我國食品中動物源性成分檢測標(biāo)準(zhǔn)研究進展

王恩輝 張志然

摘 要：肉類食品摻假是影響我國食品質(zhì)量安全的一個主要問題，其不僅損害消費者的身體健康，也沖擊著消費市場的穩(wěn)定秩序，因此動物源性成分檢測具有十分重要的意義。目前我國常見的動物源性成分檢測標(biāo)準(zhǔn)分為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)、基于蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測標(biāo)準(zhǔn)，以及基于基因（核酸）組學(xué)的檢測標(biāo)準(zhǔn)。本文系統(tǒng)梳理了不同類別動物源性成分檢測標(biāo)準(zhǔn)的特性，以期為檢測機構(gòu)和食品安全監(jiān)管部門在方法選用與政策制定等方面提供理論支持。

關(guān)鍵詞： 食品，動物源性，成分檢測，標(biāo)準(zhǔn)

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.05.034

0 引 言

肉類食品摻假是影響我國食品質(zhì)量安全的一個主要問題[1]。常見的摻假方式是將貂肉、狐貍?cè)夂网喨獾攘畠r肉混合，輔以淀粉、黃油、香精和羊（牛）油等添加物，制成高價的假“羊（牛）肉卷”“肉丸”以及“原切烤肉”食材[2-4]。肉類摻假帶給消費者的危害主要是非肉食飼養(yǎng)動物如貂和狐貍體內(nèi)包含多種病毒，未經(jīng)檢驗檢疫可能傳播各種疾病并易引發(fā)過敏性癥狀，同時輔料中的香精以及羊（牛）油成分可能會導(dǎo)致人體味覺下降、消化不良，嚴(yán)重時造成肝功能受損；其次具有保健功能的食材如“阿膠”，常以馬（牛）皮代替驢皮熬制，使產(chǎn)品營養(yǎng)價值降低的同時喪失其應(yīng)有的功效[5]；此外，清真食品中含有豬源性成分以及用普通動物冒充野生動物等摻假問題也在一定程度上影響著消費市場秩序[6-7]。因此，動物源性成分檢測對于維護食品質(zhì)量安全和消費市場穩(wěn)定具有重要意義。目前我國常見的動物源性成分檢測標(biāo)準(zhǔn)可分為：傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)、基于蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測標(biāo)準(zhǔn)，以及基于基因（核酸）組學(xué)的檢測標(biāo)準(zhǔn)[8]。本文梳理了不同類別動物源性成分檢測標(biāo)準(zhǔn)的特性，以期為檢測機構(gòu)和食品安全監(jiān)管部門在方法選用和政策制定等方面提供理論支持。

1 傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)檢測方法

傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)檢測方法是利用顯微鏡將待測組分進行多倍放大，通過觀察不同動物標(biāo)志性的組織結(jié)構(gòu)特征和細(xì)胞遺傳學(xué)特性來進行動物源性的判斷，例如魚類具有特殊形狀的溝紋和腔體，能和禽、畜類動物進行較好的區(qū)別[9]。目前顯微檢測方法能夠檢測肉粉、骨粉、血粉的動物源性大類，但不能對其進行定性分析，且結(jié)果隨檢測人的主觀性有較大差異[10]。因此國內(nèi)主要用該方法檢測飼料中的動物源性成分（NY/T 3002—2016《飼料中動物源性成分檢測 顯微鏡法》）[11]，并未過多地用于食品中動物源性成分檢測。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測方法

目前食品中蛋白質(zhì)組學(xué)方法是利用雙向電泳方式達(dá)到源性成分檢測的目的。該方法原理是基于蛋白質(zhì)電荷和分子量特異性分離蛋白質(zhì)，首先根據(jù)蛋白質(zhì)的固有電荷，通過等電聚焦進行水平方向的分離，然后根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行垂直方向的分離。水平分離反映了電荷或等電點的差異，垂直分離反映了分子量的差異，因此待測樣品中的蛋白質(zhì)組成會在兩個方向上擴散排列達(dá)到分離多種動物源性蛋白質(zhì)的目的。目前國內(nèi)采用該方法的標(biāo)準(zhǔn)為SN/T 3033—2018《出口燕窩的分子生物學(xué)真?zhèn)舞b別方法 實時熒光PCR法和雙向電泳法》[12]。該方法利用蛋白質(zhì)純化試劑盒對燕窩樣品進行蛋白質(zhì)的提取、除鹽與純化工作，然后利用雙向蛋白質(zhì)電泳技術(shù)進行蛋白質(zhì)分離，分離后對凝膠進行染色后在凝膠成像儀下進行觀察，當(dāng)分離后的電泳譜圖，其水平方向等電點位于pH4.7～5.9的等位中間及偏酸性端，垂直方向分子量集中于30～50 KD時，若蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出同分異構(gòu)特征，即分子量相同而等電點有差異的一串蛋白質(zhì)點，則判斷樣品中檢測出燕窩蛋白質(zhì)[12]。該方法優(yōu)點在于分辨率較高，不易受環(huán)境中氣溶膠影響，假陽性較少，在數(shù)據(jù)庫足夠的情況下可分離多種動物源性蛋白，后期可結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)，進行大批量的動物源性成分鑒定。缺點在于對分子量質(zhì)量極大（大于200 kD）和難溶性蛋白的分離較難，導(dǎo)致得到清晰的電泳譜圖結(jié)果較難，對相關(guān)實驗人員的操作要求較為嚴(yán)格。

3 基因（核酸）組學(xué)的檢測方法

3.1 普通PCR結(jié)合測序方法

PCR聚合酶聯(lián)式反應(yīng)是利用特異性引物與待擴增DNA的模板來模擬DNA的天然復(fù)制過程，經(jīng)由DNA模板變性、模板DNA與特異性引物的退火后復(fù)，以及DNA序列延伸三個過程的循環(huán)往復(fù)，實現(xiàn)待測DNA組分濃度的對數(shù)復(fù)制增長。PCR擴增后，將達(dá)到一定濃度和純度的DNA樣品經(jīng)由凝膠電泳分離，然后對符合待測動物DNA片段分子量要求的凝膠區(qū)域進行切割后，將其中的DNA序列進行測定，測定出的DNA序列與數(shù)據(jù)庫物種的DNA序列比對，序列吻合的則證明存在該動物源性成分。目前國內(nèi)采用該方法的標(biāo)準(zhǔn)主要有GB/T 35918—2018《動物制品中動物源性檢測基因條碼技術(shù) Sanger測序法》[13]、SN/ T 2978—2011《動物源性產(chǎn)品中雞源性成分 PCR 檢測方法》[14]、SN/T 3647—2013《鯊魚動物源性成分檢測方法 PCR法》[15]以及SN/T 3731—2013[16—17]部分系列標(biāo)準(zhǔn)。以SN/T 2978—2011為例，采用DNA提取試劑盒提取樣品DNA后，利用特異性引物、堿基對以及DNA聚合酶等構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，經(jīng)PCR儀擴增后將擴增產(chǎn)物進行溴化乙錠-溴酚藍(lán)凝膠電泳。實驗過程要設(shè)置雞源性DNA的陽性對照，以已知不含有雞成分的樣品提取的DNA為陰性對照，以滅菌水為空白對照同時進行凝膠電泳，實驗在陽性對照出現(xiàn)131 bp左右的條帶，陰性對照無該條帶出現(xiàn)，空白對照無條帶出現(xiàn)時，視為該實驗成立。在實驗成立的前提下，樣品出現(xiàn)131 bp左右的擴增產(chǎn)物則判為可疑陽性，否則為陰性。將可疑陽性的PCR擴增產(chǎn)物進行核酸序列測定與 GEENBANK中雞線粒體DNA相對應(yīng)片段的序列比對，其片段大小正確，同源性達(dá)到98%以上，則確證含有雞源性成分[14]。PCR結(jié)合測序方法的優(yōu)點在于定性準(zhǔn)確性較高，受環(huán)境中氣溶膠影響相對較小，但凝膠電泳和測序花費時間較長，且凝膠電泳的核酸染料具有一定的生物毒性，實驗人員需做好相關(guān)防護。

3.2 實時熒光定量PCR法

實時熒光定量PCR法是將熒光標(biāo)記探針與特異性引物的一條DNA序列結(jié)合。該熒光探針初始狀態(tài)兩端分別有一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，在PCR酶聯(lián)擴增反應(yīng)前，熒光報告基團的信號會被淬滅基團直接吸收而無法被儀器檢測到；在PCR酶聯(lián)擴增進行的過程中，Taq DNA酶會將探針酶切，使熒光報告基團與淬滅基團分離，從而使熒光信號暴露被儀器檢測到。理論上熒光信號會跟隨PCR擴增的同時呈對數(shù)增加，實現(xiàn)熒光信號強度與DNA擴增產(chǎn)物濃度成正比的關(guān)系，進而達(dá)到定量的檢測目的。目前國內(nèi)動物源性檢測標(biāo)準(zhǔn)主要采用該方法進行檢測，畜類源性成分檢測一般采用SN/T 3730—2013系列標(biāo)準(zhǔn)[18—25]與SN/T 2980—2011[26]檢測貂、狗、狐貍、豬、貓、馬以及牛和羊等成分；禽類源性成分檢測一般采用SN/T 3731—2013部分系列標(biāo)準(zhǔn)[27-30]檢測鴨、火雞、鵪鶉等成分。這些標(biāo)準(zhǔn)其主要過程是利用DNA提取試劑盒提取待測樣品的DNA，提取產(chǎn)物經(jīng)過核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計檢測濃度和純度后，將DNA產(chǎn)物、堿基、熒光探針標(biāo)記的引物以及酶等物質(zhì)構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，利用熒光PCR儀進行熒光實時定量PCR擴增，反應(yīng)過程中分別設(shè)陽性對照、陰性對照、空白對照。以SN/T 3730.8—2013為例，以豬提取的DNA為陽性對照，以已知不含有豬成分的樣品提取的DNA為陰性對照，以滅菌水為空白對照，當(dāng)空白對照和陰性對照均無熒光對數(shù)增長且相應(yīng)的Ct值大于40.0，同時陽性對照有熒光對數(shù)增長，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴增曲線，相應(yīng)的Ct值小于30.0時，說明反應(yīng)及質(zhì)控有效，此時如果樣品的Ct值小于等于35.0判定為陽性；如果樣品的Ct值大于等于40.0則判定為陰性；如果樣品的Ct值介于35和40之間，則重復(fù)實驗一次，如重復(fù)實驗Ct值仍為小于0，則判定被檢樣品為陽性；如再次擴增后Ct大于等于40.0，則判定被檢樣品為陰性[25]。與傳統(tǒng)的PCR結(jié)合高通量測序的方法相比，該方法擴增反應(yīng)后無須進行染色處理及電泳分離，可較為準(zhǔn)確定量，且具有靈敏度高、自動化程度高的特點，適合大批量樣品的檢測工作。但由于部分食品在制作過程中被高溫或油炸等操作破壞了其中的DNA結(jié)構(gòu)，因此在檢測時一般選擇特異性明顯的短DNA序列進行擴增[5]。這可能導(dǎo)致反應(yīng)體易受實驗室氣溶膠污染環(huán)而出現(xiàn)假陽性，因此在實驗前要確保實驗室環(huán)境的消殺工作徹底。

3.3 膜芯片方法

膜芯片方法是利用尼龍材質(zhì)或硝酸纖維材質(zhì)膜體作為芯片基體的快速篩查技術(shù)[5]。其原理是將動物基因序列堿基對的其中一條作為探針固定在膜上，當(dāng)待測樣品的基因序列與該探針的基因序列互補時，該組分則會被保留在膜體芯片上，然后通過酶聯(lián)反應(yīng)與底物顯色的方式，借助膜芯片識讀儀讀取結(jié)果。目前國內(nèi)采用該方法的檢測標(biāo)準(zhǔn)為GB/T35917—2018《常見動物源性成分快速測定 膜芯片法》[31]。該方法優(yōu)點在于當(dāng)待測組分包含多種動物源性成分時，傳統(tǒng)的熒光PCR檢測方法的信號通道受限可能會增加檢測時長，膜芯片技術(shù)則不受該問題影響，但由于膜體能夠固定的基因序列較短，使用該方法時會出現(xiàn)假陽性的情況。該方法被檢測機構(gòu)或監(jiān)管部門應(yīng)用于市場快速篩查中。

4 結(jié) 語

綜上，國內(nèi)食品中動物源性成分的檢測是以普通PCR結(jié)合基因測序法以及實時熒光定量PCR法為主，以蛋白質(zhì)檢測法和膜芯片法為輔構(gòu)建起來的標(biāo)準(zhǔn)檢測體系。普通PCR結(jié)合基因測序的方法其定性準(zhǔn)確性高，受氣溶膠的影響相對較小，須要做好質(zhì)控對照實驗，耗時長、無法定量并具有一定的生物毒性；實時熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)無需進行染色處理及電泳分離，可較為準(zhǔn)確地定量，具有靈敏度高、自動化程度高的特點，但易受實驗室氣溶膠污染環(huán)而出現(xiàn)假陽性，須要做好實驗室核酸的消殺工作；蛋白質(zhì)檢測標(biāo)準(zhǔn)基本不受環(huán)境中氣溶膠影響，在數(shù)據(jù)庫足夠的情況下可分離多種動物源性蛋白，后期可結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)，進行大批量的動物源性成分鑒定，但對于大分子及難溶性蛋白的分離較差，且對人員操作要求較高；膜芯片技術(shù)適合快速篩查時使用，檢測機構(gòu)和食品安全監(jiān)管部門可根據(jù)不同需求進行方法選擇。

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[17]食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第2部分： 鵝成分檢測 PCR 法：SN/T 3731.2—2013[S].

[18]食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第1部分： 貂成分檢測 實時熒光PCR法：SN/T 3730.1—2013[S].

[19]食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第2部分： 狗成分檢測 實時熒光PCR法：SN/T 3730.2—2013[S].

[20]食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第3部分： 狐貍成分檢測實時熒光PCR法：SN/T 3730.3—2013[S].

[21]食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第4部分： 驢成分檢測 實時熒光PCR法：SN/T 3730.4—2013[S].

[22]食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第5部分： 馬成分檢測 實時熒光PCR法：SN/T 3730.5—2013[S].

[23]食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第6部分： 貓成分檢測 實時熒光PCR法：SN/T 3730.6—2013[S].

[24]食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第7部分： 水牛成分檢測 實時熒PCR法：SN/T 3730.7—2013[S].

[25]食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第8部分： 豬成分檢測 實時熒光PCR法：SN/T 3730.8—2013[S].

[26]動物產(chǎn)品中牛、山羊和綿羊源性成分三重實時熒光PCR檢測方法：SN/T 2980—2011[S].

[27]食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第3部分： 鴿子成分檢測 實時熒光PCR法：SN/T 3731.3—2013[S].

[28]食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第4部分： 火雞成分檢測 實時熒光PCR法：SN/T 3731.4—2017[S].

[29]食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分： 鴨成分檢測 PCR法：SN/T 3731.5—2013[S].

[30]食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第6部分： 鷓鴣成分檢測 實時熒光PCR法：SN/T 3731.6—2013[S].

[31]常見動物源性成分快速測定 膜芯片法：GB/T 35917—2018[S].

作者簡介

王恩輝，碩士研究生，工程師，研究方向為食品質(zhì)量安全檢測技術(shù)、食品安全標(biāo)準(zhǔn)。

張志然，通信作者，本科，高級工程師，研究方向為食品質(zhì)量安全監(jiān)管、食品化學(xué)分析。

（責(zé)任編輯：袁文靜）