血清1-磷酸鞘氨醇聯(lián)合透明質(zhì)酸檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌的診斷及預(yù)后價(jià)值

陳丹丹，胡嘉捷，劉鷖雯，何怡青，楊翠霞，張國(guó)良，高 鋒，杜 艷

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200233；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200233）

近年來(lái)，我國(guó)結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)增長(zhǎng)、年輕化趨勢(shì)［1］。多數(shù)CRC 患者在被確診時(shí)已經(jīng)處于疾病的的中晚期，而現(xiàn)有的循環(huán)腫瘤標(biāo)志物都存在各自的局限性，因此尋找早期篩查CRC 的新型無(wú)創(chuàng)性標(biāo)志物尤為重要［1］。

1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）是一種多效性鞘脂代謝物，能通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面1-磷酸鞘氨醇受體調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的異常增殖及轉(zhuǎn)移、血管和淋巴管新生以及腫瘤的化學(xué)耐藥等，從而促進(jìn)多種癌癥的發(fā)生發(fā)展［2，3］。有研究報(bào)道S1P 在CRC患者血清中的水平顯著高于腸道良性疾病患者和健康體檢者［4］。透明質(zhì)酸（hyaluronan，HA）是由雙糖重復(fù)單位構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一，其在多種腫瘤如轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌中異常升高，并 與 患 者 的 預(yù) 后 不 良 相 關(guān)［5，6］。既 往 研 究 發(fā) 現(xiàn)HA 能夠參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲以及腫瘤相關(guān)血管及淋巴管生成［6-8］。另有研究發(fā)現(xiàn)HA 可通過(guò)與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體-1 結(jié)合從而調(diào)控S1P 受體表達(dá)［9］?；赟1P 受體受HA 調(diào)控的機(jī)理，我們推測(cè)S1P 和HA 可能在腫瘤進(jìn)展中存在交互作用，且S1P 與HA 皆以可溶性分子形式存在于血液中。因此，兩者聯(lián)合檢測(cè)可能在CRC 的早期篩查和手術(shù)療效監(jiān)測(cè)中發(fā)揮協(xié)同以及互補(bǔ)的作用，目前未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在探討CRC 患者術(shù)前術(shù)后血清S1P 及HA 水平變化與CRC 的關(guān)系，以期為CRC 的輔助診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的潛力標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2022 年9～12 月期間本院47 例CRC 患者作為結(jié)直腸癌組，30 例腸道良性疾病患者作為良性疾病組，38 名健康體檢者作為健康對(duì)照組。結(jié)直腸癌組男性31 例、女性16 例，年齡29～87 歲；良性疾病組（結(jié)腸炎、克羅恩病、腺瘤）：男性20 例、女性10例，年齡23～83 歲；健康對(duì)照組：男性26 名、女性10名，年齡50～72 歲，血糖、血脂、血壓、肝功能和腎功能等指標(biāo)均正常。3 組間年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有研究對(duì)象均知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理確診；（2）術(shù)前未經(jīng)放療、化療等處理；（3）比較全面的臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有惡性腫瘤病史；（2）術(shù)前進(jìn)行過(guò)放化療等治療；（3）臨床資料不完整；（4）依從性較差。

1.2 研究方法

搜集所有受試者的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、TNM 分期、淋巴轉(zhuǎn)移狀態(tài)、神經(jīng)侵犯情況、脈管侵犯情況、血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、血清糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9， CA19-9）等。其中結(jié)直腸癌組有8 例腫瘤大小未知，4 例淋巴轉(zhuǎn)移情況不詳，5 例神經(jīng)侵犯未知，5 例脈管侵犯情況不明，9 例Ras 基因型信息缺失。

清晨采集所有受試者空腹靜脈血3 mL，離心分離血清，并分裝凍存于-80 ℃冰箱。利用Epoch 酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）和ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物）檢測(cè)S1P。采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀MAGLUMI?X8（深圳新產(chǎn)業(yè)）及配套試劑檢測(cè)HA。所有操作均按照廠商說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 軟件和Graphpad 8.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25～P75）表示。兩組之間的比較用兩獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon 檢驗(yàn)。術(shù)前術(shù)后指標(biāo)比較用配對(duì)樣本W(wǎng)ilcoxon 檢驗(yàn)。S1P 和HA 指標(biāo)的相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)性分析。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析各指標(biāo)診斷CRC的效能。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康對(duì)照組、良性疾病組和結(jié)直腸癌組之間血清S1P 和HA 水

血清S1P 的水平在健康對(duì)照組、良性疾病組及結(jié)直腸癌組中逐次升高（Z=-3.533，P＜0.001；Z=-2.371，P＜0.05）。結(jié)直腸癌組血清HA 水平顯著高于健康對(duì)照組（Z=-2.393，P＜0.05），而良性疾病組分別與結(jié)直腸癌組和健康對(duì)照組之間的HA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.371，P＞0.05；Z=-1.123，P＞0.05）。見表1。

表1 各組之間血清S1P 和HA 水平的比較［M（P25～P75）］Tab 1 Comparison of serum S1P and HA levels among the three groups ［M（P25～P75）］

2.2 結(jié)直腸癌患者血清S1P 和HA 水平與臨床病理特征的關(guān)系

血清S1P 水平與結(jié)直腸癌組患者TNM 分期（早/晚期）和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，晚期CRC 患者血清S1P 水平低于早期CRC 患者（P＜0.05）；淋巴轉(zhuǎn)移陽(yáng)性CRC 患者血清S1P 水平顯著低于淋巴轉(zhuǎn)移陰性CRC 患者（P＜0.05）。另外，本研究結(jié)果顯示，血清HA 水平與結(jié)直腸癌組患者TNM 分期和脈管侵犯有關(guān)，晚期CRC 患者血清HA 水平低于早期CRC患者（P＜0.05）；脈管侵犯陽(yáng)性的CRC 患者血清HA 水平低于脈管侵犯陰性的CRC 患者（P＜0.05）。見表2。

表2 結(jié)直腸癌患者血清S1P 和HA 水平與臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 Relationship between serum S1P and HA levels and clinicopathological features of patients with colorectal cancer

2.3 血清S1P 和HA 的相關(guān)性分析

Spearman 相關(guān)分析顯示，術(shù)前結(jié)直腸癌患者血清S1P 與 HA 水平呈正相關(guān)，相關(guān)方程為：Y=4.449X+450.8（r=0.406，P＜0.05）。見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌患者術(shù)前血清S1P 與HA 水平的相關(guān)性Fig 1 Correlation between preoperative serum S1P and HA levels in patients with colorectal cancer

2.4 血清S1P 和HA 輔助診斷結(jié)直腸癌的效能

S1P、HA、CEA 及CA19-9 4 項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合診 斷 結(jié) 直 腸 癌 的 曲 線 下 面 積（area under curve，AUC）分別為0.871、0.642、0.694、0.593 及0.916，敏感性分別為88.60%、40.90%、56.80%、45.50% 及81.80%，特異性分別為76.50%、91.20%、79.40%、100.00%及88.20%。見表3 和圖2。

圖2 各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)和聯(lián)合輔助診斷結(jié)直腸癌的ROC 曲線Fig 2 The ROC curve for the diagnosis of colorectal cancer by individual and combined tests

表3 各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)和聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的ROC 曲線參數(shù)Tab 3 The ROC curve parameters for the diagnosis of colorectal cancer by individual and combined tests

2.5 血清S1P 和HA 輔助診斷CEA 和/或CA19-9陰性的結(jié)直腸癌的效能

S1P、HA、CEA 及CA19-9 單 獨(dú) 及 聯(lián) 合 診 斷CEA 和/或CA19-9 陰性的結(jié)直腸癌的AUC 分別為0.860、0.656、0.636、0.516 及0.897，敏 感 性 分 別 為86.50%、37.80%、62.20%、35.10%及78.40%，特異性 分 別 為76.50%、97.10%、67.60%、100.00% 及88.20%。見表4 和圖3。

圖3 各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)診斷CEA 和/或CA19-9 陰性的結(jié)直腸癌的ROC 曲線參數(shù)Fig 3 The ROC curve for the diagnosis of CEA and/or CA19-9 negative colorectal cancer by individual and combined tests

表4 各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)和聯(lián)合診斷CEA 和/或CA19-9 陰性的結(jié)直腸癌的ROC 曲線參數(shù)Tab 4 The ROC curve parameters for the diagnosis of CEA and/or CA19-9 negative colorectal cancer by individual and combined tests

2.6 結(jié)直腸癌患者各項(xiàng)指標(biāo)術(shù)前、術(shù)后變化

結(jié)直腸癌患者術(shù)后血清HA、CEA 和CA19-9 水平均顯著降低（Z=-3.381，P=0.001；Z=-5.103，P＜0.001；Z=-2.942，P=0.003）；血清S1P 水平術(shù)前、術(shù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-1.014，P=0.310）。見圖4。

圖4 結(jié)直腸癌患者各項(xiàng)指標(biāo)術(shù)前、術(shù)后變化Fig 4 Preoperative and postoperative changes of various indexes in patients with colorectal cancer

3 討論

結(jié)直腸癌是世界第四大致命癌癥，預(yù)計(jì)到2035年，全球CRC 新病患將持續(xù)增加至250 萬(wàn)［10］。目前CRC 篩查方案主要是危險(xiǎn)度評(píng)估及糞便隱血試驗(yàn)，若結(jié)果為陽(yáng)性，再行結(jié)腸鏡檢查［1］。然而糞便隱血試驗(yàn)和糞便DNA 標(biāo)志物檢測(cè)等非侵入性檢查分別存在低敏感度、高成本或低效益等不足［11］。常用的血液腫瘤標(biāo)志物如 CEA、CA19-9 也缺乏高度敏感性和臟器特異性［12］。雖然腸道鏡檢是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其屬于有創(chuàng)檢查方法，且費(fèi)用高、患者依從性差，還存在出血、穿孔的風(fēng)險(xiǎn)［11］。綜上所述，現(xiàn)有的結(jié)直腸癌早期篩查手段存在一定的局限性，迫切需要一種能高效篩查和預(yù)后判斷的新型生物標(biāo)志物或聯(lián)合檢測(cè)方法。

既往研究認(rèn)為大多數(shù)結(jié)直腸癌是由分子和遺傳改變引起［13］，近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌代謝異常與結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率呈年輕化趨勢(shì)密切相關(guān)［14］。S1P 是種多效性脂質(zhì)介質(zhì)，由鞘脂代謝產(chǎn)物鞘氨醇在鞘氨醇激酶的磷酸化作用下形成［2］。生理?xiàng)l件下，健康人血漿中S1P 濃度在300～500 nmol/L，其主要來(lái)源于紅細(xì)胞，并在免疫系統(tǒng)等方面起重要作用［15］。當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)，腫瘤細(xì)胞及其相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞以自分泌或旁分泌的方式釋放S1P 至腫瘤微環(huán)境，介導(dǎo)癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、血管及淋巴管生成等過(guò)程［2］。本研究顯示CRC 患者血清S1P水平在健康對(duì)照組、良性疾病組、結(jié)直腸癌組呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)（P＜0.001，P＜0.05），提示血清S1P 具有鑒別診斷CRC 的潛力。HA 也參與人體的新陳代謝，是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，其在結(jié)直腸癌腫瘤間質(zhì)中呈高表達(dá)［16，17］。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者血清HA 水平顯著高于健康體檢者（P＜0.05），亦初步提示HA 具有輔助診斷結(jié)直腸癌的潛能。

另外，結(jié)直腸癌組早期患者血清S1P 和HA 水平均高于晚期患者，且Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示S1P 水平與HA 水平呈正相關(guān)，這提示兩者聯(lián)合檢測(cè)在結(jié)直腸癌早期輔助診斷中可能發(fā)揮協(xié)同互補(bǔ)的優(yōu)勢(shì)。此外，血清S1P 水平在3 組之間具有顯著性差異，而血清HA 在良性疾病組和結(jié)直腸癌組之間的差異不及S1P 變化顯著（P＞0.05），這有可能與良性疾病組患者體內(nèi)存在促HA 合成的炎癥因子相關(guān)，故HA 需與其他標(biāo)志物結(jié)合以提高診斷的特異性。本研究還發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性CRC 患者的血清S1P 水平顯著降低（P＜0.05），該結(jié)果與前人在前列腺癌和結(jié)直腸癌中的結(jié)論一致［4，18］，Nunes 等［18］在研究前列腺癌時(shí)檢測(cè)了受試者的紅細(xì)胞狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于健康對(duì)照組，前列腺癌患者紅細(xì)胞S1P 合成酶的活性較低，且循環(huán)S1P 水平的降低與紅細(xì)胞中S1P 合成酶1 活性下降趨勢(shì)一致，這提示血清S1P水平下降與癌癥的早期進(jìn)展相關(guān)，并非與臨床臨床轉(zhuǎn)移狀態(tài)聯(lián)系。然而仍然有必要對(duì)其分子機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步的探討，并分析其臨床應(yīng)用價(jià)值。另外，類似的情況也出現(xiàn)在HA 的分析結(jié)果中，無(wú)脈管侵犯的CRC 患者HA 水平高于發(fā)生脈管侵犯的患者（P＜0.05），這可能是由于腫瘤微環(huán)境下細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生重構(gòu)，導(dǎo)致HA 發(fā)生降解。研究顯示HA 的降解產(chǎn)物如低分子量HA 在結(jié)直腸癌組織中異常升高，與患者的預(yù)后不良相關(guān)［19］。然而由于低分子量HA 的檢測(cè)需經(jīng)離心、過(guò)濾、抽提等復(fù)雜過(guò)程，有待于未來(lái)方法成熟及簡(jiǎn)化后，再做比較研究。

通過(guò)ROC 曲線分析，發(fā)現(xiàn)血清中S1P、HA 聯(lián)合傳統(tǒng)指標(biāo)CEA、CA19-9 檢測(cè)診斷CRC 的效能值明顯高于單一指標(biāo)，值得關(guān)注的是，在針對(duì)CEA 和/或CA19-9 陰性的CRC 的ROC 曲線分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)四項(xiàng)聯(lián)合診斷能明顯提高CRC 診斷敏感性，提示聯(lián)合S1P、HA 聯(lián)合傳統(tǒng)標(biāo)志物或可提高結(jié)直腸癌患者的檢出率。

術(shù)后動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)對(duì)于防止腫瘤復(fù)發(fā)起關(guān)鍵作用，因此我們對(duì)CRC 患者的術(shù)后血清S1P、HA 指標(biāo)也進(jìn)行了分析。既往研究表明CEA 與CA19-9 的半衰期分別為1～5 d、1～3 d［19］，故本次研究選擇CRC 患者術(shù)后3～5 d 的血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)CRC者術(shù)后3～5 d 血清HA 水平顯著降低（P＜0.001），與張等［8］研究結(jié)果一致，提示對(duì)CRC 患者術(shù)后的療效監(jiān)測(cè)具有重要意義。此外，CRC 患者血清S1P 水平在腫瘤切除手術(shù)前后差異沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這可能是S1P 較長(zhǎng)的半衰期所致。因此，相對(duì)于HA，CRC 患者術(shù)后血清S1P 水平降低可能相對(duì)延遲，這進(jìn)一步提示S1P、HA 結(jié)合檢測(cè)在CRC 患者術(shù)后療效監(jiān)測(cè)中具有互補(bǔ)性。由于本研究系單中心研究，且側(cè)重納入術(shù)前術(shù)后血清樣本配對(duì)的CRC病例，致使樣本量較小，后續(xù)將擴(kuò)大規(guī)模，聯(lián)合其他醫(yī)學(xué)中心收集更多樣本，并進(jìn)行追蹤研究。

綜上，血清S1P 與HA 在CRC 輔助診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)中展現(xiàn)出相關(guān)性和互補(bǔ)性，結(jié)合傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9，能夠在結(jié)直腸癌診斷和療效監(jiān)測(cè)中發(fā)揮一定的臨床價(jià)值。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

陳丹丹參與文章構(gòu)思與設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)收集與整理以及原稿寫作；胡嘉捷參與樣本收集、數(shù)據(jù)收集與管理、原稿審查與編輯；劉翳雯、何怡青進(jìn)行樣本檢測(cè)、數(shù)據(jù)收集與管理；楊翠霞、張國(guó)良、高鋒參與文章審查與編輯；杜艷負(fù)責(zé)文章構(gòu)思與設(shè)計(jì)，文章質(zhì)量控制與審查。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。