丁酸梭菌對(duì)鈍吻黃蓋鰈幼魚生長(zhǎng)性能、腸道結(jié)構(gòu)和腸道菌群的影響

徐曉瑩 史文凱 張寧 盧波 李秀梅 張曉明 劉蓬

摘 要：為研究丁酸梭菌對(duì)鈍吻黃蓋鰈（Pseudopleuronectes yokohamae）幼魚生長(zhǎng)和腸道健康的影響，選取體長(zhǎng)（10.28±0.08）cm、體質(zhì)量（13.72±0.90）g的鈍吻黃蓋鰈幼魚共180尾，隨機(jī)分為試驗(yàn)組（飼料中添加丁酸梭菌菌液）和對(duì)照組，開展了為期42 d的飼養(yǎng)對(duì)比試驗(yàn)，采用體尺性狀測(cè)量、腸道組織切片觀察和高通量測(cè)序等方法，分析了飼料中添加丁酸梭菌菌液對(duì)鈍吻黃蓋鰈生長(zhǎng)性能、腸道結(jié)構(gòu)和腸道菌群的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組幼魚的增重率、特定生長(zhǎng)率和肥滿度均顯著提高（P＜0.05），飼料系數(shù)顯著降低（P＜0.05）；腸道組織的絨毛長(zhǎng)度極顯著增加（P＜0.01），絨毛寬度顯著增加（P＜0.05）。高通量測(cè)序結(jié)果顯示，在門和屬水平上，試驗(yàn)組和對(duì)照組均表現(xiàn)出不同程度的差異；飼料中添加丁酸梭菌可以增加鈍吻黃蓋鰈幼魚腸道中潛在有益菌的數(shù)量，促進(jìn)腸道分解、代謝飼料的功能。結(jié)果表明，飼料中添加丁酸梭菌能提高鈍吻黃蓋鰈幼魚的生長(zhǎng)性能，改善其腸道結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)腸道菌群的比例，促進(jìn)腸道健康。

關(guān)鍵詞：丁酸梭菌；鈍吻黃蓋鰈；生長(zhǎng)性能；腸道結(jié)構(gòu)；腸道菌群

益生菌是一種綠色、健康的微生態(tài)制劑，可作為飼料添加劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，有助于改善水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能，提高飼料利用率，抑制病原微生物，減少抗生素的使用，現(xiàn)已成為水產(chǎn)病害防控的重要手段［1］。丁酸梭菌（Clostridium butyricum）又名酪酸菌，是一種芽孢桿菌科的革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌［2］，其代謝產(chǎn)物丁酸是腸道上皮組織細(xì)胞再生和修復(fù)的主要能量來(lái)源，可修復(fù)腸道結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境［3-4］。研究表明，丁酸梭菌可促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）［5］、鯉（Cyprinus carpio）［6］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［7］等多種水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和腸道健康［8］。

鈍吻黃蓋鰈（Pseudopleuronectes yokohamae）隸屬于鰈形目、鰈科、黃蓋鰈屬［9］，是我國(guó)黃、渤海海域鲆鰈類主要經(jīng)濟(jì)品種之一［10］。該魚肉質(zhì)細(xì)嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，為傳統(tǒng)名貴魚類［11］。近年來(lái)，隨著鈍吻黃蓋鰈集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，對(duì)生物飼料的需求量也日益增加，但有關(guān)益生菌在鈍吻黃蓋鰈養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究還相對(duì)較少。本研究通過(guò)開展飼養(yǎng)對(duì)比試驗(yàn)，采用性狀測(cè)量、腸道組織切片觀察和高通量測(cè)序等方法，分析飼料中添加丁酸梭菌對(duì)鈍吻黃蓋鰈生長(zhǎng)性能、腸道組織結(jié)構(gòu)、腸道菌群等的影響，以期為鈍吻黃蓋鰈養(yǎng)殖過(guò)程中新型飼料的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用鈍吻黃蓋鰈為煙臺(tái)宗哲海洋科技有限公司自繁自育的健康魚種，平均體長(zhǎng)為（10.28±0.08）cm，平均體質(zhì)量為（13.72±0.90）g。配合飼料為仔稚魚育苗專用飼料，購(gòu)自青島賽格林生物工程有限公司，其常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分（按質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為：粗蛋白質(zhì)52%、粗脂肪8%、粗灰分17%、粗纖維8%和水分12%。丁酸梭菌為“優(yōu)腸健”牌，購(gòu)自青島海芙特生態(tài)科技有限公司，丁酸梭菌含量為1×109 CFU/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取健康且規(guī)格整齊的鈍吻黃蓋鰈180尾，隨機(jī)分為兩組：配合飼料組（CF組，即對(duì)照組），丁酸梭菌組（PF組，即試驗(yàn)組）。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚。將各組魚分別放入120 L的塑料水族箱中飼養(yǎng)。試驗(yàn)水溫為15 ℃，鹽度為24～30，每天吸污并更換30%的水以保證水質(zhì)。

試驗(yàn)期間，每日投飼2次，上午7：30和下午16：30各投1次，其中CF組僅投喂配合飼料，PF組則投喂添加了丁酸梭菌的配合飼料，每次投飼量為魚體質(zhì)量的1%。PF組飼料的配制方法是：將丁酸梭菌溶解于蒸餾水中，然后均勻噴灑在配合飼料上，完成后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。丁酸梭菌添加量為配合飼料量?.3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，實(shí)際含量為3×109 CFU/kg）［12］。

試驗(yàn)開始時(shí)稱取每尾魚的體質(zhì)量，試驗(yàn)期間每半個(gè)月測(cè)量1次試驗(yàn)魚的體質(zhì)量，并根據(jù)魚體質(zhì)量調(diào)整投飼量，記錄每組魚的攝食量。養(yǎng)殖試驗(yàn)周期為42 d。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長(zhǎng)性能

試驗(yàn)結(jié)束后，稱量前停食24 h，分別從各組隨機(jī)抽取10尾試驗(yàn)魚進(jìn)行體尺性狀測(cè)量，并根據(jù)以下公式計(jì)算各項(xiàng)生長(zhǎng)性能指標(biāo)。

RWG=100%×（Wt-W0）/W0（1）

RSG=100%×（lnWt-lnW0）/t（2）

RFC=F/（Wt-W0） （3）

CF=100×Wt/L3 （4）

式（1）～（4）中：RWG為增重率（%），Wt為終末體質(zhì)量（g），W0為初始體質(zhì)量（g），RSG為特定生長(zhǎng)率（%/d），t為試驗(yàn)天數(shù)（d），RFC為飼料系數(shù)，F(xiàn)為試驗(yàn)期內(nèi)的攝食量（g），CF為肥滿度，L為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚的體長(zhǎng)（cm）。

1.3.2 腸道結(jié)構(gòu)

試驗(yàn)結(jié)束后停食24 h，從各組隨機(jī)抽取3尾魚，解剖取出腸道并于體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液中固定。固定的腸道組織樣品交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行浸蠟包埋、冷凍切片和HE染色。對(duì)染色后的組織切片進(jìn)行顯微鏡觀察和圖像采集，并利用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量腸道組織的絨毛長(zhǎng)度、絨毛寬度和肌層厚度。

1.3.3 腸道菌群

1.3.3.1 腸道菌群DNA提取與PCR擴(kuò)增

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，分別從各組隨機(jī)取9尾魚，解剖取出完整魚腸道，并將腸道內(nèi)容物擠出，將3尾魚的腸道內(nèi)容物作為1個(gè)混合樣品放入凍存管中，用液氮速凍保存待測(cè)。腸道樣品基因組DNA的提取和測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。以提取的腸道樣品基因組DNA為模板，以特異引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)后在Illumina平臺(tái)PE250上機(jī)測(cè)序。

1.3.3.2 腸道菌群生物信息分析

下機(jī)數(shù)據(jù)使用FLASH 1.2.7軟件對(duì)樣品的數(shù)據(jù)（reads）進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到高質(zhì)量的標(biāo)簽數(shù)據(jù)（clean tags），參照QIIME流程對(duì)clean tags進(jìn)行質(zhì)控，得到有效數(shù)據(jù)（effective tags）［13］。用Uparse 7.0.1001軟件對(duì)所有樣品的全部effective tags進(jìn)行聚類分析，以97%的一致性將序列聚類成為可操作分類單元（OTUs），并對(duì)OTUs進(jìn)行Chao1、ACE、Shannon和Simpson等多種多樣性指數(shù)分析以及Alpha多樣性和Beta多樣性指數(shù)組間差異分析［14］。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本t檢驗(yàn)。設(shè)顯著性水平為0.05，極顯著水平為0.01。

2 結(jié)果和分析

2.1 添加丁酸梭菌對(duì)鈍吻黃蓋鰈幼魚生長(zhǎng)性能的影響

由表1可見，在配合飼料中添加丁酸梭菌有效促進(jìn)了鈍吻黃蓋鰈的生長(zhǎng)，降低了飼料系數(shù)。PF組魚的終末體質(zhì)量、增重率、特定生長(zhǎng)率、肥滿度均顯著高于CF組（P＜0.05），其中增重率達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），PF組的飼料系數(shù)也顯著低于CF組（P＜0.05）。

2.2 添加丁酸梭菌對(duì)鈍吻黃蓋鰈幼魚腸道結(jié)構(gòu)的影響

試驗(yàn)組和對(duì)照組鈍吻黃蓋鰈幼魚的后腸切片顯微觀察見圖1。由圖1可見，試驗(yàn)組（PF組）魚的腸道絨毛致密且較長(zhǎng)，而對(duì)照組（CF組）魚的腸道絨毛稀疏且長(zhǎng)度較短。結(jié)合腸道黏膜形態(tài)數(shù)據(jù)（見表2）可以看出，飼料中添加丁酸梭菌后，顯著提高了鈍吻黃蓋鰈腸道絨毛長(zhǎng)度和絨毛寬度（P＜0.05），且兩個(gè)組的腸道絨毛長(zhǎng)度差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

2.3 鈍吻黃蓋鰈腸道菌群多樣性分析

由圖2樣本間物種分布韋恩（Venn）圖可知，3組鈍吻黃蓋鰈腸道樣品產(chǎn)生的OTUs數(shù)目在418～445，對(duì)照組和試驗(yàn)組共有OUTs為161個(gè)，對(duì)照組特有OUTs為284個(gè)，試驗(yàn)組特有OUTs為257個(gè)。結(jié)合Alpha多樣性分析結(jié)果（見表3），對(duì)照組鈍吻黃蓋鰈腸道菌群的Chao1、Ace、Shannon指數(shù)均高于試驗(yàn)組，Simpson指數(shù)低于試驗(yàn)組，說(shuō)明試驗(yàn)組鈍吻黃蓋鰈腸道菌群多樣性降低了。

2.4 鈍吻黃蓋鰈腸道菌群結(jié)構(gòu)組成分析

鈍吻黃蓋鰈腸道菌群物種豐富度見圖3所示。在門水平上，PF組鈍吻黃蓋鰈腸道中變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）的豐度高于CF組，而厚壁菌門（Firmicutes）豐度低于CF組。在屬水平上，PF組鈍吻黃蓋鰈腸道中微桿菌屬（Microbacterium）、異常球菌屬（Deinococcus）、紫色桿菌屬（Janthinobacterium）等的豐度高于CF組，CF組特有的菌群為乳球菌屬（Lactococcus）。

3 討論

3.1 丁酸梭菌對(duì)鈍吻黃蓋鰈生長(zhǎng)性能的影響

丁酸梭菌作為有益菌添加于水產(chǎn)飼料中可提高水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能［8］。樊英等［7］在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）幼魚飼料中添加丁酸梭菌，經(jīng)40 d的飼喂試驗(yàn)后，虹鱒幼魚的特定生長(zhǎng)率顯著提高，飼料系數(shù)顯著降低。Zhang等［13］在羅非魚（Oreochromis niloticus）飼料中添加不同濃度的丁酸梭菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加量為1.5×1011 CFU/kg時(shí)，羅非魚生長(zhǎng)性能最佳。本研究中，42 d的飼養(yǎng)對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果表明，添加丁酸梭菌組鈍吻黃蓋鰈的增重率、特定生長(zhǎng)率顯著高于未添加的對(duì)照組，而飼料系數(shù)顯著低于對(duì)照組。本研究中丁酸梭菌的促生長(zhǎng)作用可能與其代謝產(chǎn)物丁酸有關(guān)，丁酸可為結(jié)腸黏膜細(xì)胞提供主要能量，并為腸道細(xì)胞的增殖與成熟提供重要保障［7］。

3.2 丁酸梭菌對(duì)鈍吻黃蓋鰈腸道結(jié)構(gòu)的影響

健康的腸道結(jié)構(gòu)是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的保障。研究表明，丁酸梭菌代謝產(chǎn)物丁酸對(duì)腸道黏膜損傷具有修復(fù)作用［14］。丁酸是腸道上皮組織細(xì)胞再生的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可增加腸上皮細(xì)胞的數(shù)量，使絨毛長(zhǎng)度增加，從而改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)［15］。潘曉東等［16］研究表明，在飼料中添加丁酸梭菌后，魚免魚（Miichthysmiiuy）腸絨毛明顯增長(zhǎng)、致密，且腸絨毛上出現(xiàn)了大量的橫向分叉。本研究中，試驗(yàn)組鈍吻黃蓋鰈腸道絨毛的長(zhǎng)度和寬度比對(duì)照組分別增加了59.26%和48.47%，進(jìn)一步說(shuō)明丁酸梭菌可促進(jìn)腸道發(fā)育，使腸絨毛增長(zhǎng)，增加腸道吸收表面積，從而促進(jìn)鈍吻黃蓋鰈對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)的吸收。

3.3 丁酸梭菌對(duì)鈍吻黃蓋鰈腸道菌群變化的影響

益生菌常用于添加到基礎(chǔ)日糧中以改善養(yǎng)殖動(dòng)物腸道的微生態(tài)平衡。吳楊等［17］研究表明，在卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）飼料中添加適量丁酸梭菌能顯著提高卵形鯧鲹腸道菌群的多樣性。類似的結(jié)論也在樊英等［7］對(duì)虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的研究中得到驗(yàn)證。另有研究表明，丁酸梭菌能夠抑制不耐酸致病菌在魚腸道上皮的黏附［18］。在體外試驗(yàn)中，丁酸梭菌也表現(xiàn)出對(duì)致病菌的抑制作用［19］。本研究中，添加丁酸梭菌試驗(yàn)組的OUTs數(shù)量相對(duì)較少，結(jié)合Chao1、Ace、Simpson、Shannon指數(shù)變化，丁酸梭菌降低了鈍吻黃蓋鰈腸道菌群的多樣性，究其原因，可能是高濃度丁酸梭菌通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用在一定程度上抑制了一些細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。另有研究表明，丁酸梭菌能夠顯著提高養(yǎng)殖動(dòng)物腸道內(nèi)溶菌酶的活性［20-21］，高活性的溶菌酶也可能是導(dǎo)致腸道菌群多樣性降低的原因之一。

本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鈍吻黃蓋鰈腸道中的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門和放線菌門。變形菌門是中國(guó)沿海地區(qū)養(yǎng)殖水體的優(yōu)勢(shì)菌門［22］，能分解代謝飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分［23］。本試驗(yàn)中，PF組變形菌門豐度增加可能有利于鈍吻黃蓋鰈對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的吸收。放線菌門中的許多種類屬于潛在的益生菌［24］，可產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，通過(guò)干擾病原菌的代謝對(duì)病原菌產(chǎn)生直接的抑制和致死作用［25］。本試驗(yàn)中，PF組鈍吻黃蓋鰈腸道中放線菌門豐度高于CF組，可能與丁酸梭菌能夠有效增加水產(chǎn)動(dòng)物腸道中潛在的有益菌有關(guān)［26］。在屬水平上，鈍吻黃蓋鰈腸道優(yōu)勢(shì)菌屬為微桿菌屬和巨型球菌屬。微桿菌是潛在的有益菌，能參與多種碳水化合物的代謝，提供能量［27］。CF組中微桿菌屬比例增加，說(shuō)明添加外源丁酸梭菌增加了鈍吻黃蓋鰈腸道中有益菌的數(shù)量。投喂丁酸梭菌的PF組試驗(yàn)魚腸道菌群中未檢測(cè)到梭菌屬的分布，這可能是由于養(yǎng)殖周期短，導(dǎo)致丁酸梭菌在鈍吻黃蓋鰈腸道菌群中占比較低或并未在腸道內(nèi)定植。但也有研究表明，丁酸梭菌是否在水產(chǎn)動(dòng)物腸道內(nèi)定植不影響其有益作用的發(fā)揮［28］，即使是死亡或失去活性的丁酸梭菌也能在水產(chǎn)動(dòng)物腸道內(nèi)發(fā)揮益生作用，維持腸道健康［29］。本研究中，乳球菌屬為CF組特有的菌群。有研究表明，乳球菌可提高日本牙鲆的生長(zhǎng)速度以及溶菌酶、抗蛋白酶、血清過(guò)氧化物酶及血液的呼吸暴發(fā)活性［30］。本研究中PF組未檢測(cè)到乳球菌屬的分布，可能與投喂丁酸梭菌后，丁酸梭菌濃度過(guò)高抑制了特定有益菌的生長(zhǎng)有關(guān)［31］。因此，丁酸梭菌在鈍吻黃蓋鰈中飼料中的最佳添加濃度還有待進(jìn)一步研究試驗(yàn)。

4 結(jié)論

飼料中添加丁酸梭菌可顯著提高鈍吻黃蓋鰈的生長(zhǎng)性能，改善其腸道組織結(jié)構(gòu)。丁酸梭菌可調(diào)節(jié)鈍吻黃蓋鰈腸道中菌群的比例和結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促進(jìn)腸道健康。

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Effects of Clostridium butyricum on growth performance， intestinal morphology and bacterial diversity of Pseudopleuronectes yokohamae

XU Xiaoying1， SHI Wenkai1， ZHANG Ning2， LU Bo1， LI Xiumei2， ZHANG Xiaoming1，LIU Peng1

（1. Yantai Marine Economic Research Institute，Yantai 264003，China; 2. Yantai Zongzhe Ocean Technology Co.，LTD，Yantai 265617，China）

Abstract： In order to study the effects of dietary Clostridium butyricum supplementation on the growth and intestinal health of juvenile Pseudopleuronectes yokohamae，a total of 180 juveniles of P. yokohamae with the average body length of （10.28±0.08）cm and average body weight of （13.72±0.90）g were randomly divided into the experimental group（dietary C. butyricum liquid supplemented treatment） and the control group，and a 42-day culture experiment was carried out.Body size measurement， intestinal tissue section observation and high-throughput sequencing were used to study the effects of C. butyricum solution on the growth performance，intestinal structure and intestinal flora of P. yokohamae.The results showed that the weight gain rate（P＜0.01），specific growth rate（P＜0.05） and fullness（P＜0.05） of juveniles in the experimental group were significantly increased，and the feed coefficient ratio（P＜0.05） was significantly decreased，when compared to the control group.The length（P＜0.01） and width（P＜0.05） of villi were also significantly increased in the intestinal tissue of experimental group.The results of Illumina MiSeq sequencing showed that the experimental group and the control group showed different degrees of differences at the phylum and genus levels.C. butyricum can increase the number of potentially beneficial bacteria in the intestinal tract of P. yokohamae，and promote the function of intestinal breakdown and metabolism of feed.The results showed that the addition of C. butyricum to the feed could improve the growth performance，improve the intestinal structure，regulate the proportion of intestinal flora，and promote intestinal health of juveniles P. yokohamae.

Key words： Clostridium butyricum; Pseudopleuronectes yokohamae; growth performance; intestinal morphology; bacterial diversity