FCN3 調(diào)控肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和上皮間質(zhì)化

龔旋坤，包 凌，周 帥，龐 青

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年病科，安徽 蚌埠 233000；3.安徽省第二人民醫(yī)院肝膽外科，安徽 合肥 230000）

原發(fā)性肝癌是世界上第七大最常見(jiàn)的癌癥，也是癌癥死亡的第二大常見(jiàn)原因［1］。在全球范圍內(nèi)，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌的主要類型，是絕大多數(shù)肝癌確診和死亡的主要原因［2］。HCC 是世界上最常見(jiàn)的腫瘤之一，每年新發(fā)病例高達(dá)600 萬(wàn)例，這種惡性腫瘤在亞洲發(fā)病率逐年上升［3］。

凝集素和纖維膠凝蛋白（ficolin-1， -2， -3）是膠原蛋白相關(guān)的多聚體凝集素，作為模式識(shí)別分子，參與抗微生物和抗癌免疫。纖維膠凝蛋白和一些凝集素與甘露糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶形成復(fù)合物，使其能夠通過(guò)凝集素β 途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)［4］。纖維膠凝蛋白3（Ficolin-3，F(xiàn)CN3）是血漿中主要的凝集素途徑識(shí)別分子，已有研究顯示FCN3在肝和肺中高表達(dá)［5，6］。急性髓性白血病和卵巢癌的FCN3 蛋白的血清水平升高［7-9］。在中國(guó)食管癌患者中，F(xiàn)CN3 蛋白水平升高與總生存期和疾病特異性生存期延長(zhǎng)相關(guān)［10］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial- mesenchymal transformation，EMT）被 認(rèn) 為 與HCC 的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［11］。EMT 是一個(gè)推動(dòng)上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)樣特征的復(fù)雜過(guò)程。通過(guò)激活EMT 過(guò)程，上皮細(xì)胞處于細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，細(xì)胞上發(fā)生了廣泛的變化，包括細(xì)胞間黏附的喪失，這對(duì)細(xì)胞有益于細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，使它們具有入侵的能力，使它們能夠到達(dá)到遠(yuǎn)處組織［12，13］。EMT在近年來(lái)的研究更加廣泛，在腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖過(guò)程中起到了重要的作用。在上皮細(xì)胞中，E 鈣黏著蛋白（E-cadherin）是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附 的 重 要 蛋 白 質(zhì)［14］。EMT 過(guò) 程 中E-cadherin 的 表達(dá)顯著降低，降低細(xì)胞間黏附并促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，神經(jīng)鈣黏蛋白（N-cadherin）的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性有關(guān)，并且在許多腫瘤中呈陽(yáng)性表達(dá)［15］。波形蛋白（Vimentin）在來(lái)源于上皮組織的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中高度表達(dá)［16］。

關(guān)于FCN3 在HCC 進(jìn)展過(guò)程的作用仍然存在爭(zhēng)議，有中國(guó)學(xué)者認(rèn)為FCN3 通過(guò)與核糖體成熟因子結(jié)合，調(diào)節(jié)真核生物起始因子6 的核易位，進(jìn)而導(dǎo)致p53 通 路 的 激 活 來(lái) 抑 制HCC 的 增 殖［6］。然 而，F(xiàn)CN3 與HCC 侵襲、遷移及EMT 的關(guān)系，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究將通過(guò)細(xì)胞、人體肝組織樣本、動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn)三個(gè)水平來(lái)研究FCN3 對(duì)HCC 侵襲、遷移及EMT 的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì) 胞 株 HCC 細(xì) 胞 系（Huh-7、Hep3B 和SNU-449）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，永生化正常肝細(xì)胞系LO2 購(gòu)自上海通培生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 臨床樣本收集于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科2019 年1 月～2021 年12 月手術(shù)切除的所需樣本組織（60 例HCC 組織及癌旁組織），本研究通過(guò)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)倫理審批，倫理編號(hào)為：2023YJS120；并獲得參加本研究的HCC 患者及其法定監(jiān)護(hù)人的知情同意。DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基、PBS 和胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）含酚紅均購(gòu)自Gibco公司；無(wú)血清凍存液購(gòu)自新賽美公司；胎牛血清購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司、BCA 試劑盒購(gòu)自碧云天公司；傳統(tǒng)的細(xì)胞組織快速裂解液（RIPA）、PAGE 凝膠快速制備試劑盒以及三色預(yù)染蛋白Marker 購(gòu)自雅 酶 公 司；多 克 隆 抗 體 FCN3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 以 及 內(nèi) 參β-actin 均 購(gòu) 自Proteintech 公 司；Matrigel 膠 購(gòu) 自Corning 公 司，ECLplus 化 學(xué) 發(fā) 光 試 劑 盒、PVDF 膜 購(gòu) 自 Millipore 公司；慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P公司合成。

1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)分析

利用TIMER［17］數(shù)據(jù)庫(kù)（cistrome.shinyapps.io/timer）對(duì)FCN3 mRNA 在不同癌癥類型和正常組織中的表達(dá)水平進(jìn)行了深入探究。利用GEPIA［18］數(shù)據(jù) 庫(kù)（http：//gepia.cancer-pku.cn）分 析FCN3 在HCC 組織中的表達(dá)及FCN3 的表達(dá)水平與HCC 患者生存預(yù)后的關(guān)系。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

LO2 和Huh7 細(xì)胞株在添加10%的胎牛血清和1% 青鏈霉素的DMEM 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，Hep3B、SNU-449 在添加10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI-1640 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。放置在37 ℃以及添加5%的CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞長(zhǎng)至合適數(shù)量進(jìn)行傳代、凍存以及其它實(shí)驗(yàn)。

1.4 RNA 提取和qRT-PCR

使用Trizol 試劑從Huh-7、SNU-449、Hep3B 和LO2 中提取總RNA，然后根據(jù)制造商的說(shuō)明使用cDNA 制備試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行定量PCR。采用2-ΔΔCt 方法計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)水平。序列結(jié)構(gòu)為：FCN3 前引 物：5'-CCCAGTCTTTTGTGACATGGA-3'；后引 物 ： 5'-CCTGCTCTGTAGGAGGACCA-3'；GAPDH前 引 物：5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'；后 引 物：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。

1.5 免疫組織化學(xué)

將HCC 組織和配對(duì)的相鄰良性組織樣品置于二甲苯中并用梯度級(jí)乙醇水合進(jìn)行脫蠟，然后在檸檬酸鹽緩沖液中加熱以進(jìn)行抗原回收。淬滅過(guò)氧化物酶活性后，將切片與抗體在4 ℃下孵育過(guò)夜。次日將二抗在室溫下孵育1 h，然后脫水密封，最后在顯微鏡下檢查。

1.6 構(gòu)建慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞

構(gòu)建FCN3 過(guò)表達(dá)慢病毒載體PHY-028 CMV-MCS-EF1α-ZsGreen1-PGK-Puro，該 載 體 能夠穩(wěn)定感染Huh7 細(xì)胞，使細(xì)胞能夠穩(wěn)定過(guò)表達(dá)外源基因FCN3，該組細(xì)胞后稱OE-Huh7，另一株細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載慢病毒該組細(xì)胞后稱NC-Huh-7，并用qRT-PCR、WB 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.7 CCK-8 試驗(yàn)

取穩(wěn)轉(zhuǎn)后的OE-Huh7 和NC-Huh7 細(xì)胞株進(jìn)行消化離心，以每孔4 000 個(gè)細(xì)胞種入96 孔板放入恒溫 箱 進(jìn) 行 培 養(yǎng)，分 別 在0 h、24 h、48 h、72 h 加 入CCK-8 試劑，放回恒溫箱進(jìn)行孵育2～3 h，使用酶標(biāo)儀以波長(zhǎng)450 nm 檢測(cè)NC-Huh7 和OE-Huh7 細(xì)胞的光密度（optical density，OD）值。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

待細(xì)胞長(zhǎng)滿后消化離心計(jì)數(shù)，將2×106個(gè)細(xì)胞種在6 孔板上放入恒溫箱培養(yǎng)，待第2 天細(xì)胞長(zhǎng)滿后用無(wú)菌槍頭在孔內(nèi)均勻劃痕，然后進(jìn)行拍照，拍完照后繼續(xù)放入恒溫箱培養(yǎng)，過(guò)24 h 后取出繼續(xù)拍照。并通過(guò)Image J 軟件測(cè)定劃痕愈合率/細(xì)胞遷移率（劃痕愈合率=（0 h 的劃痕面積-24 h 的劃痕面積）/ （0 h 的劃痕面積）×100%）。

1.9 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)

取處理好的NC-Huh-7 和OE-Huh-7 細(xì)胞，消化離心后用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，以1×104個(gè)/孔的密度移植到Transwell 小室中。24 h 后，取上清，PBS 洗滌3 次，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，拍照。

1.10 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)

用密度為1×104/孔的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸消化下來(lái)的各組細(xì)胞。將稀釋后的基質(zhì)膠（1∶8）加入Transwell 小室，37 ℃溫箱靜置1 h。每孔加入100 μL 重懸好的細(xì)胞，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，去除上清，固定染色。

1.11 Western Blot 實(shí)驗(yàn)

待細(xì)胞長(zhǎng)滿之后，使用Ripa 提取蛋白；利用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后完成定量進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，將蛋白樣本加入SDS-PAGE 凝膠電泳分離條帶。然后將目的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）上，用TBST 洗膜3 遍，每遍10 min，再使用牛奶封閉2 h，封閉完繼續(xù)洗膜3 遍，孵化一抗4 ℃過(guò)夜（一抗稀釋比為：FCN3 1∶500，Vimentin 1∶6 000，N-cadherin 1∶5 000，E-cadherin 1∶50 000，β-actin 1∶5 000。第2 天洗膜3 遍，孵化二抗常溫2 h（二抗稀釋比為1∶5 000）。孵化完后洗膜3 遍加入ECL-Plus 試劑盒發(fā)光，Bio-rad 成像儀器檢測(cè)信號(hào)。

1.12 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

裸鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，10 只BALB/c 裸鼠隨機(jī)分為兩組，每組5 只，分別為NC 組和OE 組。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NC-Huh-7和OE-Huh-7 細(xì)胞分別給對(duì)應(yīng)組皮下注射到雄性BALB/c 裸鼠的左前腋下，繼續(xù)飼養(yǎng)，從第8 天開(kāi)始，然后分別在 第11 天、第15 天、第18 天、第22 天收集一次數(shù)據(jù)（裸鼠質(zhì)量、瘤體長(zhǎng)短徑）。斷頸法處死裸鼠，剝?nèi)×鲶w，測(cè)量瘤體大小并稱重。腫瘤體積（ mm3） = 0.5×長(zhǎng)徑×短徑2。使用電子天平稱量腫瘤，并計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)曲線。［飼養(yǎng)過(guò)程符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合相關(guān)保護(hù)法且本研究獲得了蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批，批次號(hào)為：倫動(dòng)科批字（2021）第098 號(hào)］

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析和圖表用Prism8.0（graphpad software），數(shù)據(jù)均以（±s），t檢驗(yàn)用于兩組間計(jì)量資料比較，單因素方差分析（ANOVA）用于多組間計(jì)量資料比較。P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FCN3 在不同腫瘤類型中的表達(dá)及與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系

Timer 數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)CN3 在多種癌癥中表達(dá)量低于正常組織，如乳腺浸潤(rùn)癌（BRCA）、膽管癌（CHOL）、結(jié)腸癌（COAD）、肝細(xì)胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）等（P＜0.05）。其中FCN3 在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖1A）。為了進(jìn)一步探究FCN3 與HCC 患 者 預(yù) 后 的 關(guān) 系，利 用GEPIA 數(shù) 據(jù)庫(kù)分析FCN3 在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，（圖1B），F(xiàn)CN3 在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)量低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析FCN3 的表達(dá)水平與HCC 患者生存預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，高表達(dá)的FCN3 在HCC 患者有更長(zhǎng)的總體生存時(shí)間（logrankP=0.032）（圖1C）。

圖1 FCN3 在不同腫瘤類型中的表達(dá)及與HCC 患者預(yù)后的關(guān)系Fig 1 Expression of FCN3 in different tumor types and its relationship with prognosis of HCC patients

2.2 FCN3 在HCC 細(xì)胞和組織中的表達(dá)

選取正常肝細(xì)胞系LO2 和3 個(gè)HCC 細(xì)胞系Huh-7、Hep-3B 和SNU-449 和 進(jìn) 行qRT-PCR 實(shí) 驗(yàn)。結(jié)果表明，與正常肝細(xì)胞相比，HCC 細(xì)胞系Huh-7、Hep-3B 和SNU-449 的FCN3 mRNA 表達(dá)水平顯著降低（圖2A）， 結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001 2；P=0.002 7；P=0.003 6）。采用免疫組化檢測(cè)FCN3在HCC 中的表達(dá)（圖2B），用Image J 和Graphpad Prism 分析HCC 和癌旁組織的陽(yáng)性細(xì)胞比例（圖2C），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014 1）。

圖2 FCN3 在HCC 細(xì)胞和組織中的表達(dá)Fig 2 Expression of FCN3 in HCC cells and tissues

2.3 構(gòu)建慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株及轉(zhuǎn)染效率測(cè)定

利用qRT-PCR（圖3A）和WB（圖3B）檢測(cè)過(guò)表達(dá)FCN3 的Huh-7 穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞中FCN3 的過(guò)表達(dá)效率，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載病毒的NC-Huh-7 組相比，OE-Huh-7 組中的FCN3 表達(dá)量升高（P=0.000 1）（圖3C）。

圖3 構(gòu)建慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株及轉(zhuǎn)染效率測(cè)定Fig 3 Construction of lentivirus stable cell line and determination of transfection efficiency

2.4 過(guò)表達(dá)FCN3 抑制HCC 細(xì)胞的增殖遷移

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與NC-Huh-7 組相比，OE-Huh-7 組在24 h、48 h 和72 h 增殖明顯減弱（圖4A），（P=0.039；P=0.000 9；P=0.000 5）。為 了探究FCN3 對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響，又進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4B）表明與NC-Huh-7 組相比，OE-Huh-7 組遷移能力明顯減弱（圖4C）（P=0.000 03）；Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4D）表明與NC-Huh-7 組相比，OE-Huh-7組遷移能力明顯減弱（圖4E）（P=0.0437），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 過(guò)表達(dá)FCN3 抑制HCC 細(xì)胞的增殖遷移Fig 4 Overexpression of FCN3 inhibited the proliferation and migration of HCC cells

2.5 過(guò)表達(dá)FCN3 抑制HCC 細(xì)胞的侵襲

為了探究FCN3 對(duì)HCC 細(xì)胞侵襲的影響，進(jìn)行了Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5A）表明，與NC-Huh-7 組相比，OE-Huh-7 組遷移能力明顯減弱（圖5B）（P=0.000 2），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 過(guò)表達(dá)FCN3 抑制HCC 細(xì)胞的侵襲Fig 5 Overexpression of FCN3 inhibited the invasion of HCC cells

2.6 FCN3 對(duì)HCC 細(xì)胞EMT 的影響

通過(guò)WB 探究FCN3 表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞EMT 發(fā)生的影響（圖6A），結(jié)果顯示，與NC-Huh-7 組相比，OE-Huh-7 上皮組織標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)水平升高（P=0.026 6），間質(zhì)組織標(biāo)志物N-cadherin 和Vimentin 表 達(dá) 水 平 降 低（圖6B）（P=0.031 6；P=0.031 3）。由此可見(jiàn)FCN3 抑制HCC 細(xì)胞EMT。

圖6 FCN3 對(duì)HCC 細(xì)胞EMT 的影響Fig 6 Effect of FCN3 on EMT of HCC cells

2.7 FCN3 抑制HCC 體內(nèi)增殖

觀察記錄裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況（圖7A）， 并記錄瘤體體積， 結(jié)果顯示OE-Huh-7 組小鼠瘤體體積明顯小于NC-Huh-7 組（圖7B）。根據(jù)細(xì)胞成瘤能力，22 天后剝離瘤體（圖7C），并記錄瘤體重量， 結(jié)果顯示OE-Huh-7 組小鼠瘤體重量明顯低于NC-Huh-7組（圖7D）（P=0.025）。這些結(jié)果表明FCN3 抑制HCC 體內(nèi)增殖。

圖7 FCN3 抑制HCC 體內(nèi)增殖Fig 7 Inhibition of FCN3 on proliferation of HCC in vivo

3 討論

肝細(xì)胞癌（HCC）是一種快速生長(zhǎng)的癌癥類型，其特征是高度侵襲性和轉(zhuǎn)移能力［19］。由于HCC 的高發(fā)病率、頻繁復(fù)發(fā)、高死亡率和當(dāng)前治療方案的局限性，該疾病被認(rèn)為是主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題［20］。最新研究表明，F(xiàn)CN3 在HCC 細(xì)胞和組織的mRNA和蛋白表達(dá)水平上均顯著下調(diào)，提示FCN3 具有抑癌 作 用［6］。本 研 究 進(jìn) 一 步 發(fā) 現(xiàn)FCN3 在HCC 細(xì) 胞和組織中低表達(dá)。還構(gòu)建了慢病毒OE-Huh-7 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，通過(guò)CCK-8 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FCN3 可抑制HCC增殖，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FCN3 還可抑制HCC 遷移和侵襲。

隨著上皮表型的關(guān)鍵標(biāo)記物E-cadherin 表達(dá)的喪失，以及間充質(zhì)標(biāo)記物如N-cadherin 和Vimentin蛋白的表達(dá)，癌細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)［21］。故推測(cè)FCN3 是否也抑制了EMT 的N-cadherin 和Vimentin 的表達(dá)，而促進(jìn)E-cadherin 表達(dá)，然目前尚未見(jiàn)FCN3 參與調(diào)節(jié)HCC 的EMT 過(guò)程的機(jī)制研究。首次探究了FCN3 對(duì)肝癌細(xì)胞EMT 的影響，過(guò)表達(dá)FCN3 后可以促進(jìn)上皮組織標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)上調(diào)，下調(diào)間質(zhì)組織標(biāo)志物N-cadherin 和Vimentin蛋白，這表明FCN3 抑制了HCC 的EMT 過(guò)程。

綜上所述，本研究闡明了FCN3 抑制HCC 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲。此外，本研究首次證明FCN3影響HCC 細(xì)胞的EMT， 這些發(fā)現(xiàn)將進(jìn)一步明確FCN3 在HCC 中的作用及機(jī)制，為HCC 的治療提供新的策略。然而，這項(xiàng)研究仍有局限性，研究中的臨床數(shù)據(jù)是從公共數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的，因而后續(xù)將進(jìn)一步收集本中心HCC 患者資料，隨訪并分析5 年生存率，同時(shí)深入研究FCN3 影響HCC 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

龔旋坤：參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。包凌：參與部分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)檢索及論文撰寫。周帥：參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指導(dǎo)。龐青：參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、論文撰寫指導(dǎo)。

所有人聲明不存在利益沖突關(guān)系。