m6A及m5C甲基化修飾通過促進細胞增殖與轉移影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展

邵爽 郭紀偉 孟瑋

濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學研究中心，濱州 256600

RNA 甲基化修飾是一種廣泛存在于各類RNA 中的修飾作用，其主要作用是通過調節(jié)mRNA 的轉錄、出核、穩(wěn)定性和翻譯效率，從而控制靶蛋白的表達［1］，其中研究最熱門的是N6-甲基腺苷（m6A）及5-甲基胞嘧啶（m5C）的修飾作用，它們可以直接作用于信號通路中的關鍵分子導致其表達上調或下調，也可以通過作用和改變與該通路相關的其他蛋白的表達水平間接調控該信號通路的活性。已有研究表明，甲基化修飾與多種人類疾病有關，影響不同類型癌癥的生長和轉移［2］。信號通路之間存在多種相互作用，m6A和m5C 修飾通過調控單個因子的表達進而在多種致癌通路中發(fā)揮關鍵作用。本綜述著重探討RNA 甲基化修飾中比較熱門的m6A 及最近興起的m5C 修飾對信號通路中關鍵分子的調控從而影響癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機制。

RNA甲基化修飾

RNA甲基化修飾是將甲基從一個活性甲基化合物轉移到另一個化合物，根據(jù)甲基化的不同部位，RNA甲基化包括m6A、m5C、N7-甲基鳥嘌呤核苷酸（m7G）、N1-甲基腺嘌呤（m1A）等［3-4］。RNA 甲基化修飾是一個可逆的動態(tài)過程，由甲基轉移酶、去甲基酶及甲基化結合蛋白等多種酶參與并介導RNA 甲基化修飾［5］，下面著重介紹比較熱門的m6A 及最近興起的m5C修飾。

1.m6A甲基化修飾及其調節(jié)因子

m6A 是以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體，將甲基轉移到腺嘌呤核苷酸的第六個N 原子上［6］。m6A 甲基化修飾是真核生物mRNA 中最豐富的甲基化修飾，富集在終止密碼子、RNA 外顯子區(qū)域和3′非翻譯區(qū)（3′UTR）中的RRACH（R=A 或G，H=A，C 或U）序列中［7-8］。m6A 有3 種類型的調節(jié)因子：其一是甲基轉移酶，研究較多的是甲基轉移酶3（METTL3），它含有SAM 結合位點，而METTL3 與METTL14 以1∶1 的含量形成異源二聚體，Wilms 瘤1-相關蛋白在甲基化酶復合物中充當支架，共同形成甲基轉移酶復合體，將甲基從SAM 轉移到受體腺嘌呤上［9］；其二是去甲基化酶，它使RNA 甲基化修飾動態(tài)可逆成為可能，是RNA去甲基化過程中的調節(jié)蛋白，其中研究較多的是肥胖相關蛋白（FTO）和alkB 同源蛋白5（ALKBH5），F(xiàn)TO C-端的莖環(huán)結構域和ALKBH5 N-端的卷曲螺旋結構域通過與甲基化的RNA 底物相互作用而行使去甲基化活性［10-11］，進而影響mRNA 的核輸出和RNA 的代謝［12-13］；其三是甲基化結合蛋白，它與甲基化的RNA 結合并發(fā)揮相應的功能。其中研究較多的是同源域（YTH）結構域家族，即含有YTH 結構域的蛋白YTHDF1/2/3和YTHDC1/2，其中YTHDC1分布在細胞核中，而YTHDF1/2/3 和YTHDC2 則主要分布在細胞質中。YTHDF1可識別終止密碼子周圍的m6A修飾，促進mRNA翻譯，而YTHDF2識別不進行翻譯的mRNA，加速其降解［14-15］。

2.m5C甲基化修飾及其調節(jié)因子

m5C 是另一種豐富的RNA 甲基化修飾類型，由m5C 甲基轉移酶催化，將甲基從SAM 上轉移到RNA 序列中胞嘧啶堿基的第五個C 原子上。m5C 修飾廣泛分布于各種RNA中，包括mRNA、rRNA、tRNA、ncRNA、vault RNA 等，從而參與mRNA的核輸出、RNA的穩(wěn)定性和翻譯［16］。m5C也有3種類型的調節(jié)因子：m5C 甲基化酶包括NOL1/NOP2/SUN 結構域（NSUNs）蛋白質家族和DNA甲基轉移酶（DNMTs）家族成員，其中NSUN2 是一種核仁RNA 甲基轉移酶，且是催化m5C 形成最主要的RNA 甲基轉移酶［17］。NSUN2 在細胞分化、增殖、遷移以及調控腫瘤發(fā)生和發(fā)展等多種生物學功能中起著非常重要的作用［18］；m5C 去甲基化酶包括TET 家族（TET1-3）和ALKBH1，TET 家族催化去甲基化從而生成5-羥甲基胞嘧啶（hm5C），ALKBH1主要參與tRNA 的去甲基化修飾生成hm5C 后再進一步氧化生成5-胞嘧啶甲酰（f5C）［19］；m5C 甲基化結合蛋白主要包括Aly/REF 輸出因子（ALYREF）和Y-盒結合蛋白-1（YBX1）。ALYREF 是TREX復合物的關鍵組分之一，它結合的mRNA 位點大多位于緊靠翻譯起始位點附近富含CG 堿基的結構域，并通過K171位的賴氨酸識別mRNA上的m5C所修飾的位點并促進其出核。YBX1 則通過其CDS 的W65 位吲哚環(huán)識別m5C 修飾的mRNA來維持其穩(wěn)定性，進而影響靶基因的表達［20］。

與m6A、m5C相關的熱門致癌信號通路

1.哺乳動物不育系20 樣激酶（MST）-Yes 關聯(lián)蛋白（YAP）通路

哺乳動物中的MST-YAP信號通路最初是在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)的，該通路在進化上高度保守，其核心反應是一個激酶級聯(lián)反應，可調節(jié)細胞的增殖和分化，參與器官再生和組織修復等，因此其功能一旦失調將導致癌癥的發(fā)生和發(fā)展［21］。其中Ste20-like 激酶1/2 與它們的輔助因子Salvador 同源物1結合，磷酸化并激活大腫瘤抑制激酶1/2（LATS1/2），LATS1/2 與其輔助因子MOB 激酶激活因子1A 和1B 使YAP/含PDZ結合基序的轉錄共激活因子（TAZ）磷酸化并失活，使其駐留在細胞質中并降解，可抑制其核轉位從而失去輔轉錄因子的活性［22］。當YAP/TAZ 未被磷酸化，它們則會進入細胞核并與TEA 結構域轉錄因子家族轉錄因子結合，進而調控下游靶基因的表達。因此，MST-YAP 信號通路通過調節(jié)YAP的磷酸化及核定位，進而影響整個信號通路的活性，從而調控細胞的生物學功能。在過去的十年中，由于該通路在發(fā)育、再生和癌癥中發(fā)揮了關鍵的調控作用，這一領域得到了廣泛的研究。在癌癥中，已經(jīng)表明YAP/TAZ 在腫瘤中的表達異常，促進了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，被認為是人類實體癌的癌基因，因此MST-YAP 信號通路途徑可能成為癌癥治療的新靶點［23］。

2.磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-PKB/蛋白激酶B（Akt）通路

PI3K-Akt 通路在細胞代謝、生長、增殖、凋亡和血管生成等基本細胞活動和癌癥的發(fā)生及發(fā)展中起著至關重要的作用［24］。PI3K具有磷脂酰肌醇激酶活性和絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，其根據(jù)不同結構和底物可以分為三類，即Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類。其中研究最廣泛的是Ⅰ類，是由催化亞基P110 和調節(jié)亞基P85 共同組成的異源二聚體，在腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［25］。Akt具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，其作為PI3K-Akt 通路的核心分子可以通過抑制叉頭狀轉錄因子O 及糖原合成酶激酶3（GSK3）-谷氨酰胺合成酶活性分別調控細胞的凋亡及影響糖原的合成，還可通過激活ATP檸檬酸裂解酶及內皮型一氧化氮合酶分別促進脂肪酸的合成及維持血管的功能。但Akt 的過度激活導致癌癥的產(chǎn)生，如逃避凋亡、過度生長、侵襲和轉移［26］。當細胞中的配體和受體結合，激活細胞內的PI3K，接下來PI3K 促使磷脂酰肌醇4，5二磷酸磷酸化轉變?yōu)?、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），PIP3 進入細胞后增強Akt 的磷酸化，使Akt 部分或完全激活，從而進入細胞核，調控下游靶基因的表達。作為PIP3 活性的抑制基因（同源性磷酸酶-張力蛋白、蛋白磷酸酶2A、亮氨酸豐富重復蛋白質磷酸酶蛋白），當其表達水平升高時，PI3P 去磷酸化通過抑制PI3K/Akt 信號通路傳導進而抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡［27］。

3.Wnt/β-catenin信號通路

經(jīng)典的Wnt 信號通路是一個復雜的信號通路，其決定生物體內多種細胞命運并調控細胞的增殖和分化等重要生物學過程。此途徑主要包括四個片段：胞外信號、膜段、胞質段和核段。胞外信號指Wnt 配體蛋白，細胞膜段主要包含Wnt 受體卷曲蛋白（FZD）和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（LRP5/6），細胞質部分主要包括β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、蓬亂蛋白和破壞復合物（DC），該DC 由軸蛋白（Axin）、酪蛋白激酶1α、腺瘤性結腸息肉病蛋白和GSK-3β組成，核段主要包括轉位到細胞核的β-catenin、T 細胞特異性因子（TCF）/淋巴增強子結合蛋白家族成員以及β-catenin下游靶基因等［28］。在Wnt 配體缺失的情況下，β-catenin 與DC 結合，結合后的β-catenin 被磷酸化進而被降解［29］。經(jīng)典的Wnt 信號通路核心作用方式與β-catenin 的穩(wěn)定性密切相關，當β-catenin 水平低下時，Wnt 信號通路被抑制；β-catenin 水平較高時，Wnt 信號通路被激活。Wnt 信號通路激活時，促進細胞的異常增生分化，從而導致腫瘤的進展［30］。當Wnt 配體與膜上的FZD 及LRP5/6 受體結合時，Axin-GSK3β 蛋白復合物也被募集到細胞膜，Axin不再發(fā)揮作用，β-catenin在細胞胞質內逐漸累積從而進入細胞核，將Groucho 蛋白替換，并與TCF 結合調控下游靶基因的表達［31］。

4.絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路

MAPK 信號通路是一系列高度保守的酶促級聯(lián)反應，參與細胞的生存、增殖、凋亡、分化和癌癥在內的多種生物學活動。信號通路包括3種主要的激酶，即MAPK激酶的激酶、MAPK 激酶和MAPK，它們依次被磷酸化后激活并調控下游靶分子的磷酸化［32］。MAPK通路有4條經(jīng)典的分支，分別是細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2、c-Jun 氨基末端激酶、細胞外信號調節(jié)激酶5 和p38 MAPK。其中ERK/MAPK 信號通路是研究最詳盡的MAPK 信號通路，與細胞增殖和分化密切相關并在細胞信號轉導網(wǎng)絡中起著重要作用［33］。當細胞外配體與質膜上的特定細胞表面受體結合時，該信號通路被激活，產(chǎn)生生長因子受體結合蛋白2（GRB2）的結合位點，招募SOS 蛋白到膜上并與之結合，SOS 將GDP 結合的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Ras）活化為Ras 相關GTP 酶（Ras-GTP）。Ras-GTP能將蘇氨酸蛋白激酶（Raf）蛋白招募到細胞膜上并在一系列復雜的過程中被活化，活化的Raf激酶接著與下游的絲裂原活化的細胞外信號調節(jié)激酶（MEK）1/2 結合并使其磷酸化，導致下游信號傳導的ERK1/2 被磷酸化，活化的ERK1/2將繼續(xù)磷酸化髓細胞組織增生原癌基因、特異性蛋白 1、轉錄激活因子ETS樣蛋白1和E26轉錄因子等，進而調控與細胞增殖及細胞周期有關的基因表達［34］。在MAPK信號通路中，Ras、Raf、MEK1/2和ERK1/2中的任何一個因子功能異常都會導致嚴重的腫瘤疾病。

m6A及m5C修飾通過影響與細胞增殖和轉移有關的信號通路調控癌癥發(fā)生和發(fā)展

根據(jù)國家癌癥中心最新數(shù)據(jù)顯示，中國當前主要惡性腫瘤中死亡率前5 包括肺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、食管癌［35］。以下著重介紹m6A 及m5C 修飾通過影響與細胞增殖和轉移有關的信號通路調控上述癌癥發(fā)生和發(fā)展。

1.肺癌

在Hippo-YAP 信號通路中，去甲基化酶ALKBH5 通過減少YAP m6A 甲基化修飾來抑制非小細胞肺癌（NSCLC）的增殖、侵襲和轉移，通過YTHDF2識別并促進YAP mRNA 降解及抑制微小RNA-107/大腫瘤抑制激酶2 介導的YAP 活性來抑制腫瘤的生長和轉移［36］。m6A 甲基化酶METTL3 通過與真核生物翻譯起始因子3H相互作用促進Hippo通路效應因子TAZ 的翻譯，從而增加肺腺癌（LUAD）細胞的生長、生存和侵襲能力［37］。在m5C 甲基化酶NSUN2和m5C 甲基化結合蛋白ALYREF 的促進下，YAP 3′UTR 被m5C 修飾，這種修飾增加了YAP mRNA 的穩(wěn)定性，并抑制了附近的m6A 修飾和miR-582-3p結合，進而促進LUAD的發(fā)生發(fā)展［38］。

2.肝癌

在肝母細胞瘤（HB）中，微小RNA-186（miR-186）可直接結合m6A甲基化酶METTL3 mRNA的3′UTR降低其表達，miR-186/METTL3 軸可以調控Wnt/β-catenin 信號通路，miR-186 的表達下調導致METTL3 過表達促進HB 細胞增殖、遷移和侵襲。在HB細胞中發(fā)現(xiàn)METTL3和編碼β-連環(huán)蛋白的鈣黏蛋白相關蛋白（CTNNB1）基因存在顯著正相關，METTL3 可以通過增加Wnt/β-catenin 通路中CTNNB1 基因的m6A 水平，YTHDF2 識別CTNNB1 中5′UTR m6A 修飾，從而促進HB 細胞的增殖、遷移、侵襲以及術后復發(fā)［39-40］。在肝細胞癌（HCC）中，含有RAD52基序的蛋白 1（RDM1）具有腫瘤抑制因子的功能，RDM1 在p53 存在下抑制Ras/Raf/ERK 信號轉導。m6A 甲基化酶METTL3 使RDM1 mRNA 的m6A 甲基化修飾增加并抑制其表達，從而促進HCC 的發(fā)展［41］。 m6A 甲基化結合蛋白YTHDF1 可通過影響AKT2 和AKT3 的翻譯進而影響PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路，促進HCC 細胞的遷移，也可以誘導上皮間質轉化促進HCC細胞的侵襲［42］。

3.胃癌

m6A修飾在胃癌中起到抑制腫瘤的作用，即過表達m6A甲基化酶METTL14 或者敲低m6A 去甲基化酶FTO 會通過抑制Wnt 和PI3K-Akt 信號傳導進而抑制胃癌細胞增殖及侵襲［43］。m6A 甲基化結合蛋白YTHDF1 可以通過增強FZD7 的翻譯，使Wnt/β-catenin 通路過度激活促進胃癌發(fā)生，YTHDF1 與胃癌的發(fā)生和進展呈正相關，m6A 依賴性YTHDF1-FZD1-β-catenin 軸在胃癌發(fā)展中起著至關重要的作用［44］。胃癌中同源盒蛋白B13（HOXB13）和FTO 的表達升高，F(xiàn)TO 可抑制下游靶基因HOXB13 的甲基化，通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路，促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲［45］。m6A 甲基化酶METTL3 在胃癌中的過表達增加了腫瘤抑制基因素金屬蛋白酶9（ADAMTS9）的m6A 修飾，使ADAMTS9 的表達降低通過調節(jié)PI3K/AKT/mTOR 通路促進胃癌中的血管生成和癌變［46］。

4.結直腸癌

m6A 甲基化結合蛋白YTHDF1 通過增強FZD9 和Wnt6 翻譯效率，導致Wnt/β-catenin 信號通路過度激活，促進結直腸癌的發(fā)生，YTHDF1 與結直腸癌的發(fā)生和進展呈正相關［47］。m6A 甲基化酶METTL3 在結直腸癌調控中具有雙重作用，降低METTL3 通過調節(jié)p38/ERK 通路促進結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲［48］。然而過表達METTL3 也可以促進結直腸癌轉移，METTL3 介導miR-1246 甲基化修飾抑制抗癌基因SPRED2 的表達進一步使Raf/MEK/ERK 通路失活，促進癌細胞遷移和侵襲，METTL3/miR-1246/SPRED2軸在腫瘤轉移中起重要作用［49］。

5.食管癌

有研究發(fā)現(xiàn)，m5C 甲基化酶NSUN2 介導的m5C 甲基化修飾通過調控PI3K/AKT 和ERK/MAPK 通路中的GRB2 從而促進食管鱗狀細胞癌（ESCC）的發(fā)生和進展；其作用機制為E2F1轉錄因子上調NSUN2的表達進而增加GRB2的m5C甲基化水平，m5C甲基化結合蛋白內膜組織Lin-28同系物B與帶有m5C修飾的GRB2結合進而增加GRB2的穩(wěn)定性，GRB2水平增加激活PI3K/AKT 和ERK/MAPK 信號通路，促進ESCC進程［50］。

展 望

綜上所述，本文闡述了部分m6A 甲基化修飾通過影響與細胞增殖和轉移有關的信號通路調控癌癥的發(fā)生發(fā)展。目前，在開發(fā)m6A 靶向治療方面的研究主要集中在m6A 修飾酶的靶向性，以m6A 為靶點的治療已逐漸被應用于腫瘤等疾病的臨床治療中。最近，m5C 甲基化在腫瘤方面的研究引起了越來越多關注但相關通路與m5C 修飾之間的關系目前報道相對較少［51］。m5C 與m6A 修飾的研究思路基本相同，而相比m6A，m5C的一些甲基轉移酶、去甲基酶和甲基化結合蛋白等組分鑒定出的種類較少，因此RNA 甲基化修飾目前還具備非常大的潛在研究價值。

作者貢獻聲明邵爽：起草文章；郭紀偉：對文章的知識性內容作批評性審閱；孟瑋：支持性貢獻