雷帕霉素-深共晶溶劑滴眼液對小鼠同種異體角膜移植排斥反應的抑制作用及其機制

楊洋 黃慈欣 曾繁星 孫亞如 韋超 王紅衛(wèi) 高華

［摘要］ ?目的 ?探討雷帕霉素（RAPA）-深共晶溶劑（DES）滴眼液對小鼠同種異體角膜移植免疫排斥反應的抑制作用及其機制。

方法采用CCK-8實驗檢測10種DES對人角膜上皮細胞系（HCECs）細胞活性的影響，選擇細胞活性顯著高于對照組的DES檢測其表征，篩選最適宜DES，并通過BALB/c小鼠和新西蘭大白兔對最適宜DES進行生物相容性評價。將小鼠隨機分為正常組、磷酸鹽溶液（PBS）組、DES組和RAPA-DES組。正常組正常飼養(yǎng)小鼠，PBS組、DES組和RAPA-DES組小鼠右眼行角膜移植術(shù)，術(shù)后小鼠右眼分別滴加PBS、DES和RAPA-DES溶液，隔天通過裂隙燈觀察角膜移植物的存活狀況，評估角膜移植物的生存百分比并繪制角膜移植物生存曲線。于移植術(shù)后第7、16天，取小鼠眼球，蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察角膜水腫和炎癥浸潤情況。于移植術(shù)后第16天，經(jīng)實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測各組小鼠角膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12α和IL-17α mRNA的表達水平。并通過蛋白質(zhì)免疫印跡試驗（WB）檢測各組小鼠角膜組織中IL-6和IL-17α蛋白表達水平。

結(jié)果CCK-8實驗顯示，與對照組比較，DES-1和DES-2組細胞的細胞活性顯著升高（P<0.05），DES-1組細胞的細胞活性較DES-2組高（P<0.05），且DES-1的黏度低于DES-2，pH值更接近于7.4，因此DES-1為最適宜DES，應用于后續(xù)實驗。生物相容性評價結(jié)果顯示，DES-1對小鼠和新西蘭大白兔眼球和角膜均無任何刺激。相比PBS組，RAPA-DES組的角膜植片在術(shù)后第7、16天更透明，無明顯水腫和新生血管現(xiàn)象。RAPA-DES組與PBS組、RAPA-DES組與DES組相比，角膜移植物的生存百分比顯著升高（P<0.05）。PBS組、DES組和RAPA-DES組小鼠角膜移植物的中位生存時間分別為16、16和22 d。HE染色結(jié)果顯示，PBS組和DES組小鼠角膜移植物明顯水腫，有大量炎癥細胞浸潤。RAPA-DES組的角膜移植物中無明顯水腫，只有少量炎癥細胞積累。RT-qPCR結(jié)果顯示，RAPA-DES組小鼠角膜組織中TNF-α mRNA表達水平與PBS組無明顯差異（P＞0.05），RAPA-DES組IL-1β、IL-6、IL-10 mRNA表達水平明顯低于PBS組和DES組（P<0.05），RAPA-DES組小鼠角膜組織中IL-12α和IL-17α mRNA表達水平低于PBS組（P<0.05）。WB結(jié)果顯示，RAPA-DES組的IL-6和IL-17α蛋白的表達水平明顯低于PBS組（P<0.05）。

結(jié)論RAPA-DES滴眼液能顯著延長角膜移植物生存時間，其可以通過降低角膜組織中促炎因子水平，抑制術(shù)后角膜移植物炎癥反應，從而起到抑制免疫排斥反應的作用。

［關(guān)鍵詞］ ?角膜移植；移植，同種；免疫抑制療法；西羅莫司；深共晶溶劑；藥物載體

［中圖分類號］ ?R779.6;R779.64

［文獻標志碼］ ?A

Inhibitory effect of rapamycin-deep eutectic solvent eye drops on corneal allograft rejection in mice and its mechanism

YANG Yang， HUANG Cixin， ZENG Fanxing， SUN Yaru， WEI Chao， WANG Hongwei， GAO Hua

（Faculty of Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

;［ABSTRACT］?Objective?To investigate the inhibitory effect of rapamycin （RAPA）-deep eutectic solvent （DES） eye drops on corneal allograft rejection in mice and its mechanism.

Methods?CCK-8 assay was used to measure the influence of 10 types of DES on the viability of human corneal epithelial cells （HCECs）， and the DES with a significantly higher cell viability than the control group was selected for characterization to obtain the most suitable DES. BALB/c mice and New Zealand white rabbits were used to evaluate the biocompatibility of the most suitable DES. The mice were randomly divided into normal group， phosphate solution （PBS） group， DES group， and RAPA-DES group. The mice in normal group were fed normally， and those in the PBS group， the DES group， and the RAPA-DES group were administrated PBS， DES， and RAPA-DES solution， respectively， to the right eye after corneal transplantation. On the next day， a slit lamp was used to observe the survival of corneal grafts， and the survival percentage of corneal grafts was analyzed to plot the survival curve of corneal grafts. On days 7 and 16 after transplantation， the eyeballs of the mice were collected， and HE staining was used to observe corneal edema and inflammatory cell infiltration under a microscope. On day 16 after transplantation， RT-qPCR was used to measure the mRNA expression levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， interleukin-10 （IL-10）， interleukin-12α （IL-12α）， and interleukin-17α （IL-17α） in corneal tissue， and Western blot was used to measure the protein expression levels of IL-6 and IL-17α in corneal tissue.

Results?CCK-8 assay showed that compared with the control group， the DES-1 group and the DES-2 group had a significant increase in cell viability （P<0.05）， and the DES-1 group had a significantly higher cell viability than the DES-2 group （P<0.05）; in addition， DES-1 had a lower viscosity than DES-2 and a pH va-

lue closer to 7.4， and therefore， DES-1 was the most suitable DES and was used for subsequent experiments. The results of biocompatibility evaluation showed that DES-1 did not cause any irritation to the eyes and cornea of mice and New Zealand white rabbits. Compared with the PBS group， the RAPA-DES group had more transparent corneal grafts on days 7 and 16 after surgery， without significant edema or neovascularization. The RAPA-DES group had a significant increase in the survival percentage of corneal grafts compared with the PBS group and the DES group （P<0.05）. The median survival time of corneal grafts in the PBS， DES， and RAPA-DES groups was 16 d， 16 d， and 22 d， respectively. HE staining showed significant edema and massive inflammatory cell infiltration in the corneal grafts of mice in the PBS group and the DES group， while there was no significant edema with a small number of inflammatory cells in the RAPA-DES group. RT-qPCR showed that there was no significant difference in the mRNA expression level of TNF-α in corneal tissue between the RAPA-DES group and the PBS group （P>0.05）; compared with the PBS group and the DES group， the RAPA-DES group had significantly lower mRNA expression levels of IL-1β， IL-6， and IL-10 （P<0.05）， and compared with the PBS group， the RAPA-DES group had significantly lower mRNA expression levels of IL-12α and IL-17α in corneal tissue （P<0.05）. Western blot showed that the RAPA-DES group had significantly lower protein expression levels of IL-6 and IL-17α than the PBS group （P<0.05）.

Conclusion?RAPA-DES eye drops can significantly prolong the survi-

val time of corneal grafts and inhibit immune rejection reaction by reducing the levels of proinflammatory factors in corneal tissue and inhibiting the inflammatory response of corneal grafts after surgery.

［KEY WORDS］?Corneal transplantation; Transplantation， homologous; Immunosuppression therapy; Sirolimus; Deep eutectic dolvents; Drug carriers

角膜移植手術(shù)是失明患者主要的治療方法，是否發(fā)生免疫排斥反應是手術(shù)成功與否的關(guān)鍵，目前臨床常用的免疫抑制劑有環(huán)孢素、他克莫司和雷帕霉素（RAPA）。RAPA是一種特異性雷帕霉素靶蛋白復合體1（mTORC1）抑制劑［1］。但其水溶性極低，局部應用時，在角膜和前房常難以達到有效藥物濃度，影響其功效［2］。

近十年來，脂質(zhì)體、水凝膠、納米材料和離子液體（ILs）等被廣泛用于藥物載體［3-6］，提高了藥物的溶解度和持續(xù)釋放能力。ILs具有對非極性物質(zhì)的高溶解性，化學和熱穩(wěn)定性強，以及低蒸汽壓力的特性［7］。作為一種新型ILs，深共晶溶劑（DES）彌補了某些藥物水溶性差和生物利用率低的缺點，在化學、材料、食品和藥物等行業(yè)均引起了高度關(guān)注，但其生物安全性還有待進一步明確。本研究根據(jù)摩爾比和相應溫度采用混合加熱的方法合成了一種基于DES的雷帕霉素（RAPA）滴眼液，并對該滴眼液的表征、生物相容性以及對小鼠角膜移植排斥反應作用進行評估，旨在提高RAPA臨床應用的效果。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

氯化膽堿、果糖、蔗糖、葡萄糖、尿素、乙二酸、丙二酸、蘋果酸、乙二醇、丙二醇和1，4-丁二醇均購自上海麥克林生化科技有限公司，所有試劑純度均超過98%。CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自上海耶森生物技術(shù)有限公司，人角膜上皮細胞系（HCECs）由Choun-Ki JOO教授（韓國加圖立大學，首爾，韓國）贈與。雄性C57小鼠（共24只）和BALB/c小鼠（共76只），均8周齡，體質(zhì)量（22±2）g，由北京維通利華實驗動物繁育有限公司提供。雄性新西蘭大白兔（共6只），12周齡，體質(zhì)量（2.5±0.1）kg，購自濟南西嶺角生物科技有限公司。

1.2 DES的合成

根據(jù)摩爾比和相應溫度采用混合加熱的方法參照相關(guān)文獻合成10種DES，分別為氯化膽堿/果糖（DES-1）、氯化膽堿/蔗糖（DES-2）、氯化膽堿/葡萄糖（DES-3）［8］、氯化膽堿/尿素（DES-4）［9］、氯化膽堿/乙二酸（DES-5）［10］、氯化膽堿/丙二酸（DES-6）［8］、氯化膽堿/蘋果酸（DES-7）［11］、氯化膽堿/乙二醇（DES-8）［12］、氯化膽堿/丙二醇（DES-9）［13］和氯化膽堿/丁二醇（DES-10）DES［14］。將10種DES分別溶解于混合培養(yǎng)液（10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液和90% DMEM-f12培養(yǎng)液）中，配置成DES濃度為5%的DES混合培養(yǎng)液備用。

1.3CCK-8實驗檢測各DES對HCECs細胞細胞活性的影響

將HCECs細胞接種于96孔板，加入DMEM-f12混合培養(yǎng)液，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后棄去原培養(yǎng)液，分別加入DES-1～DES-10混合培養(yǎng)液，設置為DES-1～DES-10組，同時設立對照組（加入DMEM-f12混合培養(yǎng)液），均再培養(yǎng)24 h，然后每孔加入10 μL的CCK-8試劑，并在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h。使用酶標儀測量450 nm波長處的吸光度值，并計算細胞活性。選擇細胞活性高于對照組的DES組用于后續(xù)實驗。

1.4 DES的表征

將上面篩選出來的DES放置于干燥爐中干燥48 h。用流變儀測定各DES在25 ℃時的黏度，并且測量各DES的pH值。使用Nicolet380熱光譜儀進行傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析，測量各DES的FTIR峰值。所有測量均重復3次。使用細胞活性高、黏度低以及pH接近7.4的DES（后簡稱DES）用于后續(xù)的實驗。采用流變儀測定該DES在20、40、60 ℃時的黏度。

1.5 生物相容性評價

將BALB/c小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組6只。實驗組小鼠每天以5.0 μL劑量的DES（濃度100%）混合后，滴雙眼，對照組小鼠雙眼滴用等量的PBS溶液，均每天4次，第8天停藥，觀察至第14天，期間正常喂飼小鼠。在實驗的第0、7和14天，利用裂隙燈觀察兩組小鼠眼球，每次觀察結(jié)束后立即用2%熒光素鈉滴眼，10 s后將小鼠置于裂隙燈鈷藍光下，觀察其角膜上皮。取雄性新西蘭大白兔6只，右眼（實驗組）每30 min滴入20 μL的DES（濃度100%），共5次，左眼（對照組）同時滴入等量的PBS。在第1次滴眼前以及第5次滴眼后第1、24、48小時，利用裂隙燈觀察兔角膜上皮和眼球，采用Draize評分系統(tǒng)［15］對眼球癥狀進行評估。

1.6 小鼠同種異體角膜移植模型的建立和評估

RAPA-DES滴眼液的配制：將1.0 mg的RAPA粉末和1.0 mL的DES（濃度100%）混合后，以10 000 r/min離心5 min，充分混合，未發(fā)現(xiàn)有未溶解物，即RAPA完全溶解于DES中后，使用鹽酸溶液調(diào)整其pH值至7.4。將BALB/c小鼠隨機分為正常組、磷酸鹽溶液（PBS）組、DES組和RAPA-DES組，每組16只。正常組不進行角膜移植手術(shù)，正常喂飼30 d。以24只C57小鼠的雙眼為供體，移植到PBS組、DES組和RAPA-DES組48只小鼠的右眼中［16］，術(shù)后第2天，三組小鼠的右眼分別滴加PBS、DES和RAPA-DES滴眼液，每次5 μL，每天4次，第8天停藥，正常喂飼至第30天。

四組小鼠各取5只，隔天通過裂隙燈觀察一次角膜移植物的存活狀況，并根據(jù)文獻報道的評分系統(tǒng)［17］評估角膜移植物的生存百分比并繪制角膜移植物生存曲線。

1.7 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠角膜移植術(shù)后角膜水腫和炎癥浸潤情況

四組小鼠分別于術(shù)后第7、16天，每組每次隨機選取3只，斷頸處死后，摘除右眼眼球，以4%的多聚甲醛固定24 h后，脫水制作成石蠟切片。將切片置于60 ℃烤箱中烘烤20 min行HE染色，于顯微鏡下觀察角膜水腫和炎癥浸潤情況。

1.8實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測小鼠角膜移植術(shù)后角膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12α和IL-17α mRNA表達水平

四組小鼠分別于術(shù)后第16天，每組隨機選取3只，斷頸處死后，摘除右眼眼球并剝離角膜，提取角膜組織中的總RNA。以GAPDH作為內(nèi)參，使用ABI7000 SDS系統(tǒng)通過RT-qPCR技術(shù)，測量角膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12α和IL-17α mRNA的表達水平。引物名稱及其序列見表1。實驗重復3次，結(jié)果取均值。

1.9蛋白質(zhì)免疫印跡試驗（WB）檢測小鼠角膜移植術(shù)后角膜組織中IL-6和IL-17α蛋白的表達水平

四組小鼠分別于術(shù)后第16天，每組取剩余的2只，斷頸處死后，摘除右眼眼球并剝離角膜，加入至RIPA裂解液和PMSF蛋白抑制劑（100∶1）中，將角膜組織研磨，超聲處理后，在4 ℃下以12 000 r/min離心30 min。使用BCA法繪制標準曲線并計算蛋白濃度。將蛋白樣品于95 ℃加熱10 min后置于－80 ℃冰箱過夜。第2天取出蛋白樣品后，95 ℃加熱5 min，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min。配置好SDS-PAGE膠后，電泳、轉(zhuǎn)膜。室溫搖床封閉2 h。一抗4 ℃冰箱孵育過夜。以GAPDH作為內(nèi)參。復溫30 min，TBST洗膜3次。二抗室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜3次后，加入發(fā)光液于超高靈敏電子壓片成像儀上顯影。使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學處理

使用Prism 9（GraphPad）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以 ±s表示，使用獨立樣本t檢驗比較兩組數(shù)據(jù)間的差異；使用單因素方差分析（ANOVA）評估多組數(shù)據(jù)的總體分布，進一步兩兩比較采用Tukey檢驗。使用Kaplan-Meier法繪制角膜移植物的生存曲線并計算中位生存期，使用Log-rank （Mantel-Cox） 檢驗分析各組生存曲線的差異。

2 結(jié) ?果

2.1 DES的生物相容性和表征

CCK-8實驗結(jié)果顯示，對照組細胞的細胞活性為（100.0±1.0）%，DES-1～DES-10組細胞的細胞活性分別為（137.0±9.2）%、（112.0±5.2）%、（90.7±4.7）%、（2.0±2.0）%、（10.0±2.0）%、（3.0±0.0）%、（8.0±2.0）%、（34.0±1.0）%、（9.7±2.1）%和（11.7±0.6）%。與對照組比較，DES-1組和DES-2組細胞的細胞活性顯著升高（t=6.95、3.93，P<0.05），且DES-1組顯著高于DES-2組（t=4.11，P<0.05）；DES-3～DES-10組細胞的細胞活性明顯降低（t=3.35～168.00，P<0.05）。因此選擇細胞活性高于對照組的DES-1組和DES-2組進行后續(xù)實驗。

DES-1和DES-2在25 ℃時的黏度分別為0.80和1.37 Pa·s，pH則分別為8.04±0.09和8.05±0.03。FITR分析結(jié)果顯示，氯化膽堿的FTIR峰值為3 256 cm-1，DES-1、DES-2的FTIR峰值分別為3 330 cm-1和3 327 cm-1。綜合上面的實驗結(jié)果，以DES-1為最適宜DES，用于后續(xù)實驗。DES-1在20、40、60 ℃時黏度分別為1.0、0.25和0.1 Pa·s。

裂隙燈觀察結(jié)果顯示，在實驗的第0、7、14天時，對照組和實驗組小鼠眼球均沒有角膜新生血管、角膜混濁或角膜上皮水腫的現(xiàn)象；熒光素鈉染色結(jié)果顯示，在實驗的第0、7、14天時，對照組和實驗組小鼠角膜均未出現(xiàn)潰瘍、劃痕或糜爛現(xiàn)象。在滴眼前以及滴眼結(jié)束后第1、24、48小時，對照組和實驗組兔眼均未出現(xiàn)結(jié)膜充血、角膜混濁或虹膜炎性滲出現(xiàn)象；熒光素鈉染色結(jié)果顯示，兩組兔眼角膜上皮均無脫落、水腫及潰瘍現(xiàn)象，Draize評分均為0分。

2.2 RAPA-DES對各組小鼠角膜移植排斥反應的影響

PBS組和DES組小鼠在角膜移植術(shù)后第7天均出現(xiàn)角膜反應性水腫和輕度混濁，術(shù)后第16天，移植物水腫加重，嚴重者前房、瞳孔邊緣無法窺見，新生血管逐漸向移植物中心生長。相比PBS組，RAPA-DES組的角膜植片在術(shù)后第7、16天更透明，無明顯水腫和新生血管現(xiàn)象。見圖1。

角膜移植物的生存曲線顯示，PBS組、DES組和RAPA-DES組第17天角膜移植物生存百分比分別為40%、20%和100%，RAPA-DES組與PBS組、RAPA-DES組與DES組比較差異有顯著性（χ2=5.84、6.43，P<0.05），對照組和DES組比較差異無顯著性（P＞0.05）；PBS組、DES組和RAPA-DES組小鼠角膜移植物的中位生存時間分別為16、16 和22 d。見圖2。

HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠的角膜5層結(jié)構(gòu)均清楚可見，沒有明顯水腫和炎癥反應；PBS組和DES組小鼠角膜移植物有明顯水腫，有大量炎癥細胞浸潤，并且角膜間質(zhì)層的血管結(jié)構(gòu)明顯，血管腔內(nèi)充滿大量紅細胞；RAPA-DES組的角膜移植物無明顯水腫，只有少量炎癥細胞積累。見圖3。

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，4組小鼠角膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12α和IL-17α mRNA表達水平比較差異具有顯著意義（F=19.43～961.90，P<0.05）；正常組與PBS組、DES組、RAPA-DES組上述6項指標比較差異均具有顯著意義（P<0.05）；PBS組和DES組比較，IL-1β、IL-6、IL-10和IL-17α mRNA表達水平差異有顯著意義（P<0.05）；PBS組與RAPA-DES組比較，IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12α和IL-17α mRNA表達水平差異有顯著性（P<0.05）；DES組與RAPA-DES組比較，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 mRNA表達水平差異有顯著性（P<0.05）。WB檢測結(jié)果顯示，4組小鼠角膜組織中IL-6和IL-17α蛋白的表達水平比較差異有顯著性（F=8.76、6.50，P<0.05）。正常組與PBS組、PBS組與RAPA-DES組IL-6和IL-17α表達水平比較差異有顯著性（P<0.05），正常組與DES組、正常組與RAPA-DES組、PBS組與DES組、DES與RAPA-DES組IL-6和IL-17α表達水平比較差異無顯著性（P＞0.05）。見表2，圖4。

3 討 ?論

DES中氫鍵受體（HBA）和氫鍵供體（HBD）間的氫鍵能維持混合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而克服了藥物水溶性差和生物利用率低的缺點。DES制備中常用的HBA有氯化膽堿和氨基酸，氯化膽堿因易于降解，在藥物遞送方面應用廣泛，因此本研究中HBA選擇了氯化膽堿。同時本研究又選擇了DES制備中常用的四類HBD（碳水化合物、酰胺、有機酸和多元醇），共制備了10種DES，研究其生物相容性和負載RAPA后對角膜移植免疫排斥反應影響。

本研究CCK-8實驗的結(jié)果表明，基于葡萄糖（DES-3）、酰胺（DES-4）、有機酸（DES-5～DES-7）和多元醇（DES-8～DES-10）的DES處理HCECs細胞24 h以后，HCECs細胞的細胞活性較對照組顯著降低，具有一定的毒性，而基于碳水化合物DES-1和DES-2組細胞的細胞活性顯著升高，上述結(jié)果與BERGUA等［18］的研究結(jié)果一致。進一步分析原因可能為，果糖等碳水化合物是可被細胞利用的能源，因此，DES-1不僅沒有毒性，同時還可以提升細胞的活力，促進細胞增殖。

DES黏度與氫鍵作用力、范德華力和靜電力的相互作用緊密相關(guān)，是影響DES在眼科應用中舒適度的重要因素之一［19］。本研究中DES-1和DES-2在25 ℃時的黏度分別為0.80和1.37 Pa·s，同時，DES-1組細胞的細胞活性顯著高于DES-2組，DES-1的黏度低，pH更接近于7.4，因此以DES-1為最適宜DES，用于后續(xù)實驗。本研究還評估了不同溫度對于DES-1黏度的影響，結(jié)果顯示，隨著溫度從20 ℃升至40 ℃，DES的黏度迅速從1.0 Pa·s下降至0.26 Pa·s，并在60 ℃時達到0.10 Pa·s。DES-1的黏度隨溫度升高而降低的趨勢，可能是由于加熱過程中范德華力和氫鍵作用力減弱，以產(chǎn)生足夠的動能來克服分子間的相互作用力。這些結(jié)果均與Arrhenius公式關(guān)于溫度和黏度關(guān)系的描述相吻合［20］。同時，DES-1的pH呈輕度堿性，這也是人眼睛能夠接受的適宜pH值［21］。

本研究通過FTIR分析，結(jié)果顯示，氯化膽堿在3 256 cm-1處有一個寬闊的O-H拉伸振動峰，在DES-1、DES-2的光譜中，該峰位向更低波數(shù)移動。這可能是由于在DES制備過程中，碳水化合物（果糖和蔗糖）中的羥基與氯化膽堿中的氯離子之間形成了強氫鍵所導致。綜上，相較于DES-2，DES-1可顯著促進HCECs細胞的細胞活性，且黏度低、pH適宜。對DES-1又通過小鼠和新西蘭兔進行了生物相容性評價，結(jié)果表明，DES-1對小鼠和新西蘭兔的眼球和角膜均無任何刺激，是一種具有良好生物相容性的眼用藥物載體。

本研究結(jié)果顯示，PBS組和DES組小鼠在角膜移植術(shù)后第7天出現(xiàn)角膜水腫和混濁現(xiàn)象，術(shù)后第16天，角膜移植物水腫更加明顯，新生血管長入角膜中央，提示排斥反應達到了高峰期。相比PBS組和DES組，RAPA-DES組小鼠角膜移植物第16天時非常透明，無明顯水腫，能窺見虹膜和瞳孔。角膜移植物生存曲線結(jié)果顯示，PBS組、DES組和RAPA-DES組小鼠角膜移植物的中位生存時間分別為16、16 和22 d，表明RAPA-DES組能明顯延長角膜移植物的存活時間。HE染色顯示，與PBS組相比，RAPA-DES組小鼠角膜移植物炎癥細胞數(shù)量少，水腫及血管結(jié)構(gòu)不明顯，表明RAPA-DES滴眼液能夠顯著降低角膜移植物的炎癥反應。

本研究又進一步測定了各組小鼠角膜組織中炎癥因子相關(guān)基因的表達水平，結(jié)果顯示，在術(shù)后第16天，RAPA-DES組與PBS組的TNF-α mRNA表達水平?jīng)]有明顯差異，這可能與TNF-α主要在炎癥早期發(fā)揮作用有關(guān)［22］。相比PBS組，促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12α和IL-17α mRNA表達水平在RAPA-DES組均有所降低。WB結(jié)果表明，RAPA-DES組的炎癥因子IL-6和IL-17α蛋白的表達水平低于PBS組，提示RAPA-DES滴眼液能夠通過降低這些促炎因子的水平，抑制角膜移植物的炎癥反應，從而抑制移植角膜免疫排斥反應。

綜上所述，本研究成功制備出一種生物相容性良好的RAPA-DES滴眼液，該滴眼液能顯著延長角膜移植物生存時間，其可以通過降低角膜組織中促炎因子基因的水平，抑制術(shù)后角膜移植物的炎癥反應，從而起到抑制免疫排斥反應發(fā)生的作用。本研究為RAPA-DES滴眼液的眼科臨床應用提供了實驗數(shù)據(jù)。但本研究只是針對小鼠進行了初步實驗，關(guān)于RAPA-DES滴眼液的遠期療效及潛在作用機制尚需進一步深入探討。

倫理批準和動物權(quán)利聲明： 本研究涉及的所有動物實驗均已通過山東第一醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會的審核批準（W202302220055）。所有實驗過程均遵照《眼科和視覺研究中動物使用聲明》的條例進行。

作者聲明： 楊洋、黃慈欣、王紅衛(wèi)和高華參與了研究設計；楊洋、曾繁星、孫亞如、韋超和王紅衛(wèi)參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

［參考文獻］

［1］SCHREIBER K H， ARRIOLA APELO S I， YU D Y， et al. A novel rapamycin analog is highly selective for mTORC1 in vivo［J］. Nat Commun， 2019，10（1）：3194.

［2］ MAO J Z， WANG H， XIE Y， et al. Transdermal delivery of rapamycin with poor water-solubility by dissolving polymeric microneedles for anti-angiogenesis［J］. J Mater Chem B， 2020，8（5）：928-934.

［3］ ABU LILA A S， DOI Y， NAKAMURA K， et al. Sequential administration with oxaliplatin-containing PEG-coated cationic liposomes promotes a significant delivery of subsequent dose into murine solid tumor［J］. J Control Release， 2010，142（2）：167-173.

［4］ WU D Q， ZHU J， HAN H， et al. Synthesis and characterization of arginine-NIPAAm hybrid hydrogel as wound dressing： In vitro and in vivo study［J］. Acta Biomater， 2018，65：305-316.

［5］ KHAN H， MIRZAEI H R， AMIRI A， et al. Glyco-nanoparticles： New drug delivery systems in cancer therapy［J］. Semin Cancer Biol， 2021，69：24-42.

［6］ ALI M K， MOSHIKUR R M， WAKABAYASHI R， et al. Biocompatible ionic liquid-mediated micelles for enhanced transdermal delivery of paclitaxel［J］. ACS Appl Mater Interfaces， 2021，13（17）：19745-19755.

［7］ CUPPINI M， GARCIA I M， DE SOUZA V S， et al. Ionic li-

quid-loaded microcapsules doped into dental resin infiltrants［J］. Bioact Mater， 2021，6（9）：2667-2675.

［8］ HAYYAN M， MBOUS Y P， LOOI C Y， et al. Natural deep eutectic solvents： Cytotoxic profile［J］. Springerplus， 2016，5（1）：913.

［9］ MORRISON H G， SUN C C， NEERVANNAN S. Characte-

rization of thermal behavior of deep eutectic solvents and their potential as drug solubilization vehicles［J］. Int J Pharm， 2009，378（1-2）：136-139.

［10］ GUO Y， LI Y， LI Z， et al. Deep eutectic solvent-homogenate based microwave-assisted hydrodistillation of essential oil from Litsea cubeba （Lour.） Pers. fruits and its chemical composition and biological activity［J］. J Chromatogr A， 2021，1646：462089.

［11］ HU Y， LIANG P Y， WANG Z X， et al. Exploring the mechanism of solubilization and release of isoliquiritigenin in deep eutectic solvents［J］. Int J Pharm， 2023，644：123298.

［12］ HAGHBAKHSH R， DUARTE A R C， RAEISSI S. Viscosity investigations on the binary systems of （1 ChCl： 2 ethylene glycol） DES and methanol or ethanol［J］. Molecules， 2021，26（18）：5513.

［13］ LE N T， HOANG N T， VAN V T T， et al. Extraction of curcumin from turmeric residue （Curcuma longa L.） using deep eutectic solvents and surfactant solvents［J］. Anal Met-

hods， 2022，14（8）：850-858.

［14］ ZHANG S Z， DUAN Y， TENG C C， et al. Fast and selective degradation of biomass for xylose， glucose and lignin under mild conditions［J］. Molecules， 2023，28（8）：3306.

［15］ WILHELMUS K R. The Draize eye test［J］. Surv Ophthalmol， 2001，45（6）：493-515.

［16］ WEI C， MA L， XIANG D M， et al. Enhanced autophagy alleviated corneal allograft rejection via inhibiting NLRP3 inflammasome activity［J］. Am J Transplant， 2022，22（5）：1362-1371.

［17］ PAN Q， XU Q G， BOYLAN N J， et al. Corticosteroid-loaded biodegradable nanoparticles for prevention of corneal allograft rejection in rats［J］. J Control Release， 2015，201：32-40.

［18］ BERGUA F， DELSO I， MUOZ-EMBID J， et al. Structure and properties of two glucose-based deep eutectic systems［J］. Food Chem， 2021，336：127717.

［19］ GUAJARDO N， DOMNGUEZ DE MARA P， CANALES R. Integrating biocatalysis with viscous deep eutectic solvents in lab-on-A-chip microreactors［J］. ChemSusChem， 2022，15（9）：e202102674.

［20］ BAHADORI L， CHAKRABARTI M H， MANAN N S， et al. The effect of temperature on kinetics and diffusion coefficients of metallocene derivatives in polyol-based deep eutectic solvents［J］. PLoS One， 2015，10（12）：e0144235.

［21］ DOLDOLOVA K， BENER M， LALIKO

LU M， et al. Optimization and modeling of microwave-assisted extraction of curcumin and antioxidant compounds from turmeric by using natural deep eutectic solvents［J］. Food Chem， 2021，353：129337.

［22］ KONG D H， KIM Y K， KIM M R， et al. Emerging roles of vascular cell adhesion molecule-1 （VCAM-1） in immunological disorders and cancer［J］. Int J Mol Sci， 2018，19（4）：1057.

（本文編輯 耿波 厲建強）