟序列miR172a和miR172d的形成與相應(yīng)前體表達(dá)豐度高低具有顯著的相關(guān)關(guān)系。

綜合上述結(jié)果， pre-miR172家族對(duì)于早熟油菜中miR172的表達(dá)水平具有促進(jìn)作用，其中miR172a和miR172d的表達(dá)水平主要受pre-miR172a和pre-miR172d豐度的調(diào)控。在晚熟油菜中pre-miR172a和pre-miR172b對(duì)其成熟序列的形成發(fā)揮正向調(diào)控，pre-miR172c和pre-miR172d則對(duì)于其成熟序列的形成發(fā)揮負(fù)向調(diào)控。

2.7 Pre-miR172對(duì)miR172及AP2表達(dá)水平影響

通過攜帶pre-miR172過表達(dá)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染油菜子葉進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示，早熟油菜子葉中pre-miR172過表達(dá)均導(dǎo)致其對(duì)應(yīng)的成熟體表達(dá)量高于對(duì)照組（ck），但其中miR172b與對(duì)照組相比差異不顯著（圖6： A），可見基本上，在早熟油菜中pre-miR172促進(jìn)其成熟體的形成；晚熟油菜子葉中miR172a和miR172b表達(dá)量高于對(duì)照組，miR172c和miR172d則顯著低于對(duì)照組（圖6： B），表明前二者促進(jìn)其成熟體形成，后二者抑制其成熟體形成。早熟油菜子葉中pre-miR172過表達(dá)后發(fā)現(xiàn)AP2基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（圖6： C），晚熟油菜子葉中過表達(dá)pre-miR172b時(shí)AP2表達(dá)量低于對(duì)照組，過表達(dá)pre-miR172d時(shí)AP2表達(dá)量高于對(duì)照組，過表達(dá)pre-miR172a和pre-miR172c時(shí)AP2表達(dá)水平略低于對(duì)照組，但差異不顯著（圖6： D）。過表達(dá)后AP2的表達(dá)規(guī)律與正常油菜中的表達(dá)規(guī)律一致，再次證明miR172靶向調(diào)控AP2基因。

3? 討論

3.1 AP2參與油菜花發(fā)育

在擬南芥中，AP2除了在花發(fā)育過程中表達(dá)，在非花組織莖和葉中也有表達(dá)，但在非花組織的表達(dá)水平較低，在花序分生組織和幼嫩花蕾中表達(dá)增強(qiáng)（趙奇等，2005）。本研究發(fā)現(xiàn)，AP2在油菜根、葉和花中均有表達(dá)，在早熟油菜的花中AP2表達(dá)量最高，與之規(guī)律一致；在晚熟油菜的根中AP2表達(dá)量較高，而花中卻較低，初步推測(cè)獲得的油菜AP2序列綜合作用后可以正向調(diào)控開花的進(jìn)行。Wang等（2019）認(rèn)為其發(fā)現(xiàn)的euAP2家族成員中部分序列發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，其他成員在其所選樣本中表達(dá)水平無(wú)明顯差異。這與本研究結(jié)果不同，第一，篩選的候選AP2序列存在差異，可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不同；第二，本研究選擇所有候選AP2序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)的通用引物，并未分別檢測(cè)每個(gè)家族成員的表達(dá)水平，其中發(fā)揮正向和負(fù)向調(diào)控作用的成員綜合作用后呈現(xiàn)了正向調(diào)控的效果，這也可能是與前人結(jié)果不同的原因。

3.2 miR172對(duì)AP2的調(diào)控

基因表達(dá)受到不同水平的調(diào)控，包括染色體水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平等。轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平中發(fā)揮重要作用，轉(zhuǎn)錄因子主要通過與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，激活或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而起到調(diào)控基因表達(dá)的作用（Vaqueizas et al.， 2009）。Saito等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子可以與miRNA的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)，miRNA通過與靶基因的3′UTR區(qū)特異性結(jié)合，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因表達(dá)或者降解靶mRNA。轉(zhuǎn)錄因子和miRNA的有機(jī)結(jié)合增加了基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性（熊莉麗等，2014）。

AP2亞家族作為轉(zhuǎn)錄因子AP2/ERF基因家族成員之一，包含ANT和euAP2兩種類型， 其中euAP2家族成員均含有miR172的結(jié)合位點(diǎn)。本研究獲得的油菜AP2序列，與miR172比對(duì)后呈現(xiàn)1～3個(gè)堿基的錯(cuò)配，均含有miR172的結(jié)合位點(diǎn)，初步認(rèn)為獲得的AP2序列均屬euAP2家族成員。擬南芥miR172已被證實(shí)通過切割euAP2和抑制蛋白翻譯的方式調(diào)控AP2基因的表達(dá)（Aukerman & Sakai， 2003；Chen，2004）。通過分析油菜miR172和AP2表達(dá)規(guī)律間的相關(guān)性，本研究發(fā)現(xiàn)miR172家族豐度在早熟油菜中與AP2表達(dá)水平顯著或高度正相關(guān)。但是，在晚熟油菜中僅miR172b和miR172d豐度與AP2表達(dá)量高度相關(guān)，而且前者為負(fù)相關(guān)，后者為正相關(guān)，miR172a和miR172c表達(dá)豐度與AP2表達(dá)量低度相關(guān)。這表明miR172在不同油菜品種中對(duì)于AP2調(diào)控功能的發(fā)揮存在差異。推測(cè)miR172家族成員對(duì)于AP2基因的調(diào)控不僅依賴于表達(dá)豐度，還存在加工層面的調(diào)控，致使在不同油菜品種中miR172家族成員的功能發(fā)揮有所不同。在早熟油菜中miR172家族成員對(duì)AP2表達(dá)水平起促進(jìn)作用；在晚熟油菜品種中僅miR172d發(fā)揮促進(jìn)作用，miR172a、miR172b和miR172d的作用可能經(jīng)過加工后被削弱甚至不能發(fā)揮，導(dǎo)致其與AP2的關(guān)系不具備相關(guān)性，甚至呈負(fù)相關(guān)。

3.3 Pre-miR172調(diào)節(jié)miR172的表達(dá)水平

關(guān)于miRNA的研究大多集中在miRNA成熟體，有關(guān)pre-miRNA的報(bào)道較少。植物pre-miRNA對(duì)于成熟體miRNA的功能發(fā)揮有著重要意義。本研究通過檢測(cè)pre-miR172和miR172表達(dá)量以及對(duì)二者進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)miR172的表達(dá)量與pre-miR172的豐度有關(guān)，其中pre-miR172a和miR172a及pre-miR172d和miR172d高度或顯著相關(guān)， pre-miR172b和miR172b及pre-miR172c和miR172c在豐度上不呈現(xiàn)線性相關(guān)，可能是因?yàn)閙iR172豐度不僅受到前體豐度調(diào)控，還受到加工層面的調(diào)控，所以單從表達(dá)量上不表現(xiàn)出線性相關(guān)。張俊紅等（2012）在落葉松胚珠中同樣發(fā)現(xiàn)這一規(guī)律，miR156、miR166、miR397、miR398、miR408豐度與其前體表達(dá)量均不呈現(xiàn)線性相關(guān)，認(rèn)為其可能是受到加工調(diào)控；miR166在前4個(gè)發(fā)育階段與前體表達(dá)量呈線性相關(guān)， 認(rèn)為在前4個(gè)階段miR166成熟體受到前體豐度調(diào)控，到后期受到加工調(diào)控。

在晚熟油菜中發(fā)現(xiàn)，pre-miR172a和miR172a的相關(guān)系數(shù)為0.889，表現(xiàn)為顯著正相關(guān)，過表達(dá)pre-miR172a后miR172a的表達(dá)量也顯著提高，說(shuō)明pre-miR172a對(duì)于miR172a表達(dá)水平有正向調(diào)控作用；pre-miR172a表達(dá)量在根、葉、花中變化幅度不大，而miR172a變化幅度較大，這可能是由于pre-miR172a相對(duì)于成熟體更加不穩(wěn)定，容易發(fā)生降解（Schmittgen et al.， 2008），因此不能完全檢測(cè)到。pre-miR172a自由能相較于其他家族成員最低，也表明其穩(wěn)定性更低，容易降解。pre-miR172b和miR172b基本表現(xiàn)一致的表達(dá)規(guī)律，但二者不呈現(xiàn)線性關(guān)系，推測(cè)pre-miR172b對(duì)成熟體miR172b還有其他層面的加工調(diào)控。過表達(dá)pre-miR172b后，miR172b表達(dá)水平顯著提高。 pre-miR172c和miR172c表達(dá)量在晚熟油菜中呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，同時(shí)，過表達(dá)pre-miR172c后，miR172c表達(dá)水平降低且二者不呈現(xiàn)線性相關(guān)，可能是由于晚熟油菜中miR172c形成后，其前體pre-miR172發(fā)生了降解，因此檢測(cè)到的前體表達(dá)量較低，但成熟體表達(dá)量較高。pre-miR172d與miR172d在晚熟油菜中呈負(fù)相關(guān)，表明pre-miR172d豐度的增加會(huì)抑制miR172d的形成，過表達(dá)pre-miR172d后，miR172d的表達(dá)水平顯著降低，進(jìn)一步證明在表達(dá)水平上pre-miR172d對(duì)miR172d起抑制作用。

耿立英等（2015）研究表明pre-miRNA種子區(qū)的單個(gè)堿基的差異就足以導(dǎo)致miRNA成熟體功能的不同，從而調(diào)控不同靶基因。油菜中miR172序列差異較小，但在不同材料不同組織中表達(dá)水平差異較大，其原因可能在于前體的調(diào)節(jié)，前體的調(diào)節(jié)方式不僅僅局限于豐度調(diào)節(jié)，還有加工層面的調(diào)控，有待進(jìn)一步的研究。

4? 結(jié)論

本研究分析miR172和AP2的啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)均存在調(diào)控花發(fā)育的順式元件，可能參與花發(fā)育的調(diào)控。獲得的6條AP2序列均具備miR172的結(jié)合位點(diǎn)，屬miR172的靶基因，說(shuō)明AP2可能受到miR172的調(diào)控。在早熟油菜中，miR172家族成員均可促進(jìn)AP2表達(dá)，其中miR172d作用不顯著。在晚熟油菜中，主要是miR172b和miR172d共同作用降低AP2的表達(dá)水平。miR172的形成受到其前體的調(diào)節(jié)，在早熟油菜中，pre-miR172家族促進(jìn)miR172家族的表達(dá)；在晚熟油菜中pre-miR172a和pre-miR172b正向調(diào)控其成熟體的形成，pre-miR172c和pre-miR172d則對(duì)于其成熟體的形成發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

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（責(zé)任編輯? 鄧斯麗）