兒童肺炎支原體肺炎肺泡灌洗液CARDSTX、HMGB1、TLR2表達(dá)及臨床意義

李玉琴 王喆 丁瑩 儲(chǔ)矗 周衛(wèi)芳

【摘要】目的研究肺炎支原體肺炎（MPP）患兒肺泡灌洗液中社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素（CARDSTX）、高遷移率族蛋白1（HMGB1）、Toll樣受體2（TLR2）表達(dá)，探討其在MPP發(fā)病中的臨床意義。

方法回顧性分析55例MPP病例組及20例對(duì)照組臨床資料，同時(shí)檢測(cè)兩組支氣管肺泡灌洗液（BALF）中CARDSTX、HMGB1、TLR2、TLR4、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）及髓樣分化因子88（MyD88）表達(dá)，體外檢測(cè)不同濃度CARDSTX刺激下HMGB1、TLR2的表達(dá)并進(jìn)行比較。

結(jié)果與對(duì)照組相比，MPP組LYM絕對(duì)值計(jì)數(shù)、PA、CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、NKcell、CD19+CD23+明顯下降，CRP、LDH、D-二聚體、IgA、IgG、IgM、CARDSTX、HMGB1、TLR2、MyD88均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.001）。CARDSTX刺激后HMGB1、TLR2的表達(dá)升高，且呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

結(jié)論CARDSTX可能通過(guò)HMGB1-TLR2-MyD88途徑參與肺炎支原體（MP）的致病。

【關(guān)鍵詞】肺炎支原體肺炎；社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素；高遷移率族蛋白1；Toll樣受體2；髓樣分化因子88

中圖分類(lèi)號(hào)：R725.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.05.003

ExpressionandclinicalsignificanceofCARDSTX，HMGB1andTLR2inbronchoalveolarlavagefluidinchildrenwithmycoplasmapneumoniaepneumonia

LIYuqin，WANGZhe，DINGYing，CHUChu，ZHOUWeifang

（DepartmentofInfectiousDiseases，Children'sHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215000，Jiangsu，China）

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionsofcommunity-acquiredrespiratorydistresssyndrometoxin（CARDSTX），highmobilitygroupbox-1protein（HMGB1）andToll-likereceptors2（TLR2）inbronchoalveolarlavagefluidinchildrenwithmycoplasmapneumoniaepneumonia（MPP），andtoexploretheclinicalsignificanceofCARDSTX，HMGB1andTLR2inthepathogenesisofMPP.

MethodsRetrospectiveanalysiswascarriedoutontheclinicaldataof55MPPchildrenand20childrenincontrolgroup.AndtheexpressionsofCARDSTX，HMGB1，TLR2，TLR4，receptorofadvancedglycationendproducts（RAGE）andmyeloiddifferentiationprimaryresponse88（MyD88）inbronchoalveolarlavagefluid（BALF）ofthetwogroups.Inaddition，theexpressionsofHMGB1andTLR2afterstimulationwithdifferentconcentrationsofCARDSTXinvitroweredetectedandcompared.

ResultsComparedwiththecontrolgroup，LYMabsolutevaluecount，PA，CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD3-CD19+，NKcell，andCD19+CD23+weresignificantlydecreased，whileCRP，LDH，D-dimer，IgA，IgG，IgM，CARDSTX，HMGB1，TLR2andMyD88weresignificantlyincreased，anddifferencewasstatisticallysignificant（P<0.05or0.001）.TheexpressionofHMGB1andTLR2increasedafterCARDSTXstimulation，therewasapositivecorrelationbetweenthem，anddifferencewasstatisticallysignificant（P<0.001）.

ConclusionCARDSTXmaybeinvolvedinthepathogenesisofmycoplasmapneumoniae（MP）throughHMGB1-TLR2-MyD88pathway.

【Keywords】mycoplasmapneumoniaepneumonia（MPP）;community-acquiredrespiratorydistresssyndrometoxin（CARDSTX）;highmobilitygroupbox-1protein（HMGB1）;Toll-likereceptor2（TLR2）;myeloiddifferentiationprimaryresponse88（MyD88）

肺炎支原體（mycoplasmapneumoniae，MP）可以通過(guò)呼吸道飛沫傳播及直接接觸傳播，兒童普遍易感，最終發(fā)展為肺炎支原體肺炎（mycoplasmapneumoniaepneumonia，MPP）的概率超過(guò)30%，且感染后長(zhǎng)期存在，易反復(fù)發(fā)作。MPP占住院兒童社區(qū)獲得性肺炎（communityacquiredpneumonia，CAP）的比例超過(guò)10%，因此，早期診斷并及時(shí)治療MPP，成為兒科醫(yī)生急需關(guān)注的問(wèn)題。本研究通過(guò)觀察MPP患兒的臨床特征，以及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF）中社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素（communityacquiredrespiratorydistresssyndrometoxin，CARDSTX）、高遷移率族蛋白1（highmobilitygroupbox1，HMGB1）及其受體表達(dá)量及各指標(biāo)之間的相關(guān)性，探索CARDSTX、HMGB1、Toll樣受體2（Toll-likereceptor2，TLR2）在MPP發(fā)病中的可能機(jī)制，為MPP診療提供新的思路。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1研究對(duì)象

選取2018年1月至2019年6月期間在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院住院治療，確診為MPP并行支氣管鏡檢查的患兒55例為MPP組［月齡（25.86±14.68）個(gè)月，男女比例33/22］，同時(shí)選取同期因支氣管異物行支氣管鏡檢查的兒童20例作為對(duì)照組［月齡（27.89±16.64）個(gè)月，男女比例12/8）］。兩組性別、月齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

MPP組入選標(biāo)準(zhǔn)：符合MPP診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。排除其他病原體的混合感染，有支氣管肺發(fā)育不良、免疫缺陷、先天性心臟病等病史及病史資料不完整的病例。對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)：有異物吸入史，病程小于3天，影像學(xué)檢查表現(xiàn)為明確的異物征象且未提示炎性改變，最近2個(gè)月內(nèi)無(wú)下呼吸道感染。本研究為回顧性研究，通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2020CS035），且征得研究對(duì)象家長(zhǎng)的知情同意。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集

采集BALF，所有患兒用37℃生理鹽水進(jìn)行灌洗（0.5～1mL/kg，不超過(guò)5～10mL/kg），再通過(guò)負(fù)壓將灌洗液吸出，獲得的BALF保存于滅菌收集器分別送病原學(xué)檢測(cè)（MP、CP核酸定量檢測(cè)試劑盒；廣州達(dá)安基因股份有限公司，病毒快診試劑盒：DIAGNOSTICHYBRIDSUSA）。BALF標(biāo)本離心后管底沉淀加入0.5mLTrizol，提取總RNA，RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用RT-qPCR法檢測(cè)CARDSTX、HMGB1、TLR2、Toll樣受體4（Toll-likereceptor4，TLR4）、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptorforadvancedglycationendproduct，RAGE）及髓樣分化因子88（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）表達(dá)。采集外周血標(biāo)本，患兒入院后2h內(nèi)抽取外周血，進(jìn)行血常規(guī)、生化全套、凝血功能、體液免疫、T淋巴細(xì)胞亞群等檢測(cè)。

1.2.2檢測(cè)方法

培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，接種于24孔板上，后使用不同CARDSTX（北京義翹神州生物科技股份有限公司上海分公司）（0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）濃度刺激THP-1細(xì)胞，收樣后離心獲取THP-1細(xì)胞沉淀，提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同濃度CARDSTX刺激下HMGB1、TLR2的表達(dá)。引物序列順序見(jiàn)表1。

1.3收集并統(tǒng)計(jì)臨床資料

收集入組患兒的血常規(guī)、生化全套、凝血常規(guī)及免疫等實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS24.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料滿(mǎn)足正態(tài)分布的，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，不滿(mǎn)足正態(tài)分布的，以中位數(shù)［M（Q1，Q3）］表示，兩組間比較用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)室檢查比較

MPP組淋巴細(xì)胞（lymphocyte，LYM）絕對(duì)值計(jì)數(shù)、前白蛋白（prealbumin，PA）、CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、NKcell、CD19+CD23+較對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.001）。C反應(yīng)蛋白（C-reactiveprotein，CRP）、乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）、D-二聚體、IgA、IgG、IgM較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.001）。見(jiàn)表2。

2.2CARDSTX、HMGB1、TLR2、TLR4、RAGE和MyD88表達(dá)水平及相關(guān)性

MPP組患兒BALF中CARDSTX、HMGB1、TLR2、MyD88的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），兩組間TLR4、RAGE的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。MPP組BALF中CARDSTX的表達(dá)量與HMGB1、TLR2及MyD88的表達(dá)量呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；HMGB1的表達(dá)量與TLR2及MyD88的表達(dá)量呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)表3、表4。

2.3CARDSTX誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)HMGB1、TLR2

不同濃度CARDSTX的刺激下，HMGB1、TLR2的相對(duì)表達(dá)量經(jīng)方差分析差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在CARDSTX10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL濃度刺激下的HMGB1、TLR2相對(duì)表達(dá)量均較空白組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)表5。

2.4CARDSTX、HMGB1、TLR2間表達(dá)量的相關(guān)性分析

CARDSTX與HMGB1、TLR2表達(dá)量均呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），CARDSTX刺激THP-1細(xì)胞，HMGB1與TLR2表達(dá)量呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)表6。

3討論

MP是一種沒(méi)有細(xì)胞壁的微生物，可引起MPP，是引起CAP最常見(jiàn)的非典型病原菌。接受纖維支氣管鏡治療的下呼吸道感染患兒中，MP檢出率最高［2］。近幾年，MPP的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且發(fā)展迅猛，病程長(zhǎng)，易耐藥，還可能進(jìn)展為難治性肺炎支原體肺炎（refractorymycoplasmapneumoniaepneumonia，RMPP）甚至引起皮膚損害、胃腸道功能紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害及心血管系統(tǒng)病變等肺外組織改變，嚴(yán)重影響兒童的生活質(zhì)量及生命健康。

MP感染促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞因子及炎癥因子的高表達(dá)，過(guò)度的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的快速凋亡以及臟器損害，從而使血循環(huán)表現(xiàn)為白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞升高，淋巴細(xì)胞降低［3］，并引起CRP、LDH升高，PA下降。有研究表明［4］，LDH可以作為評(píng)估MPP病情嚴(yán)重程度及是否需要使用全身糖皮質(zhì)激素治療的參考指標(biāo)之一。D-二聚體是反映機(jī)體凝血功能的特異性指標(biāo)，其增高反映了機(jī)體的高凝和纖溶狀態(tài)［5］。MPP患者中普遍存在D-二聚體水平的升高［6］，D-二聚體水平與病情密切相關(guān)，D-二聚體升高，MPP患兒病情加重。

MP引起的免疫反應(yīng)是MP致病的重要原因，本研究中，MP感染后機(jī)體CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD19+、NKcell、CD19+CD23+水平下調(diào)，表明MP感染后機(jī)體免疫功能下降，免疫調(diào)節(jié)功能失衡，從而增加了機(jī)體對(duì)MP的易感性及抑制了MP的清除［7］。研究表明［8］，MP抗原與人體組織存在相似的抗原成分，可選擇性激活B細(xì)胞，產(chǎn)生特異性或非特異性的IgA、IgM、IgG，使體內(nèi)免疫蛋白增高從而產(chǎn)生免疫效應(yīng)，并可以產(chǎn)生自身抗體，最終導(dǎo)致多系統(tǒng)免疫損傷。這與我們研究中MPP組IgA、IgM、IgG升高的結(jié)果一致。

CARDSTX是MP產(chǎn)生的唯一外毒素，可以通過(guò)表面活性劑蛋白A和膜聯(lián)蛋白A2與氣道上皮細(xì)胞結(jié)合發(fā)揮ADP-核糖基化活性及空泡活性，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在MP發(fā)病中發(fā)揮作用。CARDSTX可模擬類(lèi)似于MP感染后的病理改變，可引起感染小鼠纖毛停滯、空泡化、核固縮和炎癥因子釋放等改變［9］。并且CARDSTX濃度與MP感染的小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分呈正相關(guān)［10］。MP感染的小鼠肺泡灌洗液中CARDSTX的濃度與MP基因表達(dá)量及小鼠肺部疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［11］。MPP的CARDSTX表達(dá)量越高，患兒臨床癥狀越重，發(fā)熱熱程及住院天數(shù)越長(zhǎng)，并且更易形成胸腔積液及支氣管黏液栓，更易發(fā)生肺外并發(fā)癥，是提示RMPP的重要指標(biāo)［12］。同時(shí)，阻斷CARDSTX可以減輕MPP的嚴(yán)重程度［13］?？梢酝茰y(cè)CARDSTX可能是MP致病過(guò)程中的主要毒素。

HMGB1是一種具有促炎效應(yīng)的細(xì)胞因子，可由壞死細(xì)胞被動(dòng)分泌以及單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌，可與TLR2、TLR4或RAGE受體結(jié)合激活MyD88依賴(lài)性信號(hào)通路引起炎癥因子IL-1、IL-6等的大量釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而在敗血癥、關(guān)節(jié)炎、肺炎等炎癥性疾病的致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MP-DNA陽(yáng)性的大葉性肺炎患兒肺泡灌洗液HMGB1表達(dá)升高，且HMGB1與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［14］。MPP患兒外周血HMGB1表達(dá)隨著疾病嚴(yán)重程度升高，恢復(fù)期明顯下降［15］。表明HMGB1在MPP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。TLR2-MyD88信號(hào)通路是肺部感染中一條重要的炎性調(diào)控通路。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠鼻內(nèi)接種MP發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞表面的TLR，尤其是TLR2，可以通過(guò)識(shí)別MP特異性抗原，激活MyD88-核因子-B（nuclearfactor-B，NF-B）信號(hào)通路，從而將入侵肺部的MP清除，表明TLR-MyD88-NF-B通路參與了MP感染后肺部MP的清除過(guò)程［16］。本研究中MPP患兒BALF中CARDSTX、HMGB1、TLR2、MyD88相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，且CARDSTX、HMGB1與TLR2、MyD88的表達(dá)量呈正相關(guān)，進(jìn)一步體外利用不同濃度的CARDSTX刺激THP-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HMGB1與TLR2的表達(dá)量呈正相關(guān)，均隨CARDSTX濃度的增加而增加，提示MP可能通過(guò)CARDSTX介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞損傷刺激HMGB1的釋放，進(jìn)而通過(guò)HMGB1-TLR2-MyD88途徑參與MPP的發(fā)病。

綜上所述，MP感染后存在炎癥因子的過(guò)度激活、淋巴細(xì)胞再分配、血液高凝及免疫功能紊亂，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MP感染后，可能通過(guò)CARDSTX刺激HMGB1的釋放，從而經(jīng)TLR2-MyD88途徑激活下游的信號(hào)通路，發(fā)生免疫炎癥反應(yīng)，為MP致病機(jī)制的研究及臨床診斷、治療提供一定的幫助。但本研究?jī)H涉及體外細(xì)胞培養(yǎng)，未通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，且樣本量相對(duì)較小，體外不同濃度CARDSTX刺激THP-1細(xì)胞后未檢測(cè)MyD88表達(dá)，后期仍需更大樣本量及進(jìn)一步基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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