菜心VIGS沉默植株構(gòu)建的教學(xué)實驗

鐘珉 覃鴻毅 柴喜榮 楊暹 康云艷

摘要 普通分子生物學(xué)實驗具有實踐性和操作性強等特點，病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)（VIGS）是操作簡單、實踐性和操作性強的前沿生物學(xué)技術(shù)。本研究在菜心VIGS沉默植株構(gòu)建的教學(xué)實驗中，以種子真空侵染方法為基礎(chǔ)，通過優(yōu)化侵染濃度、侵染時間和共培養(yǎng)時間，得到了操作簡單，侵染效率和植株成活率高，白化表型明顯的侵染體系。通過實驗教學(xué)可知，菌液OD600為0.80，侵染時間5 min，培養(yǎng)15 h的侵染效率最高，BcPDS基因的表達(dá)受到抑制，侵染優(yōu)化后的菜心VIGS體系穩(wěn)定且高效。該教學(xué)實驗的構(gòu)建使學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣得到了明顯提高，培養(yǎng)了學(xué)生創(chuàng)新思維能力和獨立工作能力，鍛煉了學(xué)生的動手能力，并具備一定的創(chuàng)新和科研能力。

關(guān)鍵詞 菜心；病毒誘導(dǎo)的基因沉默；技術(shù)改良；實驗教學(xué)；創(chuàng)新能力

中圖分類號 S63；G642.0? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 1007-7731（2024）10-0102-05

病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)（VIGS）使病毒攜帶目的互補脫氧核糖核酸（cDNA），然后用其侵染植物，與植物自身RNA配對成為雜合雙鏈RNA（Double strand RNA，dsRNA），錯誤的dsRNA被切割形成小干擾RNA，再經(jīng)過一系列過程形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，最終降解靶基因RNA序列，沉默目的基因[1]。早期研究多圍繞本氏煙草、番茄等作物的RNA病毒進行研究，以煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）作為侵染載體，使其攜帶目標(biāo)基因八氫番茄紅素脫氫酶（Phytoene desaturase，PDS）cDNA反義鏈，煙草葉片被侵染后出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象。此后，科研人員根據(jù)植物病毒特性開發(fā)出越來越多的新病毒，誘導(dǎo)得到基因沉默載體，在諸多植物基因功能研究中發(fā)揮著重要作用[2-3]。此外，植物類胡蘿卜素合成中的關(guān)鍵酶PDS表達(dá)受到抑制易導(dǎo)致植物光保護作用缺失，出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，葉片白化，表型與對照有明顯差異?；诖?，常選擇PDS沉默作為參照，研究侵染效率。因此，VIGS是基于植物對RNA病毒的防御機制，可抑制目標(biāo)基因表達(dá)，用以表征植物基因功能的轉(zhuǎn)錄技術(shù)[4-6]。由于VIGS技術(shù)具有容易操作、周期短、低成本、不需要遺傳轉(zhuǎn)化和耗材成本低等優(yōu)點，被廣泛用于植物基因功能研究中[7-9]。與小白菜、擬南芥等其他十字花科作物相比，菜心的基因鑒定、功能分析等研究進展速度較慢。因此，快速構(gòu)建菜心基因功能高效鑒定體系十分重要。對常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化進行基因功能驗證須至F2或者F3代后才能開展，VIGS研究基因功能周期較短，侵染番茄或煙草后約20 d可觀察到明顯的白化表型。在菜心種子侵染VIGS體系中，14 d可觀察到白化表型并進行功能驗證。同時，由于菜心遺傳轉(zhuǎn)化體系不成熟，轉(zhuǎn)化效率低，轉(zhuǎn)化存在一定困難。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究生培養(yǎng)方案的調(diào)整，研究生選修課程高級蔬菜栽培學(xué)開設(shè)了相關(guān)實驗課程，菜心VIGS沉默植株的構(gòu)建是實驗內(nèi)容之一。菜心屬于華南地區(qū)特色蔬菜，種子發(fā)芽后，采取傳統(tǒng)的子葉注射法創(chuàng)制沉默植株，易出現(xiàn)注射手法不熟練或注射時間難以控制等問題，可能使子葉脫落，幼苗死亡，無法獲得沉默植株[7-11]。

本研究在實驗課程中引入農(nóng)桿菌真空滲透法，優(yōu)化侵染濃度、侵染時間和共培養(yǎng)時間等實驗參數(shù)，形成規(guī)范的操作流程，整理成操作手冊，改善實驗操作結(jié)果，提高教學(xué)成果。目的在于調(diào)動學(xué)生參與具體實驗的積極性，促使學(xué)生理解并掌握VIGS技術(shù)原理和方法，加深學(xué)生對理論知識的理解，提高其實驗操作技能，為其利用VIGS技術(shù)開展基因功能驗證奠定基礎(chǔ)，培養(yǎng)和提升其科研能力和實踐能力。通過完整的實驗教學(xué)，讓學(xué)生充分參與實驗過程，提高操作技能，充分培養(yǎng)學(xué)生獨立工作和創(chuàng)新思維能力。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為“油青四九”菜心植株發(fā)芽的種子。試劑配方主要包括大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌GV3101、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA提取試劑盒、pTRV1質(zhì)粒、pTRV2-BcPDS質(zhì)粒、瓊脂糖、卡那霉素、氨芐青霉素、利福平、農(nóng)桿菌侵染緩沖液和LB培養(yǎng)基等。農(nóng)桿菌侵染緩沖液成分為10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸（MES）、10 mmol/L氯化鎂（MgCl2）和200 μmol/L乙酰丁香酮（AS）。實驗儀器有電子天平、搖床、移液槍、離心機、PCR儀器、培養(yǎng)箱和超凈工作臺等。

1.2 VIGS沉默植株教學(xué)方案構(gòu)建

1.2.1 實驗原理? VIGS利用攜帶目的基因片段的病毒侵染植物后，隨著病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄而特異性的誘導(dǎo)序列同源基因mRNA降解，從而引起植物內(nèi)源基因沉默、表型或生理指標(biāo)變化。

1.2.2 實驗方法? （1）菜心植株總RNA和cDNA的提取。按照RNA提取試劑盒操作步驟提取總RNA。依據(jù)HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Vazyme）試劑盒操作步驟進行反轉(zhuǎn)錄操作獲得cDNA。提取菜心總RNA時，要嚴(yán)格按照操作手冊進行，應(yīng)注意于低溫環(huán)境下迅速研磨，防止樣品中RNA降解；選擇種子活力較好的菜心種子；農(nóng)桿菌OD600值為0.80左右；現(xiàn)配現(xiàn)用侵染緩沖液；及時更換注射器和手套，防止交叉污染。

（2）pTRV2-BcPDS載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。根據(jù)菜心BcPDS的全長cDNA序列，用引物設(shè)計軟件設(shè)計特異性引物（F：GCAAAATACAGGTCATGTAT；R：CTATCTCCAGACAATGAAGAGA）。PCR擴增得到249 bp大小的PDS基因片段，將上述基因片段重組連接到pTRV2載體上，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，提取質(zhì)粒。然后將測序正確的重組質(zhì)粒（pTRV2-BcPDS）通過電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101細(xì)胞中。

（3）農(nóng)桿菌侵染。取菜心種子50粒，用有效氯1%的次氯酸鈉消毒液對種子消毒后，置于帶有干凈濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽；將得到的pTRV1和pTRV2單克隆培養(yǎng)液以1∶1比例混合，pTRV1與pTRV2-BcPDS單克隆培養(yǎng)液以1∶1比例混合，分別按照1∶100比例轉(zhuǎn)接到相同的LB培養(yǎng)基上，在三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌菌液，至OD600值在0.04～1.20范圍內(nèi)，并調(diào)整至兩個三角瓶菌液OD600值相同。將等量的發(fā)芽菜心分別放入藍(lán)口瓶中，在對照組中加入5 mL含pTRV1和pTRV2的轉(zhuǎn)化菌液，處理組中加入5 mL含pTRV1和pTRV2-BcPDS的轉(zhuǎn)化菌液，使種子完全浸泡在轉(zhuǎn)化菌液中；用真空泵對藍(lán)口瓶抽真空，每次抽60 s，每次間隔2 min，操作3次；最后在28 ℃下暗培養(yǎng)24 h。觀察侵染濃度對白化表型率和成活率的影響，確定最佳侵染濃度，觀察侵染時間對白化表型率的影響，確定最佳侵染時間。培養(yǎng)結(jié)束后，移栽至土壤中繼續(xù)生長14 d后觀察表型，提取RNA，使用熒光定量方法檢測沉默菜心中BcPDS基因的表達(dá)情況。具體技術(shù)路線如圖1所示。

1.3 實驗教學(xué)效果評價

從菜心育苗、PCR擴增、載體構(gòu)建、酶切、質(zhì)粒提取和轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌制備和侵染等整個實驗流程來評價實驗教學(xué)效果，綜合評價學(xué)生學(xué)習(xí)效果。

2 結(jié)果與分析

VIGS技術(shù)常被用于煙草、番茄、辣椒、玉米、矮牽牛和草莓等作物的基因功能驗證。實踐中，在菜心中采用常規(guī)方法進行基因功能驗證易導(dǎo)致幼苗死亡、不穩(wěn)定以及難以獲得沉默植株等。本研究根據(jù)多年實驗教學(xué)經(jīng)驗，采用真空滲透法進行VIGS沉默基因，對主要實驗步驟進行優(yōu)化。OD600指溶液在600 nm波長處的吸光值，吸光值正比于溶液中吸光物質(zhì)的濃度，因此，本研究以O(shè)D600具體值表征菌液侵染濃度。

2.1 侵染濃度對白化表型率和成活率的影響

合適的農(nóng)桿菌侵染濃度是獲得沉默植株的基礎(chǔ)，農(nóng)桿菌侵染濃度會影響侵染后菜心的白化表型率和存活率，濃度過高或過低都會直接影響侵染效果。因此，本實驗選取OD600值0.05～1.60作為侵染濃度變化范圍進行篩選。結(jié)果表明，OD600為0.40或0.80時，菜心植株存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；OD600為0.80時，侵染后菜心植株的白化表型率高于OD600濃度為0.40時的侵染結(jié)果；OD600為0.80或1.20時，植株白化表型率在0.60%左右，OD600達(dá)到1.60時，侵染后的植株存活率明顯降低（圖2）。因此，菌液OD600 為0.80時為最佳的侵染濃度。

2.2 侵染時間對白化表型率的影響

為確定侵染時間對轉(zhuǎn)化效率的影響，分析OD600為0.80條件下，不同侵染時間對白化表型率的影響。由實驗可知，當(dāng)侵染5 min時白化表型率最高，為0.57%（圖3）。因此，最佳侵染時間為5 min。

2.3 共培養(yǎng)時間對白化表型率和存活率的影響

在OD600為0.80，侵染5 min時，將共培養(yǎng)時間分別設(shè)置為0、5、10、15、20和25 h。分析發(fā)現(xiàn)，白化表型率隨著共培養(yǎng)時間增加呈降低的整體趨勢，共培養(yǎng)15 h時存活率最高，達(dá)到0.32%（圖4）。

2.4 侵染對BcPDS基因表達(dá)量的影響分析

在染菌種為GV3101，侵染菌液OD600為0.80，侵染5 min，共培養(yǎng)15 h的條件下，提取樣品RNA進行實時定量PCR檢測。檢測發(fā)現(xiàn)，與侵染后培養(yǎng)0 d相比，培養(yǎng)7 d后葉和根中的BcPDS基因表達(dá)量大幅下降（圖5）。

2.5 表型觀察

侵染后培養(yǎng)約8 d，侵染pTRV2-BcPDS的菜心植株上位葉片出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象。白化首先出現(xiàn)在新葉處，呈現(xiàn)白色斑點狀，然后從新葉向老葉擴散，部分葉片和植株14 d后幾乎完全白化。侵染pTRV2-BcPDS的菜心植株15 d后葉片大面積白化，但侵染TRV：00的菜心植株沒有出現(xiàn)明顯變化（圖6），表明BcPDS基因的表達(dá)受到抑制，被成功沉默，實驗體系成熟高效。

2.6 實驗教學(xué)效果分析

相較于其他實驗，VIGS實驗全流程具有明顯的探究性、設(shè)計性和綜合性的特征，具有連續(xù)性和系統(tǒng)性，是一個完整的實驗和科研過程。在教學(xué)過程中，學(xué)生能夠積極主動地參與到實驗的各個步驟中，從菜心育苗直至侵染等環(huán)節(jié)，學(xué)生成為實驗的主導(dǎo)者，能夠認(rèn)真主動地完成各個實驗。此外，VIGS實驗各個步驟之間緊密相扣，相輔相成，前面的實驗成功與否直接影響后續(xù)實驗的成敗，能夠幫助學(xué)生構(gòu)建完整的實驗體系。另外，當(dāng)發(fā)現(xiàn)沉默植株出現(xiàn)白化現(xiàn)象，學(xué)生會感到非常自豪、激動和興奮，更加覺得實驗有趣、科學(xué)和神奇，這種完成實驗的成就感較強，充分調(diào)動了學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性和興趣?？偟膩碚f，學(xué)生可從該實驗中得到了多方面的鍛煉，視野和思路得到了擴展，理論知識也得到了進一步豐富。

2.7 實驗注意事項

提取菜心RNA時要低溫快速操作，防止RNA降解；挑選菜心幼苗要注意在合適的苗齡（10～15 d的幼苗）注射農(nóng)桿菌懸浮液；調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌懸浮液到合適的濃度，不易過高或過低；侵染緩沖液要現(xiàn)配現(xiàn)用，4 ℃保存，增加農(nóng)桿菌的滲透性；要避免交叉污染，及時更換注射器和一次性手套等實驗耗材。

3 結(jié)論與討論

VIGS技術(shù)具有簡單高效等優(yōu)點，十分適用于基因功能研究。近年來，研究人員利用BSMV載體進行小白菜基因沉默，建立了高效沉默玉米基因的VIGS體系等，為單子葉、雙子葉等植物基因功能研究提供了高效且多樣化的途徑。TRV病毒株系具有感染癥狀輕且沉默效率高等優(yōu)點，是目前應(yīng)用較為廣泛的VIGS載體。部分生物學(xué)課程在實驗教學(xué)中開展了少量的VIGS實驗[11]，而VIGS實驗在園藝方向上的研究生培養(yǎng)及實驗教學(xué)中有待進一步增加。因此，本研究利用菜心種子，以TRV為載體，從VIGS侵染因素入手，構(gòu)建易操作的菜心種子VIGS體系，對遺傳轉(zhuǎn)化難、轉(zhuǎn)化時間久的菜心進行基因功能研究，對菜心種子VIGS體系的相關(guān)參數(shù)進行優(yōu)化。實驗表明，菌液OD600為0.80，侵染5 min，共培養(yǎng)15 h時侵染效率最高，BcPDS基因的表達(dá)受到抑制，侵染優(yōu)化后的菜心VIGS體系穩(wěn)定且高效。利用該體系能夠?qū)Σ诵暮蜻x基因功能進行快速初步驗證，為基因功能分析和菜心育種奠定基礎(chǔ)，也能讓學(xué)生進一步掌握基礎(chǔ)分子生物學(xué)實驗操作，加深其對利用分子生物學(xué)實驗技術(shù)解決生物學(xué)問題的理解。

將該實驗引入實驗教學(xué)中，能幫助剛進入研究生階段深造的學(xué)生理解和掌握分子生物學(xué)的一些基本原理、分子實驗操作流程和操作注意事項。新方法可以幫助學(xué)生更好地理解PCR擴增、載體構(gòu)建、酶切、質(zhì)粒提取和轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌制備和侵染等一系列基礎(chǔ)分子實驗。此外，VIGS實驗與其他傳統(tǒng)小實驗相比，具有較高的探究性、設(shè)計性和綜合性，是一個連續(xù)、系統(tǒng)的操作過程，能夠鍛煉學(xué)生綜合素質(zhì)，拓寬其學(xué)習(xí)思路。

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（責(zé)編：張 蓓）