棉花CMS-D2和CMS-D8不育系線粒體全基因組比較分析

葛李爽 馮娟娟 張夢 郭立平 戚廷香 張學(xué)賢 李永旗 唐會妮 喬秀琴 邢朝柱 吳建勇

摘要：【目的】探究哈克尼西棉不育胞質(zhì)（CMS-D2）和三裂棉不育胞質(zhì)（CMS-D8）的不育系線粒體基因組之間的序列結(jié)構(gòu)差異，為篩選鑒定不育相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。【方法】根據(jù)D2A和D8A這2個不育系的線粒體基因組測序組裝結(jié)果，使用Synteny and Rearrangement Identifier（SyRI）軟件鑒定結(jié)構(gòu)變異，用Plotsr可視化分析包含共線性及非共線性區(qū)域的重組變異位點。以D8A線粒體基因組注釋結(jié)果為參考，用D2A線粒體基因組注釋的開放閱讀框（open reading frame， ORF）編碼的氨基酸序列進(jìn)行tblastn比對，篩選出D2A線粒體基因組中特有的ORF，并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）驗證、相對表達(dá)量分析和生物信息學(xué)分析?！窘Y(jié)果】D2A和D8A這2個不育系線粒體基因組之間存在2個部分重疊且相鄰的倒易位區(qū)域。在D2A中發(fā)現(xiàn)17個特異的ORF，PCR驗證了D2A中存在的6個特異ORF（orf114e、orf121b-1、orf121b-2、orf138b-2、orf186a-2和orf317a-2）。3～4 mm花蕾中orf121b-1和orf121b-2的相對表達(dá)量較高。orf114e、orf186a-2和orf317a-2具有典型的跨膜結(jié)構(gòu)域和嵌合基因結(jié)構(gòu)，符合不育基因的部分特征?！窘Y(jié)論】D2A和D8A線粒體基因組間存在2個相鄰的倒易位區(qū)域。D2A中存在6個特異的ORF，其中orf114e、orf186a-2和orf317a-2可能與棉花CMS-D2孢子體敗育有關(guān)。

關(guān)鍵詞：棉花；細(xì)胞質(zhì)雄性不育；線粒體基因組；孢子體不育；配子體不育；開放閱讀框

Comparative analysis of whole mitochondrial genomes between CMS-D2 and CMS-D8 sterile lines in cotton

Abstract： [Objective] This research aims to investigate the sequence structural differences between the mitochondrial genomes of Gossypium harknessii sterile cytoplasm （CMS-D2） and G. trilobum sterile cytoplasm （CMS-D8）， which can establish a foundation for the screening and identification of sterility-related genes. [Methods] Based on the sequencing and assembled results of the mitochondrial genome of D2A and D8A， the Synteny and Rearrangement Identifier （SyRI） software was used to identify structural variations， and recombination variation sites containing collinear and non-collinear regions were visualized with Plotsr. The annotation results of the D8A mitochondrial genome were utilized as a reference， and the amino acid sequences encoded by the open reading frame （ORF） annotated in the D2A mitochondrial genome were used for tblastn comparison to screen out the unique ORF in the D2A mitochondrial genome. Subsequently， polymerase chain reaction （PCR） verification， relative expression level analysis， and bioinformatics analysis were performed. [Results] The mitochondrial genomes of the sterile lines D2A and D8A had two partially overlapped and adjacent inverted translocation regions. Seventeen specific ORF were found in D2A mitochondrial genome， and PCR verified the presence of 6 specific ORF （orf114e， orf121b-1， orf121b-2， orf138b-2， orf186a-2， and orf317a-2） in D2A. The relative expression levels of orf121b-1 and orf121b-2 were higher in 3-4 mm flower buds. orf114e， orf186a-2， and orf317a-2 have typical transmembrane domains and chimeric gene structures， which are consistent with some characteristics of sterility genes. [Conclusion] Two adjacent inverted translocation regions were identified between the mitochondrial genomes of D2A and D8A. There are six specific ORF in D2A， among which orf114e， orf186a-2， and orf317a-2 may be potentially related to sporophytic abortion of CMS-D2.

Keywords： cotton; cytoplasmic male sterility; mitochondrial genome; sporophyte sterility; gametophyte sterility; open reading frame

細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility， CMS）是指雌蕊正常發(fā)育，雄蕊喪失正常授粉功能的現(xiàn)象，不僅可以作為植物雜種優(yōu)勢利用的重要育種工具，也為研究細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞核互作提供了重要材料[1]。目前，已發(fā)現(xiàn)至少150種植物中存在CMS現(xiàn)象[2]。利用CMS進(jìn)行三系（不育系、保持系和恢復(fù)系）雜交育種具有操作簡便、種子純度高、成本較低等特點。因此三系法逐漸成為培育雜交種最便捷、有效的方法之一[3]，已在水稻[4]、玉米[5]、甘藍(lán)型油菜[6]等作物中廣泛應(yīng)用。

CMS是線粒體基因與核基因相互作用的結(jié)果[7]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化代謝的主要場所，能夠為細(xì)胞的生命活動提供能量，自身含有編碼部分蛋白質(zhì)的遺傳物質(zhì)。不同物種之間線粒體基因組（mitochondrial genome， mtDNA）大小具有較大差異，動物細(xì)胞中線粒體基因組一般僅為10～39 kb，而植物線粒體基因組可達(dá)100 kb～11 Mb。植物線粒體基因組含有大量的重復(fù)序列并具有整合其他基因組DNA序列的特性[8]。大量研究表明，CMS一般是由線粒體基因組結(jié)構(gòu)異常引起，由于其自身基因組頻繁發(fā)生重組與重排，易產(chǎn)生嵌合的開放閱讀框（open reading frame， ORF），形成嵌合基因（新ORF），其編碼產(chǎn)物能夠通過不同形式影響線粒體的正常功能[9]。例如，在水稻CMS-BT中，嵌合基因orf79可以編碼毒性蛋白，通過與線粒體內(nèi)膜結(jié)合影響線粒體的功能，從而引起花粉敗育[10]。在玉米CMS-C中，嵌合基因atp6c編碼的蛋白通過與ATP6競爭作用，影響F1Fo-ATP合酶的組裝，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜質(zhì)子過量積累，引發(fā)活性氧（reactive oxygen species， ROS）爆發(fā)、絨氈層過早程序性死亡，進(jìn)而導(dǎo)致花粉敗育[11]。

近年來，不育基因的挖掘一般是通過對線粒體基因組的序列進(jìn)行比對，篩選出符合不育基因特征的ORF作為候選基因。大多數(shù)不育基因包含3個特征：（1）線粒體嵌合ORF；（2）至少具有1個跨膜結(jié)構(gòu)域；（3）在不育系中特有或與其同核異質(zhì)的保持系存在序列差異[12]。利用這種方法已經(jīng)在許多作物中挖掘出一些CMS基因。例如，通過在D1-CMS型水稻中進(jìn)行線粒體基因組比對，發(fā)現(xiàn)了不育基因orf182，實驗驗證發(fā)現(xiàn)orf182通過降低腺苷三磷酸（adenosine triphosphate， ATP）生成導(dǎo)致花粉敗育[13]。在大豆中，發(fā)現(xiàn)了雄性不育候選基因orf178和orf261[14]。研究人員通過對棉花CMS-D2線粒體基因組進(jìn)行組裝，并與已公布的陸地棉（Gossypium hirsutum）CMS中保持系線粒體基因組比對分析[15]，篩選出CMS-D2中的雄性不育候選基因orf610a，并對其功能進(jìn)行了初步驗證[16]。

花粉育性是由孢子體基因型或配子體基因型決定，由此CMS可分為孢子體不育和配子體不育共2種類型[17]。孢子體不育類型的育性受細(xì)胞核基因和細(xì)胞質(zhì)基因控制，雜種1代可育花粉率為100%；配子體不育則是由配子體本身的基因型控制，雜種1代可育花粉率為50%[18]。哈克尼西棉（G. harknessii）胞質(zhì)不育系CMS-D2屬于孢子體不育，是目前棉花三系雜交種生產(chǎn)中的主要不育類型。三裂棉（G. trilobum）胞質(zhì)不育系CMS-D8屬于配子體不育，敗育徹底且穩(wěn)定遺傳，CMS-D8三系材料是培育三系雜交種重要的種質(zhì)資源。研究表明，許多導(dǎo)致植物CMS的線粒體基因的功能可以被1個或多個核基因編碼的產(chǎn)物抑制或消除，這些核基因被稱為恢復(fù)基因（Rf）[19]。CMS-D2與CMS-D8對應(yīng)恢復(fù)系攜帶的恢復(fù)基因分別為Rf1[20]和Rf2[21]，其中Rf1可以恢復(fù)CMS-D2和CMS-D8不育系的育性，Rf2只可以恢復(fù)CMS-D8不育系的育性。CMS-D8與CMS-D2這2種敗育類型及對應(yīng)的恢復(fù)基因的恢復(fù)功能的差異可能與線粒體基因組結(jié)構(gòu)變異及特異的ORF有關(guān)。目前，關(guān)于植物孢子體不育和配子體不育不同敗育類型的線粒體組學(xué)分析報道較少。本研究通過對D2A和D8A這2種不同棉種胞質(zhì)不育系線粒體基因組進(jìn)行比對分析，揭示了D2A和D8A線粒體基因組的結(jié)構(gòu)差異，在線粒體基因組學(xué)層面比較分析了2種不同類型的不育系在進(jìn)化過程中產(chǎn)生的差異特征。此外，通過對特異ORF的分析及驗證，探究線粒體ORF和不同敗育類型的潛在關(guān)系，為進(jìn)一步篩選配子體敗育和孢子體敗育相關(guān)的線粒體ORF奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為2個不同類型的棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其中D2A為哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系（CMS-D2），D8A為三裂棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育系（CMS-D8），詳細(xì)的材料創(chuàng)制過程及來源參見本課題組前期的研究[22-24]。D2A和D8A材料均于2023年4月下旬種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場試驗基地（河南省安陽縣），田間管理措施同當(dāng)?shù)仄胀尢铩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 提取總DNA。在苗期，取D2A和D8A的葉片，使用改良后的十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide， CTAB）法[25]提取總DNA，通過紫外分光光度計測量DNA濃度，并稀釋至相同濃度。

1.2.2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄。在田間分別選取20株D2A和D8A，取其3～4 mm花蕾，在液氮中冷凍，于－80 ℃保存?zhèn)溆?。?00 mg花蕾在液氮中迅速研磨成粉末，使用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure Plant Plus Kit試劑盒進(jìn)行總RNA提取。使用1.2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的瓊脂糖凝膠電泳對提取的RNA進(jìn)行純度檢測，同時使用NanoDrop 2000超微量紫外可見分光光度計測定RNA在不同波長下的吸光度，測定值應(yīng)滿足1.8≤OD260/OD280≤2.2、OD260/OD230≥1.8。檢測后選取高純度RNA使用PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒（TaKaRa，北京）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA稀釋10倍后備用。

1.2.3 線粒體基因組測序和組裝 。本課題組已經(jīng)完成CMS-D2和CMS-D8不育系的線粒體基因組的測序、組裝和基因注釋，具體分析方法參照參考文獻(xiàn)[16]。其中D2A線粒體基因組組裝測序結(jié)果已經(jīng)在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）的序列讀取檔案（SRA數(shù)據(jù)庫）中公開，登錄號：SRR17406254[15]。D8A線粒體基因組的測序及組裝結(jié)果暫未公開。

1.2.4 D2A和D8A線粒體基因組結(jié)構(gòu)分析和驗證。CMS現(xiàn)象的產(chǎn)生與線粒體基因組緊密相關(guān)。為探索D2A、D8A這2種不育胞質(zhì)線粒體基因組的差異，本研究利用MUMmer軟件（版本MUMmer/4.0.0beta2，https：//github.com/mummer4/mummer/releases，nucmer全局比對參數(shù)： --max-match -c 100 -b 500 -l 50 refgenome qrygenome，delta-filter過濾參數(shù)：-m -i 90 -l 100）以D8A線粒體基因組作為參考，將D2A線粒體基因組進(jìn)行比對，比對結(jié)果使用Synteny and Rearrange-ment Identifier（SyRI）軟件（https：//github.com/schneebergerlab/syri）鑒定結(jié)構(gòu)變異，并用Plotsr軟件（https：//github.com/schneebergerlab/plotsr）進(jìn)行可視化分析。線粒體基因組結(jié)構(gòu)分析包含共線性及非共線性區(qū)域的重組變異位點，對經(jīng)分析預(yù)測出的D2A的結(jié)構(gòu)變異區(qū)域INV4和INV5，在D2A線粒體基因組上的2個邊界位點上下游共400 bp區(qū)域（INV4-1、INV4-2、INV5-1、INV5-2）設(shè)計擴(kuò)增引物（表1），以D2A、D8A的葉片DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR），用瓊脂糖凝膠電泳方法進(jìn)行驗證。

1.2.5 D2A中特異ORF的預(yù)測、分析及驗證。在D8A注釋的ORF數(shù)據(jù)庫中，利用BLAST軟件（版本BLAST+/2.9.0）的tblastn（參數(shù) -outfmt 7，其余參數(shù)均為默認(rèn)值）對已經(jīng)注釋的D2A線粒體基因組的ORF編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對分析。根據(jù)比對結(jié)果篩選D2A中特異的ORF。使用TMHMM Server 2.0軟件（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）對D2A中特異的ORF進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，利用NCBI網(wǎng)站的BLAST在線分析差異的ORF是否為嵌合ORF，進(jìn)一步分析D2A線粒體基因組中特異的ORF是否具有植物不育基因的特征。使用DNAMAN軟件對D2A中特異的17個ORF全長序列設(shè)計引物（表2），并通過PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳方法進(jìn)行驗證。

1.2.6 相對表達(dá)量分析。提取D2A 3～4 mm花蕾RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此作為模版用于實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR）。RNA提取和反轉(zhuǎn)錄方法同1.2.2。在NCBI中設(shè)計特異引物（表3），以GhHIS3作為內(nèi)參基因，使用TransStart○R? Top Green qPCR SuperMix試劑盒（全式金，北京）進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體積為20 μL，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)。試驗設(shè)計3次技術(shù)重復(fù)。所用儀器為Mastercycler ep realplex（Eppendorf，德國）。用 2-ΔΔCt法計算目的ORF的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 D2A和D8A線粒體基因組重排

以D8A線粒體基因組作為參考，對D2A線粒體基因組進(jìn)行共線性分析，結(jié)果表明D2A線粒體基因組在425 896～502 639 bp區(qū)間內(nèi)存在2處倒易位區(qū)域，分別為INV4和INV5，INV4和INV5這2個區(qū)域相鄰且部分重疊，重疊區(qū)長度為9 122 bp（圖1A）。INV4和INV5在D2A中存在4個邊界位點，分別在基因組425 896 bp、457 648 bp、466 769 bp和502 639 bp處。在4個邊界位點上下游（INV4-1、INV4-2、INV5-1、INV5-

2，其中INV4-1、INV5-2在D2A和D8A共線性區(qū)域，INV4-2、INV5-1在非共線性區(qū)域）設(shè)計引物，INV4-1為D2A中425 896 bp處上下游400 bp區(qū)域，INV4-2為D2A中466 769 bp處上下游400 bp區(qū)域，INV5-1為D2A中457 648 bp處上下游400 bp區(qū)域，INV5-2為D2A中502 639 bp處上下游400 bp區(qū)域。在D2A和D8A的DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在D2A和D8A中均擴(kuò)增出INV4-1和INV5-2，在D2A中擴(kuò)增出INV4-2和INV5-1，而D8A中未擴(kuò)增出INV4-2和INV5-1（圖1B）。這說明INV4-1、INV5-2在D2A和D8A中同時存在，而INV4-2、INV5-1僅在D2A中存在。結(jié)合以上分析結(jié)果，可以初步驗證D2A和D8A線粒體基因組結(jié)構(gòu)存在2個倒易位變異。

2.2 D2A和D8A線粒體基因組差異ORF分析

通過對D2A和D8A線粒體基因組組裝、注釋可知，D2A線粒體基因組大小為634 036 bp ，D8A線粒體基因組大小為634 407 bp，D2A和D8A的線粒體基因組分別注釋到194個和154個ORF。D2A和D8A的線粒體基因組在大小上相差較小，但D2A比D8A多40個ORF。為探索孢子體不育系與配子體不育系的線粒體基因組之間存在的差異，以D8A線粒體基因組注釋結(jié)果為參照，用注釋后的D2A線粒體基因組ORF編碼的氨基酸序列進(jìn)行tblastn比對，分析D2A中特異的ORF。結(jié)果顯示D2A中存在17個特異的ORF（編碼的氨基酸數(shù)量相同但序列不同），分別為orf106b、orf109a、orf109b、orf111a、orf111c、orf114e、orf119b-1、orf119b-2、orf119c、orf121b-1、orf121b-2、orf138b-2、orf186a-2、orf208a、orf228a、orf270b和orf317a-2。研究表明，在已知基因附近的ORF可能與上游或者下游基因共同轉(zhuǎn)錄[19]。分析發(fā)現(xiàn)，在已知基因上游或者下游的ORF有4個（orf114e、orf186a-2、orf228a和orf317a-2），有可能與已知基因協(xié)同轉(zhuǎn)錄。由蛋白編碼基因的同源序列組成的嵌合ORF有2個（orf208a和orf186a-2）。具有跨膜結(jié)構(gòu)域的ORF有6個（orf114e、orf119b-1、orf119b-2、orf186a-2、orf208a和orf317a-2）（表4）。

利用NCBI數(shù)據(jù)庫（NR庫）和Swiss-Prot對測序結(jié)果進(jìn)行注釋，D2A線粒體基因組中5個特異的ORF即orf111a、orf114e、orf121b-1、orf121b-2和orf317a-2有功能注釋信息。其中orf111a編碼細(xì)胞色素b559亞基α，orf114e編碼YMF16蛋白，orf121b-1、orf121b-2和orf317a-2均編碼未知蛋白（表5）。1個完整的基因包括ORF序列以及非編碼序列，ORF作為完整基因序列的一部分，可作為1個潛在蛋白編碼基因的指示器，但是預(yù)測的ORF并不一定是編碼蛋白，且部分ORF目前暫未注釋到功能信息。

將D2A中特異的17個ORF在D2A和D8A的3～4 mm花蕾cDNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證，結(jié)果表明D2A中可擴(kuò)增出6個ORF（orf114e、orf121b-1、orf121b-2、orf138b-2、orf186a-2和orf317a-2），其中orf114e、orf138b-2和orf317a-2的擴(kuò)增條帶較弱，可能與其表達(dá)量較低有關(guān)，而在D8A中未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶（圖2）。4個ORF（orf121b-1、orf121b-2、orf138b-2和orf317a-2）位于D2A線粒體基因組倒易位區(qū)域。利用qRT-PCR分析這6個差異ORF在D2A 3～4 mm花蕾中的相對表達(dá)量，結(jié)果表明其中orf121b-1的表達(dá)量最高，orf121b-2的表達(dá)量次之，orf186a-2、orf317a-2和orf138b-2的表達(dá)量較低，orf114e的表達(dá)量最低（圖3）。

經(jīng)過對組裝注釋好的D2A線粒體基因組分析發(fā)現(xiàn)，orf114e是mttB基因序列的一部分，并且存在2個跨膜結(jié)構(gòu)域，其中mttB編碼膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（圖4A、D）。orf186a-2位于atp8基因下游565 bp，與rps3基因形成嵌合基因，并且具有1個跨膜結(jié)構(gòu)域，其中atp8編碼ATP合成酶，rps3編碼核糖體蛋白（圖4B、D）。orf317a-2位于atp1基因（編碼ATP合成酶）上游659 bp，存在3個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖4C～D）。orf114e、orf186a-2和orf317a-2這3個ORF均具有CMS不育基因的部分特征。

3 討論

植物線粒體基因組存在廣泛的重復(fù)序列，易產(chǎn)生基因重組和重排現(xiàn)象[26]。Wang等[27]利用MUMmer對煙草的不育系和保持系的線粒體基因組進(jìn)行了比對分析，發(fā)現(xiàn)了不育系和保持系線粒體基因組的高度同源區(qū)域，并分析了不育系線粒體基因組中存在的易位、倒位、倒易位變異現(xiàn)象。本研究使用MUMmer將D2A和D8A這2個不同胞質(zhì)的線粒體基因組進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)D2A、D8A線粒體基因組在結(jié)構(gòu)上存在差別，與前人研究結(jié)果相似，推測棉花D2A與D8A的不育類型不一致可能與倒易位變異有一定的關(guān)系。同時，本研究在2個線粒體基因組比對的基礎(chǔ)上，通過PCR擴(kuò)增邊界序列進(jìn)行初步驗證，進(jìn)一步證實D2A和D8A線粒體基因組之間存在2個具有重疊區(qū)且相鄰的倒易位區(qū)域。

大量研究表明，CMS中不育系和保持系線粒體基因組結(jié)構(gòu)的差異可能會導(dǎo)致CMS新基因（ORF）的產(chǎn)生。例如，在芹菜中，以W99A為參照進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)變異分析，發(fā)現(xiàn)W99A和W99B線粒體基因組之間存在23個易位區(qū)、5個倒位區(qū)和21個倒易位區(qū)。W99A的特異區(qū)域存在15個ORF，根據(jù)不育基因特征進(jìn)行篩選，最終確定orf768a為芹菜W99A中雄性不育候選基因[28]。同樣，在辣椒CMS-138A線粒體基因組的特異區(qū)域的35個ORF中，根據(jù)不育基因特征篩選出orf300a和orf314a這2個候選基因[29]。本研究以D8A線粒體基因組作為參考，對D2A線粒體基因組進(jìn)行比對分析，在D2A中預(yù)測到17個特異的ORF。通過PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果表明D2A中存在6個特異的ORF，其中有4個ORF（orf121b-1、orf121b-2、orf138b-2和orf317a-

2）位于倒易位區(qū)域，可能為線粒體結(jié)構(gòu)變異產(chǎn)生的新基因。以往研究表明CMS不育基因大部分為嵌合基因，與電子傳遞鏈相關(guān)基因協(xié)同轉(zhuǎn)錄，含有1個或多個跨膜結(jié)構(gòu)域[30]。本研究經(jīng)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，D2A線粒體基因組中3個ORF即orf114e、orf186a-2和orf317a-2位于已知功能基因附近，可能與其上下游基因協(xié)同轉(zhuǎn)錄，并且3個ORF均存在跨膜結(jié)構(gòu)域，這3個特異的ORF均符合不育基因的部分特征。本研究的結(jié)果豐富了CMS-D2不育基因的候選基因，但其在CMS產(chǎn)生過程中的功能及其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

本研究利用課題組已有的D2A與D8A的線粒體基因組，通過MUMmer與SyRI對線粒體基因組序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)D2A和D8A存在2個具有重疊區(qū)域的相鄰倒易位區(qū)域，分別為INV4和INV5。在D2A和D8A這2個材料中通過PCR擴(kuò)增INV4、INV5邊界序列初步證明D2A和D8A線粒體基因組在結(jié)構(gòu)上存在差異。以D8A線粒體基因組為參考，比對分析發(fā)現(xiàn)D2A線粒體基因組中存在17個特異的ORF，并且PCR擴(kuò)增出D2A中6個特異ORF，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其中4個ORF（orf121b-1、orf121b-2、orf138b-2和orf317a-2）位于INV4和INV5區(qū)域內(nèi)，可能為線粒體結(jié)構(gòu)變異產(chǎn)生的新基因。通過跨膜結(jié)構(gòu)域與嵌合基因分析，D2A中特有的orf114e、orf186a-2和orf317a-2符合不育基因的部分特征，可能與CMS-D2孢子體不育有關(guān)。

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