馬錢苷調(diào)節(jié)AKT/AMPK/Nrf2通路改善氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元鐵死亡的機制研究

楊祎 賈健 魏小利 茍平平 袁媛 高李

摘要 目的： 探討馬錢苷通過調(diào)節(jié)蛋白激酶B（AKT）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/核因子.E2相關(guān)因子2（Nrf2）通路改善氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）誘導(dǎo)的神經(jīng)元鐵死亡的機制。 方法： 將神經(jīng)元分為對照組、OGD/R組、OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷＋ML385組。透射電子顯微鏡觀察神經(jīng)元線粒體形態(tài)；檢測鐵含量、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）活性、4.羥基壬烯醛（4.HNE）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG），還原型輔酶Ⅱ（NADPH）/輔脫氫酶Ⅱ（NADP ＋）及乳酸脫氫酶（LDH）含量；使用CM.H2DCFDA、C11.BODIPY581/591分別檢測細(xì)胞內(nèi)和脂質(zhì)活性氧（ROS）水平；四唑鹽（MTT）試劑盒檢測細(xì)胞活性；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl.2）、Bcl相關(guān)X蛋白（Bax）、剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase.3）、磷酸化的蛋白激酶B（p.AKT）/AKT、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶（p.AMPK）/AMPK、Nrf2蛋白表達。 結(jié)果： OGD/R組神經(jīng)元線粒體出現(xiàn)碎片化現(xiàn)象，嵴減少，線粒體膜密度有所增 加。與對照組比較，OGD/R組GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相對活性、 細(xì)胞活力以及Bcl.2水平、p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、 ?Nrf2水平下降（ P ＜0.05），F(xiàn)e ?2＋ 含量、細(xì)胞內(nèi)ROS水平、脂質(zhì)ROS水平以及4.HNE、MDA水平、LDH釋放量、Bax以及cleaved Caspase.3 水平上升（ P ＜0.05）；馬錢苷處理后神經(jīng)元線粒體中的線粒體嵴變得較為完整，碎片化現(xiàn)象消失，OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組較OGD/R組GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相對活性、細(xì)胞活力以及Bcl.2水平、p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、Nrf2水平上升（ P ＜0.05），F(xiàn)e ?2＋ 含量、 細(xì)胞內(nèi)ROS水平、脂質(zhì)ROS水平以及4.HNE、MDA水平、LDH釋放量、Bax 以及cleaved Caspase.3水平下降（ P ＜0.05），且隨著馬錢苷劑量的增加，改善效果更顯著；OGD/R＋H.馬 錢苷＋ML385組以上指標(biāo)與OGD/R組趨勢一致。 結(jié)論： 馬錢苷可能通過調(diào)節(jié)AKT/AMPK/Nrf2通路改善OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元鐵死亡。

關(guān)鍵詞 ?氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧；鐵死亡；馬錢苷；蛋白激酶B/腺苷酸活化蛋白激酶/核因子.E2相關(guān)因子2通路；神經(jīng)元

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.09.010

Mechanism of AKT/AMPK/Nrf2 Regulated by Loganin to Improve Ferroptosis Induced by Oxygen Glucose Deprivation/Reoxygenation

YANG Yi， JIA Jian， WEI Xiaoli， GOU Pingping， YUAN Yuan， GAO Li

Baoji Central Hospital， Baoji 721000， Shaanxi， China

Corresponding Author ?GAO Li， E.mail： gaoli1980g@163.com

Abstract Objective： To investigate the mechanism of loganin improves the ferroptosis induced by oxygen glucose deprivation/reoxygenation（OGD/R） by regulating protein kinase B（AKT）/adenylate activated protein kinase（AMPK）/nuclear factor E2 associated factor 2（Nrf2） pathway. ??Methods： The neurons were divided into control group，OGD/R group，OGD/R＋L.loganin group，OGD/R＋M.loganin ?group，OGD/R＋H.loganin group，OGD/R＋H.loganin＋ML385 group.The morphology of neuron mitochondria was observed by transmission electron microscope.Iron content，glutathione peroxidase 4（GPX4） activity，4.hydroxynonenal（4.HNE），superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），reduced glutathione（GSH）/oxidized glutathione（GSSG），reduced Coenzyme Ⅱ（NADPH）/Codehydrogenase Ⅱ（NADP ＋），and Lactate dehydrogenase（LDH） content were determined.Intracellular and lipid reactive oxygen species（ROS） levels were detected by CM.H2DCFDA and C11.BODIPY581/591，respectively.MTT assay was used to detect cell activity.B.cell lymphoma 2（Bcl.2），Bcl.associated X protein（Bax），cleaved Caspase.3，phosphorylated protein kinase B（p.AKT）/AKT，phosphorylated adenylate activated protein kinase（p.AMPK）/AMPK，Nrf2 protein expression were detected by Western Blot. ?Results： In OGD/R group，mitochondrial fragmentation occurred，ridge decreased，and mitochondrial membrane density increased.Compared with the control group，the relative activities of GSH/GSSG，NADPH/NADP ＋，SOD，GPX4，and the levels of Bcl.2，p.AKT/AKT，p.AMPK/AMPK and Nrf2 in OGD/R group decreased（ P ＜0.05），F(xiàn)e ?2＋ content，intracellular ROS levels，lipid ROS levels，4.HNE，MDA levels，LDH release，Bax，and cleaved Caspase.3 levels increased（ P ＜0.05）.After treatment with loganin，the mitochondrial ridge in neuronal mitochondria became more complete and the fragmentation disappeared.The relative activity of GSH/GSSG，NADPH/NADP ＋，SOD，GPX4，Bcl.2 level，p.AKT/AKT，p.AMPK/AMPK，and Nrf2 in OGD/R＋L.loganin group，OGD/R＋M.loganin group and OGD/R＋H.loganin group were higher than those in OGD/R group，F(xiàn)e ?2＋ content，intracellular ROS levels，lipid ROS levels，4.HNE，MDA levels，LDH release，Bax，and cleaved Caspase.3 levels were lower than those in OGD/R group（ P ＜0.05）.With the increase of the dose of loganin，the improvement effects were more significant.The above indexes of OGD/R＋H.loganin＋ML385 group were consistent with the trend of OGD/R group. ?Conclusion： loganin may ameliorate OGD/R.induced neuronal ferroptosis by regulating the AKT/AMPK/Nrf2 pathway.

Keywords ?oxyglucose deprivation/reoxygenation; ferroptosis; loganin; protein kinase B/adenylate.activated protein kinase/nuclear factor.E2.related factor 2 pathway; neurons

腦梗死是一種常見的缺血性腦血管病，是由于各種原因造成腦動脈閉塞，引起相應(yīng)供血區(qū)域腦細(xì)胞缺血、缺氧、壞死，出現(xiàn)相應(yīng)功能障礙；臨床上通常通過恢復(fù)血流來治療，但恢復(fù)血流可能導(dǎo)致缺血區(qū)域的繼發(fā)性損傷，簡稱為缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI） ?［1］ 。IRI會誘發(fā)線粒體氧化代謝受損及神經(jīng)元能量消耗，進而導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡 ?［2］ 。鐵死亡是一種鐵依賴的細(xì)胞死亡形式，由脂質(zhì)過氧化物的過量積累介導(dǎo)，其對腦梗死等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要意義 ?［3］ 。尋找適當(dāng)?shù)乃幬飦肀Ｗo神經(jīng)元免受IRI的影響是目前急需解決的難題之一。

馬錢苷（loganin，log）是一種從山茱萸中提取的環(huán)烯醚萜苷，具有神經(jīng)保護 ?［4］ 、抗氧化 ?［5］ 、抗炎 ?［6］ 等特性。有研究發(fā)現(xiàn)，馬錢苷可減輕脂多糖刺激的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞對原代神經(jīng)元的損傷，對大腦中動脈閉塞小鼠發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護作用 ?［7］ 。據(jù)報道，調(diào)節(jié)腺苷酸活化蛋白激酶（AMP.activated protein kinase，AMPK）/核因子.E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2.related factor 2，Nrf2）信號通路可以對IRI中的神經(jīng)元起到保護作用 ?［8］ 。蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）參與細(xì)胞生長、增殖、凋亡和蛋白質(zhì)合成等生物過程 ?［9］ 。AKT也與Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)有關(guān) ?［10］ 。研究發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)MPK/Nrf2信號通路可減輕氧葡萄糖剝奪/復(fù) 氧（oxygen.glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R） 誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷 ?［11］ 。本研究探討馬錢苷通過激活A(yù)KT/AMPK/Nrf2通路減輕OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元鐵死亡的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

3只妊娠C57BL/6j小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物 中心［許可證號SCXK（粵）2022.0002］；飼養(yǎng)于晝夜12 h 交替、濕度45%、室溫（23±1）℃環(huán)境中，自由進食。馬錢苷（貨號：YT62708）購自北京伊塔生物科技有限公司；ML385（貨號：S86700）購自上海源葉生物科技有 限公司；4.羥基壬烯醛（4.hydroxynonenal，4.HNE） 試劑盒（貨號：EK.M25633）、超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）試劑盒（貨號：EK.M29371）、 ?丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號：EK.M29370） 購自上海酶研生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）（貨號：AAT.10056）和還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine nucleoside phosphorylase b，NADPH）/輔脫氫酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP ＋）試劑盒（貨號：K347.100）購自上海研卉生物科技有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）（貨號：ybC994Hu）試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司；四唑鹽（MTT）試劑盒（貨號：FT.P9S1344X）購自上海梵態(tài)生物科技有限公司；總活性氧（reactive ?oxygen species，ROS）熒光探針CM.H2DCFDA（貨號：HY.D1713）及脂質(zhì)ROS熒光探針C11.BODIPY581/591 （貨號：HY.D1301）購自美國MCE公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（貨號：Dojindo） 購自上海覓拓生物科技有限公司；磷酸化的蛋白激酶B （p.AKT）抗體（貨號：4060）、AKT（貨號：9272）、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶（p.AMPK）抗體（貨號：4185）購自Cell Signaling Technology公司；鐵含量檢測試劑 盒（貨號：ab83366）、B細(xì)胞淋巴瘤2（B.cell lymphoma 2， Bcl.2）（貨號：ab32124）、Bcl相關(guān)X蛋白（Bcl.associated X protein，Bax）抗體（貨號：ab32503）、剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase.3）抗體（貨號：ab2302）、AMPK抗體（貨號：ab3760）購自Abcam公司；Nrf2抗體（貨號：bs.2013）購自RBioss公司；電泳儀（貨號：1645050.OG）購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；離心機（貨號：D1524R）購自大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原代皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)

參考文獻［12］將妊娠的C57BL/6j小鼠處死，從胎鼠中分離原代皮質(zhì)神經(jīng)元。首先分離小鼠大腦皮層，大腦皮層經(jīng)胰酶消化后，分離神經(jīng)元置于含有2% ?B27和2 mmol/L谷氨酰胺的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO 2 的條件下培養(yǎng)10 d后開始進行實驗。

1.2.2 OGD/R模型的構(gòu)建及分組

將原代神經(jīng)元用不含葡萄糖的杜爾伯科改良伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)基置于1%O 2、5%CO 2和94%N 2的缺氧37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，誘導(dǎo)OGD損傷。在OGD之后，將培養(yǎng)基更換為新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h構(gòu)建OGD/R模型 ?［13］ 。

將神經(jīng)元分為對照組、OGD/R組、OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷＋ML385組。對照組神經(jīng)元未做任何處理，OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組分別 用10、30、50 μmol/L馬錢苷預(yù)處理1 h ?［14］ ，然后暴露于 ?OGD/R；OGD/R＋H.馬錢苷＋ML385組用馬錢苷 （50 μmol/L）加ML385（1 μmol/L）預(yù)處理1 h后暴露于OGD/R ?［12］ 。

1.2.3 觀察神經(jīng)元線粒體形態(tài)

收集各組神經(jīng)元，用2%戊二醛固定2 h，然后用1%四氧化鋨固定1 h，經(jīng)過乙醇脫水，包埋劑包埋后，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行染色，在透射電子顯微鏡下觀察神經(jīng)元線粒體形態(tài)。

1.2.4 比色法檢測細(xì)胞內(nèi)鐵含量

按照鐵含量檢測試劑盒檢測神經(jīng)元內(nèi)鐵濃度。Fe ?2＋ 相對含量＝［Fe ?2＋ （實驗組）－Fe ?2＋ （空白組）］/［Fe ?2＋ （對照組）－Fe ?2＋ （空白組）］×100%。

1.2.5 比色法檢測神經(jīng)元細(xì)胞的GPX4、4.HNE、SOD、MDA、GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、LDH水平

用裂解緩沖液裂解神經(jīng)元細(xì)胞，采用GPX4、 4.HNE、SOD、MDA、GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、LDH試劑盒檢測神經(jīng)元細(xì)胞的GPX4、4.HNE、SOD、MDA、GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、LDH水平。

1.2.6 CM.H2DCFDA及C11.BODIPY581/591檢測ROS水平

使用CM.H2DCFDA檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。在各組神經(jīng)元中加入10 μmol/L CM.H2DCFDA 37 ℃避光孵育30 min，在酶標(biāo)儀中檢測熒光強度。使用C11.BODIPY581/591測量脂質(zhì)ROS水平。在各組神經(jīng)元中加入2.5 ?μmol/L C11.BODIPY581/591并在37 ℃避光孵育30 min，用酶標(biāo)儀檢測熒光強度。

1.2.7 MTT檢測細(xì)胞活性

藥物處理結(jié)束后收集各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，然后加入0.5 mg/mL MTT試劑37 ℃孵育4 h，棄去MTT溶液后，加入100 μL 二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚，最后上機檢測吸光度。

1.2.8 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測凋亡相關(guān)蛋白以及通路相關(guān)蛋白表達

收集經(jīng)裂解液處理的各組神經(jīng)元細(xì)胞，提取各組神經(jīng)元的總蛋白，電泳分離后轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯 （PVDF）膜上，之后用脫脂牛奶封閉，加入一抗Bcl.2 ?（1∶2 000）、Bax（1∶2 000）、cleaved Caspase.3（1∶2 000）、 AKT（1∶1 000）、 p.AKT（1∶1 000）、AMPK（1∶1 000）、 p.AMPK（1∶2 000）、Nrf2（1∶2 000）和GAPDH抗體（1∶1 000），在4 ℃下過夜，加入二抗，加入顯色劑使目的條帶顯色，使用Image Lab ?TM 軟件分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x ?± s ）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用SNK. q 檢驗。 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ?馬錢苷對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體形態(tài)的影響

對照組線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無異?，F(xiàn)象；OGD/R組神經(jīng)元線粒體出現(xiàn)碎片現(xiàn)象，嵴減少，線粒體膜密度有所增加；馬錢苷處理后神經(jīng)元線粒體中的線粒體嵴 變得較為完整，碎片化現(xiàn)象消失；OGD/R＋H.馬錢 苷＋ML385組現(xiàn)象與OGD/R組現(xiàn)象相似。詳見圖1。

2.2 馬錢苷對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元鐵含量的影響

與對照組比較，OGD/R組Fe ?2＋ 相對含量提高 （ P ＜0.05）；與OGD/R組比較，OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組Fe ?2＋ 相對含量下降（ P ＜0.05），且隨著馬錢苷劑量的增加， Fe ?2＋ 相對含量變化更明顯，呈現(xiàn)劑量相關(guān)性；與OGD/R＋ H.馬錢苷組比較，OGD/R＋H.馬錢苷＋ML385組Fe ?2＋ 相對含量升高（ P ＜0.05）。詳見表1。

2.3 ?馬錢苷對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元抗氧化指標(biāo)的影響

與對照組比較，OGD/R組GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相對活性下調(diào)（ P ＜0.05）；與OGD/R組比較，OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相對活性上調(diào)（ P ＜0.05）；與OGD/R＋H.馬錢苷組比較，OGD/R＋H.馬錢苷＋ML385組GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4相對活性下調(diào)（ P ＜0.05）。詳見表2。

2.4 ?馬錢苷對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元脂質(zhì)過氧化的影響

OGD/R組較對照組細(xì)胞內(nèi)ROS水平、脂質(zhì)ROS 水平以及4.HNE、MDA水平上升（ P ＜0.05）；與OGD/R 組比較，OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組細(xì)胞內(nèi)ROS水平、脂質(zhì)ROS 水平以及4.HNE、MDA水平下降（ P ＜0.05）；OGD/R＋ H.馬錢苷＋ML385組較OGD/R＋H.馬錢苷組細(xì)胞內(nèi)ROS水平、脂質(zhì)ROS水平以及4.HNE、MDA水平上升（ P ＜0.05）。詳見表3。

2.5 馬錢苷對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞活力和細(xì)胞死亡的影響

OGD/R組較對照組細(xì)胞活力以及Bcl.2水平顯著降低，LDH釋放量、Bax以及cleaved Caspase.3水平升高（ P ＜0.05）；與OGD/R組比較，OGD/R＋L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢苷組細(xì)胞活力以及Bcl.2水平升高，LDH釋放量、Bax以及 cleaved ?Caspase.3水平降低（ P ＜0.05）；OGD/R＋ H.馬錢苷＋ML385組較OGD/R＋H.馬錢苷組細(xì)胞活力以及Bcl.2水平下降，LDH釋放量、Bax以及cleaved Caspase.3水平上升（ P ＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.6 馬錢苷對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元中AKT/AMPK/Nrf2通路蛋白表達的影響

OGD/R組較對照組p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、 Nrf2下降（ P ＜0.05）；與OGD/R組比較，OGD/R＋ L.馬錢苷組、OGD/R＋M.馬錢苷組、OGD/R＋H.馬錢 苷組p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、Nrf2升高（ P ＜0.05）； OGD/R＋H.馬錢苷＋ML385組較OGD/R＋H.馬錢苷組p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、Nrf2下降（ P ＜0.05）。詳見圖3、表5。

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計，腦卒中每年導(dǎo)致全球數(shù)百萬人腦損傷，盡管已知缺血會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，但其潛在機制尚未明確，且目前還沒有確切的治療方法可以減少梗死面積或神經(jīng)功能障礙 ?［15.16］ 。研究發(fā)現(xiàn)，馬錢苷可能是治療缺血性腦卒中的潛在神經(jīng)保護劑 ?［17.18］ 。鐵死亡與腦卒中的發(fā)病機制密切相關(guān) ?［19］ 。在本研究中，OGD/R處理后神經(jīng)元線粒體出現(xiàn)碎片現(xiàn)象，嵴減少，線粒體膜密度有所增加（鐵死亡的主要特征），且神經(jīng)元的細(xì)胞活力降低，細(xì)胞死亡增加，表明OGD/R促進了神經(jīng)元損傷。馬錢苷處理后神經(jīng)元線粒體中的線粒體嵴變得較為完整，碎片化現(xiàn)象消失，神經(jīng)元的細(xì)胞活力增加，細(xì)胞死亡降低，提示馬錢苷可能對OGD/R神經(jīng)元損傷起到了改善作用。

鐵死亡是一種細(xì)胞死亡形式，其特征在于脂質(zhì)過氧化的鐵依賴性積累 ?［20］ 。4.HNE是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，已被確定為參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、鐵死亡和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵第二信使 ?［21］ 。脂質(zhì)ROS的積累是鐵死亡的一個重要指標(biāo) ?［22］ 。而GPX4是一種抗氧化防御酶，有研究發(fā)現(xiàn)，GXP4的消融會誘導(dǎo)鐵死亡并引發(fā)前腦神經(jīng)元的神經(jīng)變性 ?［23］ 。GPX4可使用GSH作為共底物減少脂質(zhì)氫過氧化物，抑制鐵死亡 ?［24］ 。而NADPH可以誘導(dǎo)GSSG轉(zhuǎn)化為GSH ?［25］ 。NADPH和GSH的還原形式以及SOD是最重要的內(nèi)源性抗氧化劑 ?［26］ 。 因此，本研究檢測以上指標(biāo)觀察馬錢苷是否對鐵死亡 產(chǎn)生影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OGD/R處理后神經(jīng)元中GSH/GSSG、 NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4水平均下降，F(xiàn)e ?2＋ 含量、神經(jīng)元中的細(xì)胞內(nèi)和脂質(zhì)ROS以及4.HNE、MDA水平增加，提示OGD/R可能降低了神經(jīng)元的抗氧化能 力，誘導(dǎo)了鐵死亡。而馬錢苷處理后神經(jīng)元中 GSH/GSSG、NADPH/NADP ＋、SOD、GPX4水平均升 高，F(xiàn)e ?2＋ 含量、神經(jīng)元中的細(xì)胞內(nèi)和脂質(zhì)ROS以及 4.HNE、MDA水平降低，證實馬錢苷有抗氧化作用，可減輕鐵死亡。

AKT和AMPK的磷酸化誘導(dǎo)Nrf2通路的活化，已有大量研究表明激活A(yù)KT/AMPK/Nrf2通路可以減輕炎癥和氧化應(yīng)激損傷 ?［11］ ，研究發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)MPK/Nrf2信號通路可能減輕IRI，發(fā)揮神經(jīng)保護作用 ?［9］ 。本研究 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OGD/R處理后神經(jīng)元中p.AKT/AKT、 p.AMPK/AMPK、Nrf2水平均下降，而馬錢苷使p.AKT/AKT、p.AMPK/AMPK、Nrf2升高，提示馬錢苷可能通過激活A(yù)KT/AMPK/Nrf2信號通路改善OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元鐵死亡。為了進一步驗證馬錢苷的作用機制，本研究在使用馬錢苷處理的基礎(chǔ)上，加入AKT/AMPK/Nrf2通路抑制劑ML385，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ML385可減弱馬錢苷對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元鐵死亡的抑制作用，表明 馬錢苷可能通過激活A(yù)KT/AMPK/Nrf2通路改善OGD/R 誘導(dǎo)的神經(jīng)元鐵死亡。

綜上所述，馬錢苷可能通過激活A(yù)KT/AMPK/Nrf2通路改善OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元鐵死亡。然而，馬錢苷是否可以通過調(diào)節(jié)其他通路改善OGD/R誘導(dǎo)的鐵死亡，需要進一步深入探究。

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（收稿日期：2022.10.10）

（本文編輯 鄒麗）