脂肪干細(xì)胞外泌體提高脂肪移植存活率的研究進(jìn)展

尹從洋 公美華 鄒同榮 謝林海

[摘要]脂肪移植是外科治療組織缺損、凹陷的重要治療手段，脂肪細(xì)胞具有來源豐富、良好的組織相容性等優(yōu)點，成為了整形外科治療的一個重要手段。但是，傳統(tǒng)的脂肪移植存在移植物存活率低、術(shù)后效果不穩(wěn)定等局限，隨著細(xì)胞輔助脂肪移植的發(fā)展，脂肪移植的存活率有了一定的提高，卻沒有根本解決高吸收率的問題，且可能存在致瘤等潛在風(fēng)險。脂肪干細(xì)胞外泌體的發(fā)現(xiàn)有望改變這一現(xiàn)狀。

[關(guān)鍵詞]外泌體；脂肪干細(xì)胞；脂肪移植；炎癥；血管化

[中圖分類號]R622+.9? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）04-0183-03

Research Progress of Adipose Stem Cell Exosomes to Improve the Survival Rate of Fat Transplantation

YIN Congyang1， GONG Meihua2， ZOU Tongrong3， XIE Linhai2

（1. The First Clinical College of Gannan Medical University， Ganzhou 341000， Jiangxi， China; 2. Department of Plastic Surgery， the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College， Ganzhou 341008， Jiangxi， China; 3.Department of Plastic and Burn Surgery， the First Peoples Hospital of Yibin， Yibin 644000， Sichuan， China）

Abstract： Fat transplantation is an important surgical treatment for tissue defects and depressions. Adipocytes have the advantages of abundant sources and good histocompatibility， and become an important method for plastic surgery. However， traditional fat transplantation has limitations such as low graft survival rate and unstable postoperative effect. With the development of cell-assisted fat transplantation， the survival rate of fat transplantation has been improved to a certain extent， but the problem of high absorption rate has not been fundamentally solved. Potential risks such as possible tumorigenesis. The discovery of adipose stem cell exosomes is expected to change this situation.

Key words： exosome; adipose-derived stem cells; fat transplantation; inflammation; vascularization

脂肪移植是作為組織填充的有效手段，其高吸收率一直以來是一個亟待解決的問題，不僅使術(shù)后效果不穩(wěn)定，還增加了患者多次手術(shù)的痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。脂肪移植存活率的影響因素主要包括：供區(qū)脂肪細(xì)胞的損傷情況、受區(qū)原血供條件和移植后血供早期重建、移植細(xì)胞的數(shù)量以及感染[1]。上述因素中的任意一項都會影響移植物的存活，由此解決脂肪移植高吸收率的問題，可以通過優(yōu)化以上因素來實現(xiàn)。近來發(fā)現(xiàn)的脂肪干細(xì)胞外泌體（Adipose-derived stem cells-exosomes， ADSCs-Exos）是脂肪干細(xì)胞旁分泌釋放的重要成分，它可以通過多種途徑發(fā)揮作用，從而促進(jìn)血管生成、細(xì)胞增殖和遷移、調(diào)節(jié)免疫等作用，達(dá)到提高脂肪移植存活率的目的[2]。

1? ADSCs-Exos的分離與提純

外泌體的大小、含量、功能具有組織特質(zhì)性，目前外泌體分離提純技術(shù)無法實現(xiàn)將外泌體與具有相似生物物理特性的脂蛋白和來自非核內(nèi)體途徑的細(xì)胞外囊泡完全鑒別，導(dǎo)致外泌體純度較低。常見的方法有聚合物沉淀法、免疫親和捕獲技術(shù)等[3]，其中超速離心法（Ultracentrifugation， UC）是目前應(yīng)用最廣泛的外泌體分離技術(shù)，也被稱為外泌體萃取分離的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。其具體步驟是將無胎牛血清的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)脂肪干細(xì)48 h后提取上清液，經(jīng)過以下步驟進(jìn)行操作：①低速離心，300 g、10 min，保留上清液，目的是去除死細(xì)胞和較大的凋亡碎片；②高速離心，1 000～20 000 g、40 min，進(jìn)一步去除較大的囊泡及碎片；③超高速離心，100 000～200 000 g、70 min，2次，得到外泌體[5]。這種方法操作繁瑣，提取的外泌體量較少，耗時長（至少4～5 h），純度相對較低，需進(jìn)一步提高外泌體純度及效率，找到高效富集外泌體的技術(shù)仍是亟待解決的問題。

2? ADSCs-Exos提高脂肪移植存活率

2.1 調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)：移植后脂肪組織抗感染能力差，血供也較差，容易發(fā)生感染，炎癥對于移植脂肪細(xì)胞的存活具有十分重要的影響?，F(xiàn)有研究表明，ADSCs-Exos可以通過炎癥細(xì)胞及炎癥因子的釋放來發(fā)揮控制炎癥的作用，這對于維持移植后組織代謝穩(wěn)態(tài)具有重要意義，可以有效減少移植脂肪的壞死[6]。

2.1.1 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化：巨噬細(xì)胞是異質(zhì)性的，其表型和功能受周圍微環(huán)境的調(diào)節(jié)。通常存在兩個不同的亞群：M1型和M2型。在炎癥發(fā)生的初級階段，巨噬細(xì)胞首先表現(xiàn)為M1表型，釋放TNF-α、IL-1β、IL-12和IL-23等促炎因子來對抗刺激，但是如果M1型持續(xù)表達(dá)，它會導(dǎo)致組織損傷。此時，M2巨噬細(xì)胞分泌大量的IL-10和TGF-β等抗炎因子抑制炎癥，促進(jìn)組織修復(fù)、重塑、血管生成，保持內(nèi)穩(wěn)態(tài)[7]。在一定條件下兩種細(xì)胞可以發(fā)生分型轉(zhuǎn)換，因此M1/M2巨噬細(xì)胞的平衡極化影響著炎癥的最終發(fā)展[8]。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs-Exos可以通過下調(diào)M1表型巨噬細(xì)胞中的TNF-α、IL-6表達(dá)，同時上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞中Arg-1和IL-10的表達(dá)來減輕炎癥，并證實了ADSCs-Exos可以促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[9]。據(jù)報道，外泌體中存在高度穩(wěn)定的miRNAs可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，這些miRNAs在RNA沉默和基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[10]。Li R等[11]研究發(fā)現(xiàn)ADSCs-Exos通過富集miR-451a來抑制巨噬細(xì)胞游走抑制因子（MIF）的表達(dá)來促使M1向M2極化。MIF作為一種炎癥細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)，其抑制劑可抑制M1型巨噬細(xì)胞的激活和NO、TNF-α和IL-6等炎癥因子的表達(dá)[12]。另外，Hao X等[13]研究發(fā)現(xiàn)ADSCs-Exos通過let-7c下調(diào)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP）-δ致促炎的M1巨噬細(xì)胞衰減和抗炎的M2巨噬細(xì)胞升高。趙匯等[14]實驗證明ADSCs-Exos通過p-STAT3的表達(dá)使巨噬細(xì)胞中M2相關(guān)表型精氨酸酶l（Arg-1）表達(dá)的上調(diào)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化。M2型巨噬細(xì)胞除了抗炎作用以外，還具有修復(fù)能力，可以提高脂肪移植物的保留率。

2.1.2 調(diào)節(jié)炎癥因子：炎癥因子作為炎癥的調(diào)節(jié)因子，在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，炎癥因子對于調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞也起著至關(guān)重要的作用。炎癥開始階段各種應(yīng)激源誘導(dǎo)的M1巨噬細(xì)胞極化，M1巨噬細(xì)胞通過分泌促炎的TNF-α、IL-1和IL-6等炎癥因子，從損傷部位清除病原體和碎片，隨后M2巨噬細(xì)胞分泌抗炎的IL-10和TGF-β等抗炎因子拮抗炎癥，在炎癥因子的輔助下巨噬細(xì)胞控制著炎癥發(fā)生的結(jié)局[15]。秦勤等[16]在關(guān)于過敏性鼻炎的研究中證實，ADSCs-Exos可以通過抑制TLR4/NF-κB通路調(diào)控下游基因表達(dá)，減少TNF-α、TNF-γ、IL-1β、IL-6等炎癥因子的分泌，減輕炎癥。Fan L等[17]研究中發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體可以抑制LPS誘導(dǎo)的PCI2細(xì)胞凋亡，減少了包括TNF-α、IL-1β在內(nèi)的促炎因子的分泌，并促進(jìn)了包括IL-10和IL-4在內(nèi)的抗炎因子的分泌。Zhao H等[18]發(fā)現(xiàn)ADSCs-Exos通過減少炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，如IL-4、IL-23、IL-31和TNF-α，可以改善特應(yīng)性皮炎樣癥狀。

2.2 促進(jìn)血管生成：移植后早期血供充足對移植脂肪的命運至關(guān)重要。陳珂欣等[19]研究發(fā)現(xiàn)ADSCs-Exos可顯著促進(jìn)損傷組織的血管形成，并具有與脂肪干細(xì)胞相似的血管生成效果，且脂肪干細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡與脂肪組織共移植能顯著提高移植物的成活率。但是目前ADSCs-Exos促進(jìn)血管生成的潛在作用機(jī)制尚不明確。在影響組織新生血管形成血管生成的眾多因素中，血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor， VEGF）A是最重要的細(xì)胞因子之一，VEGFA可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)形成小管樣結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，組織中的成纖維細(xì)胞可以表達(dá)包括VEGFA在內(nèi)的多種促血管生成因子，這一結(jié)論也在孟文霞等[20]的研究中得到證實，他們發(fā)現(xiàn)活化的成纖維細(xì)胞可以調(diào)控血管生成，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移。此外，盧穎潔等[21]研究發(fā)現(xiàn)ADSCs-Exos分泌的miR-486-5p可以通過抑制Sp5的表達(dá)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生成和遷移，加速創(chuàng)面早期血供的建立，從而促進(jìn)愈合。陳珂欣等[19]則通過蛋白印跡技術(shù)和實時定量PCR，比較ADSCs-Exos組與對照組脂肪移植物VEGR/AKT通路的激活情況及VEGF、AKT的表達(dá)和AKT的磷酸化程度。得到結(jié)果ADSCs-Exos與脂肪共移植可以激活VEGR/AKT通路，促進(jìn)脂肪移植物的血管形成。除此之外，淋巴細(xì)胞、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、IL-8、胰島素及胰島素樣生長因子1等都可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化，但它們與ADSCs-Exos的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究確定[22]。

2.3 促進(jìn)脂肪生成：ADSCs-Exos是一種獲取方便、低免疫原性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、血管化良好的新型脂肪因子，在脂肪移植早期（4周前）具有更強(qiáng)的脂肪再生能力[23]。Chen B等[24]將混合外泌體、干細(xì)胞或生理鹽水的脂肪組織粉碎皮下植入小鼠背部，在第3周和10周外泌體組的脂肪移植顯示出更好的脂肪完整性，且油、囊腫、纖維化減少。另外，對巨噬細(xì)胞浸潤、炎癥因子、血管生成因子、脂肪生成因子和細(xì)胞外基質(zhì)的進(jìn)一步研究表明，ADSCs-Exos促進(jìn)血管生成并上調(diào)早期炎癥反應(yīng)，而在脂肪移植中后期，其發(fā)揮促進(jìn)脂肪生成作用，也增加了膠原合成水平。

最近一項研究表明，大鼠脂肪組織分泌的外泌體含有豐富的miRNA，可調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化，QPCR檢測結(jié)果顯示，miR-450a-5p、miR-99a-5p和miR-30a-5p的含量最為豐富[25]，特別是miR-450a-5p在脂肪形成中發(fā)揮重要作用。實驗表明，在miR-450a-5p的靶點中，可以通過抑制WNT1誘導(dǎo)信號通路蛋白2（WISP2）來促進(jìn)細(xì)胞的成脂分化，MiR-450a-5P可以靶向WISP2的3 UTR抑制WISP2的表達(dá)[26-27]。在大鼠脂肪干細(xì)胞成脂培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，WISP2作為經(jīng)典的WNT介質(zhì)，與BMP4相互作用抑制脂肪細(xì)胞的成脂分化。因此，miR-450a-5p可以抑制WISP2誘導(dǎo)干細(xì)胞自發(fā)成脂分化[28]。

3? 小結(jié)和展望

ADSCs-Exos作為一種新型的無細(xì)胞治療策略，不僅繼承了脂肪干細(xì)胞的來源豐富、促分化潛能等特性，還具有非免疫原性、非致瘤性、易于儲存與運輸?shù)葍?yōu)勢，使外泌體成為再生醫(yī)學(xué)中最有吸引力的無細(xì)胞替代物[29]。本文通過對ADSCs-Exos生理特點的總結(jié)，發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)血管再生、促進(jìn)成脂分化等方面的作用，從而有效提高脂肪移植存活率[30]。ADSCs-Exos通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化和炎癥因子的釋放，控制術(shù)區(qū)的炎癥發(fā)展，有效地預(yù)防了感染導(dǎo)致的大片脂肪壞死，通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化，建立早期血供解決了新生組織營養(yǎng)供給和缺氧的問題，后期通過促進(jìn)脂肪細(xì)胞成脂分化和膠原合成水平，在以上多種因素作用下，脂肪移植物存活率得到明顯提升[24]。但目前沒有ADSCs-Exos與細(xì)胞輔助脂肪移植的療效對比，無法判斷兩種治療方法的實際療效，其次，在臨床實際應(yīng)用中ADSCs-Exos的具體用量以及使用頻次尚待研究確定，還需進(jìn)一步研究找到解決外泌體受環(huán)境影響其效用的問題，如在低氧環(huán)境或過氧化氫刺激下，ADSCs-Exos促血管新生和免疫調(diào)節(jié)的效果更加顯著[31]。當(dāng)然，臨床應(yīng)用方面已經(jīng)有學(xué)者提出了思路，Wang M等[32]的團(tuán)隊通過組織工程將外泌體與水凝膠支架結(jié)合，使其可以持續(xù)釋放有生物活性的外泌體，解決了外泌體的裝載問題，為外泌體的應(yīng)用開辟了道路；Shafiei M等[33]將外泌體與生物支架（如膠原蛋白）相結(jié)合，將外泌體靶向遞送至受損區(qū)域?qū)崿F(xiàn)組織器官的修復(fù)再生。

綜上，ADSCs-Exos對于提高脂肪移植存活率具有廣闊的應(yīng)用前景，為再生醫(yī)學(xué)研究提供了一種新的思路。

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[收稿日期]2022-12-09

本文引用格式：尹從洋，公美華，鄒同榮，等.脂肪干細(xì)胞外泌體提高脂肪移植存活率的研究進(jìn)展[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2024，33（4）：183-186.