2019—2021年宜春地區(qū)患者結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥株基因型分析研究

鄔俊勇 黃韜 江光榮

*基金項(xiàng)目：2023年宜春市指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目（2023ZDJH2691）

【摘要】 目的：探究2019—2021年宜春地區(qū)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥株基因型。方法：選擇2019年1月—2021年12月于宜春市人民醫(yī)院接受治療的肺結(jié)核患者100例，采集所有患者痰液樣本進(jìn)行檢測(cè)。分析結(jié)核分枝桿菌分離情況及耐藥性，另分析利福平耐藥株基因型。結(jié)果：100例患者中共分離出結(jié)核分枝桿菌47株，分離率為47.00%，2019、2020、2021年結(jié)核分枝桿菌分離率分別為33.33%、45.95%、54.76%。2019年分離出結(jié)核分枝桿菌7株，利福平、異煙肼、鏈霉素耐藥發(fā)生率分別為42.86%、28.57%、28.57%；2020年分離出結(jié)核分枝桿菌17株，利福平、異煙肼、鏈霉素耐藥發(fā)生率分別為58.82%、29.41%、11.76%；2021年分離出結(jié)核分枝桿菌23株，利福平、異煙肼、鏈霉素耐藥發(fā)生率分別為60.87%、21.74%、17.39%。結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平耐藥率最高。經(jīng)rpoB基因測(cè)序可見27株利福平耐藥株均發(fā)生rpoB基因變異，基因突變率為100%（27/27），突變基因位點(diǎn)主要位于509～533位。結(jié)論：2019—2021年宜春地區(qū)結(jié)核分枝桿菌感染率呈逐年上升趨勢(shì)，結(jié)核分枝桿菌感染患者對(duì)利福平存在較高的耐藥性，且rpoB基因位點(diǎn)突變的發(fā)生與利福平耐藥間存在密切聯(lián)系。

【關(guān)鍵詞】 肺結(jié)核 結(jié)核分枝桿菌 利福平 耐藥株 基因分型

Genotype Analysis of Mycobaterium Tuberculosis Rifampicin Resistant Strain in Patients in Yichun Area from 2019 to 2021/WU Junyong， HUANG Tao， JIANG Guangrong. //Medical Innovation of China， 2024， 21（13）： -120

[Abstract] Objective： To explore the genotype of Mycobaterium tuberculosis Rifampicin resistant strain in patients in Yichun area from 2019 to 2021. Method： A total of 100 patients with pulmonary tuberculosis who received treatment in Yichun People's Hospital from January 2019 to December 2021 were selected， and all patients' sputum samples were collected for detection. The isolation and resistance of Mycobaterium tuberculosis were analyzed， and the genotype of Rifampicin resistant strain were also analyzed. Result： A total of 47 strains of Mycobaterium tuberculosis were isolated from 100 patients， and the isolation rate was 47.00%. The Mycobaterium tuberculosis isolation rates in 2019， 2020 and 2021 were 33.33%， 45.95% and 54.76%， respectively. In 2019，

7 strains of Mycobaterium tuberculosis were isolated， and the incidence of Rifampicin， Isoniazid and Streptomycin resistance were 42.86%， 28.57% and 28.57%， respectively. In 2020， 17 strains of Mycobaterium tuberculosis were isolated， and the incidence of Rifampicin， Isoniazid and Streptomycin resistance were 58.82%， 29.41% and 11.76%， respectively. In 2021， 23 strains of Mycobaterium tuberculosis were isolated， and the incidence of Rifampicin， Isoniazid and Streptomycin resistance were 60.87%， 21.74% and 17.39%， respectively. The resistance rate of Mycobaterium tuberculosis to Rifampicin was the highest. rpoB gene sequencing showed that all 27 strains of Rifampicin resistant strain had rpoB gene mutation， the mutation rate was 100% （27/27）， and the mutation loci were mainly located at 509-533 positions. Conclusion： From 2019 to 2021， the infection rate of Mycobaterium tuberculosis in Yichun area shows an increasing trend year by year， and patients with Mycobaterium tuberculosis infection have high resistance to Rifampicin， and there is a close association between the occurrence of mutations in the rpoB gene locus and Rifampicin resistance.

[Key words] Pulmonary tuberculosis Mycobaterium tuberculosis Rifampicin Resistant strain Genotyping

First-author's address： Department of Laboratory， Yichun People's Hospital， Yichun 336000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.13.027

結(jié)核分枝桿菌是導(dǎo)致結(jié)核病的重要病原菌，現(xiàn)已成為危害人類身體健康的嚴(yán)重問(wèn)題，近年來(lái)，結(jié)核分枝桿菌感染率逐年上升。大量數(shù)據(jù)顯示，每年約900萬(wàn)人發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病，約300萬(wàn)人發(fā)展為耐多藥結(jié)核病[1-2]。由此可見，給予結(jié)核分枝桿菌感染的結(jié)核病患者積極治療尤為重要。隨著抗結(jié)核藥物的不斷更新及應(yīng)用，結(jié)核病患者的用藥中極易出現(xiàn)不合理的用藥現(xiàn)象，導(dǎo)致患者無(wú)法徹底殺滅結(jié)核分枝桿菌，且長(zhǎng)時(shí)間的反復(fù)用藥也引發(fā)患者機(jī)體出現(xiàn)不同程度的耐藥，從而延長(zhǎng)了疾病病程，大大增加了患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。目前，在結(jié)核病治療中利福平為首選藥物，能夠有效縮短患者病程。但在臨床應(yīng)用中，若結(jié)核分枝桿菌發(fā)生耐藥性，采用利福平治療時(shí)獲得的臨床效果將下降，易出現(xiàn)耐多藥肺結(jié)核，進(jìn)而加重患者病情[5-6]。因此，在結(jié)核病治療的同時(shí)分析且掌握結(jié)核分枝桿菌的耐藥性尤為重要，利于治療的進(jìn)一步開展。鑒于此，本研究選擇2019年1月—2021年12月于宜春市人民醫(yī)院接受治療的肺結(jié)核患者100例，對(duì)2019—2021年宜春地區(qū)患者結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥株基因型進(jìn)行分析，為臨床診療提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月—2021年12月于本院接受治療的肺結(jié)核患者100例。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床明確診斷為肺結(jié)核；病歷資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：肥胖癥、糖尿病等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾??；妊娠期及哺乳期；病歷資料缺乏；存在白血病、嚴(yán)重貧血等血液系統(tǒng)疾?。灰呀邮芑?；精神異常，無(wú)法配合完成本次研究。男62例，女38例；年齡23～75歲，平均（49.82±3.91）歲。患者或患者家屬均知情同意本次研究。本研究獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

采集所有患者痰液樣本，對(duì)痰液樣本行生物化學(xué)反應(yīng)，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的菌種進(jìn)行鑒定。（1）主要試劑與儀器：恒溫培養(yǎng)箱選用德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)；微生物鑒定分析系統(tǒng)（美國(guó)BD公司，型號(hào)：BD Phoneix 100）。（2）耐藥性實(shí)驗(yàn)：采用比例法行藥敏試驗(yàn)，刮取新鮮菌苔時(shí)使用無(wú)菌接種環(huán)刮，將其配置成菌懸液，隨后吸取0.1 mL接種于含有藥液的培養(yǎng)基上，4周后仔細(xì)觀察培養(yǎng)結(jié)果。（3）結(jié)核分枝桿菌基因組DNA制備：自培養(yǎng)基上取菌落加入DNA裂解液中，放置于55 ℃環(huán)境下水浴3 h，隨后置于95 ℃環(huán)境下滅活5 min，加入酚-氯仿-異戊醇溶液，按照25︰24︰1的比例，抽提2次后再次加入高壓滅菌雙蒸水溶液50 μL，并將其置于20 ℃環(huán)境

中保存待檢。（4）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增檢測(cè)：上游引物序列RD105-F，GGAGTCGTTGA GGGTGTTCATCAGCCAGTCCGGT；下游引物序列RD105-R1與RD105-R2分別

如下，CGCCAAGGCCGCATAGTCACGGCG、TGCCCACTGGTCGATATGGTGGACTT。取2 μL DNA

模板，上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：94 ℃環(huán)境下變性30 s，94 ℃環(huán)境下預(yù)變性8 min，于58 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，上述共40個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸8 min。

rpoB基因PCR引物序列rpoB-F、rpoB-R分別如下：CTTGCACGAGGGTCA GACCA、ATCTCGTCGC-TAACCACGCC，取50 μL反應(yīng)體系，ddH2O 20 μL，2 μL DNA模板，上、下游引物各1 μL，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：94 ℃變性40 s，94 ℃預(yù)變性8 min，64 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸8 min。擴(kuò)增所獲得的產(chǎn)物需應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。（5）DNA測(cè)序：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由專業(yè)公司進(jìn)行測(cè)序后再行DNA基因組序列的分析。

1.3 觀察指標(biāo)

分析結(jié)核分枝桿菌分離情況及耐藥性，另分析利福平耐藥株基因型。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌分離情況

100例患者中共分離出結(jié)核分枝桿菌47株，分離率為47.00%（47/100）。2019、2020、2021年收治肺結(jié)核患者分別21、37、42例，結(jié)核分枝桿菌分離率分別為33.33%（7/21）、45.95%（17/37）、54.76%（23/42）。

2.2 藥物耐藥性分析

2019年分離出結(jié)核分枝桿菌7株，利福平、異煙肼、鏈霉素耐藥發(fā)生率分別為42.86%、28.57%、28.57%；2020年分離出結(jié)核分枝桿菌17株，利福平、異煙肼、鏈霉素耐藥發(fā)生率分別為58.82%、29.41%、11.76%；2021年分離出結(jié)核分枝桿菌23株，

利福平、異煙肼、鏈霉素耐藥發(fā)生率分別為60.87%、21.74%、17.39%。見表1。

2.3 利福平耐藥株基因型

經(jīng)rpoB基因測(cè)序可見27株均發(fā)生rpoB基因變異，基因突變率為100%（27/27），突變基因位點(diǎn)主要位于509～533位，見表2。

3 討論

結(jié)核病屬重大傳染性疾病，危險(xiǎn)性較高，隨著生存環(huán)境的改變，結(jié)核病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)患者生命安全及生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[7-8]。既往臨床采用痰培養(yǎng)的方式鑒別診斷結(jié)核分枝桿菌，但耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)法滿足臨床檢驗(yàn)需求，甚至延誤最佳治療時(shí)機(jī)[9-10]。故探討一種更為有效的檢驗(yàn)方法在結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)中具有重要作用。

研究顯示，結(jié)核分枝桿菌的菌體細(xì)胞壁外側(cè)存在一層莢膜，可有效保護(hù)菌株[11-12]。近年來(lái)，隨著結(jié)核病發(fā)病率不斷升高，結(jié)核分枝桿菌的傳播與發(fā)展，使得后期獲得性結(jié)核病耐藥率明顯上升，由此導(dǎo)致耐藥結(jié)核病發(fā)生率逐年升高，特別是多藥結(jié)核病的發(fā)生率，已嚴(yán)重威脅結(jié)核病的控制，同時(shí)在臨床治療中造成極大的困擾[13-14]。因此，如何有效的緩解及控制結(jié)核耐藥菌耐藥情況現(xiàn)已成為研究的重點(diǎn)。利福平、異煙肼及鏈霉素均為廣譜抗分枝桿菌活性的藥物，是目前治療結(jié)核分枝桿菌感染的首選。本研究結(jié)果顯示，100例患者中共分離出結(jié)核分枝桿菌47株，分離率為47.00%。2019、2020、2021年結(jié)核分枝桿菌分離率分別為33.33%、45.95%、54.76%，其中2019年分離出結(jié)核分枝桿菌7株，利福平、異煙肼、鏈霉素耐藥發(fā)生率分別為42.86%、28.57%、28.57%；2020年分離出結(jié)核分枝桿菌17株，利福平、異煙肼、鏈霉素耐藥發(fā)生率分別為58.82%、29.41%、11.76%；2021年分離出結(jié)核分枝桿菌23株，利福平、異煙肼、鏈霉素耐藥發(fā)生率分別為60.87%、21.74%、17.39%。結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平耐藥率最高，且耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)，表明2019—2021年宜春地區(qū)結(jié)核分枝桿菌感染率逐年上升，分離株對(duì)利福平存在較高的耐藥率，這可能與宜春地區(qū)結(jié)核病患者使用藥物的治療頻率等存在密切聯(lián)系。利福平為利福霉素類合成的廣譜抗生素，作為一線抗結(jié)核藥物，已在臨床上得到充分的使用[15-16]。相關(guān)研究顯示，約87%的利福平耐藥菌株同時(shí)對(duì)異煙肼也有較強(qiáng)的耐藥性，且利福平敏感性較強(qiáng)，可將其作為鑒別診斷結(jié)合分枝桿菌的重要依據(jù)[17-18]。故積極監(jiān)測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性變化對(duì)指導(dǎo)利福平使用意義重大。

為了進(jìn)一步降低臨床上利福平耐藥率，臨床加強(qiáng)了對(duì)耐藥基因的檢測(cè)。結(jié)核分枝桿菌發(fā)生耐藥的風(fēng)險(xiǎn)多在染色體上，也是在基因突變作用下而造成，又因不同藥物基因突變類型存在相應(yīng)位點(diǎn)的突變[19]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)rpoB基因測(cè)序可見27株利福平耐藥株均發(fā)生rpoB基因變異，基因突變率為100%（27/27），突變基因位點(diǎn)主要位于509～533位。分析其原因可知，發(fā)生rpoB基因突變的患者多伴有胞嘧啶向胸腺嘧啶的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致531位的絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼?，致使突變發(fā)生率大大提高[20-21]。由此可見，在結(jié)核分枝桿菌治療中，可將rpoB基因的起始端作為臨床的檢測(cè)靶標(biāo)，有助于評(píng)估利福平的耐藥性，對(duì)有效提高臨床分子檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確度及敏感度具有重要作用，同時(shí)利于提高利福平藥物使用價(jià)值。

綜上所述，2019—2021年宜春地區(qū)患者結(jié)核分枝桿菌檢出率逐年升高，且利福平耐藥率逐年上升，rpoB基因變異是導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌分離株對(duì)利福平耐藥的重要原因，在臨床干預(yù)中需予以重視。

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（收稿日期：2023-10-27） （本文編輯：陳韻）