植物種子衰老機(jī)制研究進(jìn)展

魏永勝 彭琪朗 黃瀅奧 陳彥如 趙程亞菲 郗欣悅

摘 要 種子在貯藏過程中的衰老即可直接導(dǎo)致建苗遲緩，幼苗畸形，最終影響作物產(chǎn)量，也可以導(dǎo)致商業(yè)貯藏中糧食品質(zhì)的下降，還會影響種質(zhì)資源庫的更新周期和自然環(huán)境野生植物的生存。因此，深入認(rèn)識種子衰老的生物學(xué)過程，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和種質(zhì)資源安全保存具有重要意義。本文系統(tǒng)綜述了植物種子衰老生物學(xué)特征，從基因到表型，分析造成種子衰老的內(nèi)外因，包括種子衰老過程中解剖結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理生化和分子生物學(xué)原因，以及環(huán)境等外界誘導(dǎo)因素，構(gòu)建出一個完整種子衰老網(wǎng)絡(luò)圖。以期為種子衰老機(jī)理、種子活力修復(fù)和種質(zhì)資源保存等研究提供基礎(chǔ)理論參考。

關(guān)鍵詞 植物種子；衰老；分子機(jī)制；壽命

種子是人類的主要糧食，其壽命直接影響糧食品質(zhì)、作物出苗質(zhì)量、種質(zhì)資源庫的更新周期、種子商業(yè)貯藏以及自然環(huán)境野生植物的繁殖與生存，無論是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)建設(shè)還是生物多樣性保護(hù)中都有重要意義，因此種子的衰老或壽命問題成為研究者和生產(chǎn)者共同關(guān)注的問題。種子離開母體后，隨著時(shí)間的延長，其生存能力、活力和萌發(fā)力受到自身調(diào)控或外部環(huán)境影響而逐漸衰退，即為種子衰老［1］。貯藏在種質(zhì)資源庫中的種子萌發(fā)率每年也會平均下降1%，不到20 a即會從100%下降到 85%［2］。生產(chǎn)中，多數(shù)作物種子為1～5 a左右，自然條件可達(dá)千年以上，如死海地區(qū)的椰棗種子休眠2 000 a后依然可以萌發(fā)［3］。因此，了解種子衰老的機(jī)理，預(yù)測其壽命，是種質(zhì)資源庫管理及自然土壤種子庫研究的核心問題。種子耐儲藏的本質(zhì)就是各種保護(hù)機(jī)制和所受損傷之間的博弈，當(dāng)平衡被打破后種子無法維持內(nèi)部分子有效結(jié)構(gòu)與功能，種子衰老即開始。每一種引起種子衰老的因素既作為起因 （cause） 加速劣變的進(jìn)程，同時(shí)也是衰老的結(jié)果（effector）。在所有因素中，活性氧 （reactive oxygen species，ROS） 引起的氧化損傷被認(rèn)為是引起種子衰老的主要原因［4］。遺傳因素在種子抗衰老特性中起著關(guān)鍵性的作用，種子活力的相關(guān)性狀具很高的遺傳性，強(qiáng)活力的品種在雜交后代中表現(xiàn)突出，而且可以遺傳。耐衰老品種將會產(chǎn)生一定分子量的特異蛋白質(zhì)，這與上游的基因調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)有關(guān)［5］。

本文對種子，主要是正常種子 （orthodox seeds） 的衰老表現(xiàn)及內(nèi)在機(jī)制，如細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，激素、活性氧、蛋白質(zhì)等生物大分子變化以及基因調(diào)控等多個方面進(jìn)行系統(tǒng)綜述，此外還討論了環(huán)境等外在因素對種子衰老的影響，并對本領(lǐng)域的研究進(jìn)行展望，提出該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和尚未明確的問題。期望構(gòu)建相對完整的種子衰老機(jī)制 （圖1） ，為種子衰老機(jī)理研究和種質(zhì)保存提供一定的參考。

1 種子衰老的主要生物學(xué)表現(xiàn)

1.1 種子形態(tài)變化

種子在健康狀態(tài)下籽粒飽滿，無機(jī)械損傷，種子自身粒質(zhì)量、粒長、粒寬、體積、種皮顏色、投影面積等指標(biāo)均呈穩(wěn)定狀態(tài)。種子衰老過程，顏色會發(fā)生變化，如水稻 （Oryza sativa L.） 種子的種皮經(jīng)常出現(xiàn)紅色病變或壞死［4］。正常種子的子葉發(fā)達(dá)，占種胚絕大部分，可為種子萌發(fā)提供大量營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)胚芽、胚軸和胚根的形成［6］。但種子進(jìn)入老化時(shí)，胚的質(zhì)量下降以及種皮的不透性也會增強(qiáng)。

1.2 衰老種子的活力與萌發(fā)率降低

在種子衰老的過程中，種子活力下降導(dǎo)致種子發(fā)芽遲緩，使種子在萌發(fā)過程中對逆境條件的適應(yīng)性減弱。萌發(fā)率隨老化時(shí)間的變化趨勢通常呈典型倒S形曲線［7］，其中包括一個平臺期 （階段Ⅰ） ，然后是一個快速下降階段 （階段Ⅱ） 和一個緩慢下降階段 （階段Ⅲ） 。榆樹 （Ulmus pumila L.） 種子在37 ℃和100% RH的老化條件下，第1天活力沒有明顯變化，第2天開始逐漸下降，至第3天下降到50%，5 d后活力完全喪失［7］。也有些種子萌發(fā)率呈現(xiàn)“快-慢”之趨勢，直到完全喪失活力，而無最后的緩慢下降階段［8］。

1.3 幼苗畸形

種子衰老后雖然能萌發(fā)，但苗弱且發(fā)育不良、抗逆性弱、產(chǎn)量低［8］。幼苗是植物生長的關(guān)鍵階段，無論是對后期的生長發(fā)育還是繁殖發(fā)育都有極大的影響。生菜 （Lactuca sativa L.） 種子貯藏4～5 a與1～2 a相比 （溫度：15～20 ℃，相對濕度：30%～35%） ，不僅胚根和下胚軸短，而且子葉中脈褐變，嚴(yán)重的表現(xiàn)出根部未生長或僅有胚根突出但并未進(jìn)行下一步生長的幼苗［9］。種子的出苗整齊度也會受到老化的影響。不同品種的玉米 （Zea mays L.） 種子經(jīng)老化處理后，株高整齊度降低66.9%，出苗指數(shù)也極顯著降低［10］。

2 種子衰老的機(jī)制

2.1 種子貯藏物質(zhì)消耗

植物幼苗能夠進(jìn)行光合作用之前，其生長所需能量物質(zhì)都是從富含蛋白質(zhì)和糖類的子葉或胚乳中獲得［6］。儲存期間種子貯藏物質(zhì)的損失最終會引起萌發(fā)率和出苗率減少、幼苗長度縮短和幼苗干質(zhì)量降低［11］。種子中可溶性碳水化合物的含量通常會隨著種子的衰老而下降。大豆 （Glycine max L.） 種子在貯藏初期可溶性糖、淀粉含量和脂質(zhì)均降低，而游離脂肪酸的比例、甾醇和磷脂含量隨著甘油三酯含量的相應(yīng)降低而增加［12］。在貯藏后期，淀粉含量繼續(xù)下降，但可溶性糖的含量表現(xiàn)出短期上升再下降的趨勢。白花風(fēng)鈴木 （Tabebuia roseoalba （Ridl.） Sandwith） 種子貯藏期間，種子干質(zhì)量下降并不明顯，但脂質(zhì)和蛋白質(zhì)含量持續(xù)下降，脂質(zhì)含量在最初6個月由61%下降至52%，而隨后的12個月則迅速下降到23%［13］。

2.2 結(jié)構(gòu)損傷

2.2.1 膜損傷 種子胚細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)在儲藏過程中也會不斷發(fā)生劣變，首先受到傷害的是細(xì)胞膜。過氧化會改變磷脂結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其頭部基團(tuán)變小、尾部變大，呈錐形，使得膜不能保持脂雙層的均勻性，失去選擇滲透性［5］。香椿 （Toona sinensis （A.Juss.） Roem.）［14］、孜然芹 （Cuminum cyminum L.）［15］、蓮子 （Nelumbo nucifera Gaertn.）［16］等種子在老化過程中，大量細(xì)胞內(nèi)部電解物質(zhì)外漏，種子浸出液相對電導(dǎo)率及可溶性糖含量相對增加，膜脂過氧化中間產(chǎn)物自由基和最終產(chǎn)物丙二醛 （malondialdehyde， MDA） 含量增加，都是細(xì)胞膜脂損傷的表現(xiàn)。磷脂酶Ｄ （phospholipase D， PLD） 可裂解磷脂以產(chǎn)生磷脂酸，PLD及其產(chǎn)物PA與多種植物生長和發(fā)育過程有關(guān)，被認(rèn)為是導(dǎo)致膜損傷的重要因素［17］。敲除或敲減擬南芥 （Arabidopsis thaliana （Linn.） Heynh.） AtPLDal基因，減少PLD的含量，可提高油穩(wěn)定性、種子質(zhì)量和種子壽命，但完全敲除該基因的擬南芥種子的各項(xiàng)生理活性反而不及僅將該基因減弱的種子［18］。

2.2.2 線粒體損傷 胚細(xì)胞的線粒體在種子衰老過程中會明顯腫脹，從變得雜亂無章到消失，最終導(dǎo)致線粒體數(shù)量減少。衰老早期，線粒體內(nèi)膜和嵴變得模糊，部分出現(xiàn)空泡化，同時(shí)嵴的數(shù)量減少。衰老后期，線粒體DNA逐漸分散聚集到細(xì)胞膜處，并逐漸消失。已知的線粒體結(jié)構(gòu)變化可分為4類：點(diǎn)狀線粒體、蠕蟲狀線粒體、巨型線粒體和彌散線粒體。此外，線粒體衰老假說［19］認(rèn)為自由基導(dǎo)致的線粒體損傷是種子衰老發(fā)生的重要原因。線粒體是ATP的主要來源，由于其超微結(jié)構(gòu)的受損，細(xì)胞色素C氧化酶和蘋果酸脫氫酶的活性顯著降低，導(dǎo)致線粒體能量供應(yīng)不足和ROS濃度激增，更加劇了線粒體的老化和損傷［5］。線粒體功能受損的主要表現(xiàn)為：呼吸速率的減弱、氧化磷酸化效率的降低、抗氧化系統(tǒng)的紊亂等等，最終引起細(xì)胞損傷。

2.2.3 核酸 （DNA、RNA） 損傷 遺傳完整性的喪失是種子老化的初始事件之一。種子老化與染色體畸變、端粒長度變化、DNA損傷、DNA甲基化和異?；虮磉_(dá)有關(guān)。Dantas等［20］通過彗星實(shí)驗(yàn)測量衰老水稻種子和菜豆 （Phaseolus vulgaris L.） 的DNA損傷情況，老化樣品的彗星尾部強(qiáng)度表現(xiàn)出明顯的上升趨勢，其中菜豆品種‘GF003彗星尾部強(qiáng)度由19.7增加到37.7。此外，染色體突變也隨種子老化而積累，吸水萌發(fā)時(shí)期的有絲分裂受到抑制。雖然輕微的遺傳物質(zhì)損傷不會導(dǎo)致種子活力喪失，但會影響發(fā)芽期間基因的表達(dá)。

與DNA相比，RNA更容易被破壞，損傷的RNA可以作為靶向信號引起轉(zhuǎn)錄過程中mRNA的降解以及形成7，8-二氫-8-氧代鳥嘌呤。mRNA鏈的骨架很容易被截?cái)?，核苷堿基可以被修飾或轉(zhuǎn)化為無堿基位點(diǎn)。如，2年齡和23年齡的大豆胚軸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的比較結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在老化早期即開始降解，并且隨著存儲時(shí)間而增加［21］。較短的轉(zhuǎn)錄本比較長的轉(zhuǎn)錄本更穩(wěn)定，因此損傷主要來自較長RNA片段化。在常規(guī)水稻中和雜交水稻中分別鑒定出了174個和305個與長壽相關(guān)的mRNA，這些mRNA在長壽命品種中的降解速度更慢［22］。隨著種子活力的下降rRNA完整性也會降低。在老化的大豆種子中，隨著發(fā)芽能力的降低，核糖體亞基將RNA前體加工成18S和25S rRNA的過程可能會延遲，同時(shí)逐漸降解，形成23S和13S rRNA等分子量更小的RNA類型［21］。

2.3 種子衰老的生理機(jī)制

2.3.1 活性氧代謝失衡 正常種子內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于一種動態(tài)平衡的狀態(tài)［4］。在水合種子中，ROS產(chǎn)生的主要部位是線粒體、乙醛酸體和質(zhì)膜NADPH氧化酶。在干種子中，非酶促反應(yīng)“阿爾多瑞-美拉德反應(yīng) （Amadori-Maillard reactions， A-M）”是ROS產(chǎn)生的主要原因［5］。ROS清除系統(tǒng)的主要酶包括超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase， SOD） 、過氧化氫酶 （catalase from micrococcus lysodeiktic， CAT） 、抗壞血酸過氧化物酶 （aseorbate peroxidase， APX）、谷胱甘肽過氧化物酶 （glutathione peroxidase， GPX）、過氧化物酶 （peroxidase， POD）等［23］。此外，非酶促型抗氧化系統(tǒng)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)也是植物體內(nèi)清除ROS的重要途徑之一［24］。但是當(dāng)種子儲藏環(huán)境溫度、濕度過高，或其他不利條件引起種子衰老時(shí)，抗氧化系統(tǒng)無法阻止ROS的大量聚集［8， 16］，對細(xì)胞內(nèi)的脂類物質(zhì)進(jìn)行氧化攻擊，從而使質(zhì)膜完整性受損，通透性增大，即“自由基老化學(xué)說”［25］。同時(shí)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的自由基和MDA等物質(zhì)會進(jìn)一步對包括脂質(zhì)在內(nèi)的其他生物大分子造成傷害［4］。過剩的ROS還會對遺傳物質(zhì)DNA和RNA造成損傷，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成、降解受到抑制［5］。ROS本身也會損傷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，羰基化蛋白的產(chǎn)生就是由于ROS的大量產(chǎn)生攻擊賴氨酸、脯氨酸和蘇氨酸等殘基或者直接作用于肽鍵［26］?？寡趸富钚缘慕档鸵才cROS造成的氧化損傷密切相關(guān)［5］。種子衰老過程中，線粒體既是ROS產(chǎn)生的主要場所，也是ROS攻擊的主要細(xì)胞器。氧化損傷的線粒體主要表現(xiàn)為內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞色素C等內(nèi)溶物的外滲誘發(fā)程序性死亡 （programmed cell death， PCD）［1］。對榆樹種子衰老的研究表明，48種線粒體蛋白在衰老過程中發(fā)生了變化，這些蛋白多數(shù)與三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈相關(guān)［7］。上述ROS的多種傷害，最終引起種子老化，導(dǎo)致種子萌發(fā)率降低和活力喪失。脂質(zhì)過氧化與脂氧合酶 （lipoxygenase， LOXs） 有關(guān)， LOXs能催化不飽和脂肪酸與分子氧直接反應(yīng)，生成過氧化脂肪酸并產(chǎn)生自由基，損傷質(zhì)膜加速種子劣變［17］。研究者從洋蔥種子中成功克隆到? AcLOX1基因的全長［27］，解析了AcLOX2的結(jié)構(gòu)［28］，初步證明了LOX基因與洋蔥種子發(fā)育及老化相關(guān)聯(lián)。

2.3.2 非酶促ROS淬滅劑 非酶促ROS清除系統(tǒng)是防止種子細(xì)胞中大分子過氧化最重要的被動機(jī)制，包括種子儲藏蛋白、HSP和一些小分子的抗氧化劑，例如維生素C、維生素E、谷胱甘肽等［29］。α-生育酚可以通過阻止氧氣進(jìn)入種子內(nèi)部組織來降低種子呼吸代謝速率，從而延緩老化。萌發(fā)前，維生素E溶液浸泡種子有助于改善種子老化對活力產(chǎn)生的的負(fù)面影響［30］。Sattler等［31］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了兩個與維生素E基因合成的相關(guān)位點(diǎn) （ VTE1和 VTE2） ，任意一個位點(diǎn)突變都會導(dǎo)致種子的壽命顯著降低。谷胱甘肽可以直接充當(dāng)ROS淬滅分子，也可以充當(dāng)電子供體，為參與ROS解毒的酶提供電子。谷胱甘肽還原酶可將氧化型谷胱甘肽還原為巰基形式，干燥的種子中存在的谷胱甘肽還原酶在水合作用時(shí)可被迅速激活［24］。輔酶Q10也是一種抗氧化化合物，可以通過解毒ROS來幫助維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，此外其還能影響線粒體電子傳遞鏈中相關(guān)酶的功能［5］。

2.3.3 蛋白質(zhì)合成下降，小分子蛋白產(chǎn)生 種子老化過程中涉及到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)損傷、功能受損、合成受阻等多方面不利影響，從而導(dǎo)致多種代謝過程紊亂以及修復(fù)防御系統(tǒng)失效。牛油果 （Persea americana Mill.） 種子的種皮和子葉組織在離體后5 d總蛋白質(zhì)濃度急劇下降，之后到保質(zhì)期結(jié)束未再發(fā)生明顯變化［32］。高活力種子胚在吸脹期間的蛋白合成速率均高于中、低活力種子。易衰老種子在人工老化過程中貯藏蛋白含量下降，而貯藏蛋白對ROS有高親和力，能夠消耗過量的ROS保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。種子活力與萌發(fā)時(shí)貯藏蛋白的降解效率和新蛋白的合成速率一致［33］。

在種子貯藏期間抗逆性蛋白的含量通常會增加，以提升種子的抗老化能力。胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白 （late embryogenesis abundant proteins， LEA） 和熱激蛋白（heat shock proteins， HSP） 在種子脫水干燥期間都能對細(xì)胞起到保護(hù)作用。LEA蛋白通過形成氫鍵影響其他蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，提高變性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性并促進(jìn)其重折疊，保護(hù)膜蛋白和酶免受高鹽脅迫的有害影響［29］。Renard等［34］通過全基因組關(guān)聯(lián)分析篩選到了擬南芥調(diào)控LEA合成的基因SSLEA，該基因的T-DNA插入突變體在人工老化和自然老化情況下都明顯表現(xiàn)出了萌發(fā)率下降。Shu等［35］對高溫高濕處理后的大豆種子進(jìn)行RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)，熱脅迫下種子多數(shù)HSP表達(dá)量增高，例如與種子抗老化能力相關(guān)的熱激轉(zhuǎn)錄因子 （heat stress transcription factors， HSFs）。種子特異性熱激轉(zhuǎn)錄因子A9 （HSFA9） 的靶基因編碼多種HSP，參與調(diào)節(jié)種子壽命［36］。

2.3.4 衰老過程中的激素變化 脫落酸 （ABA） 可以激活LEA和sHSP等蛋白的合成，從而影響種子的耐旱性和對不利環(huán)境因素的耐受性，也可提高種子的耐儲藏性。ABA-INSENSITIVE3 （ABI3） 和ABA-INSENSITIVE5 （ABI5）是ABA調(diào)控途徑中的重要調(diào)控因子，參與調(diào)控種子成熟、棉子糖系列寡糖的代謝和LEA基因的表達(dá)［36］。熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFA9 ，作用于ABI3下游并控制sHSP的發(fā)育調(diào)控表達(dá)，是調(diào)控耐老化遺傳機(jī)制中的重要部分。 OsGH3-2通過調(diào)節(jié)ABA的積累水平從而抑制LEA的積累來影響種子的貯藏性，RNAi干擾系中ABA含量相較于野生型增加了1.5倍［37］。

生長素 （IAA） 可以通過影響其下游蛋白進(jìn)而對生長素響應(yīng)因子 （auxin response factor， ARF） 活性進(jìn)行調(diào)控，并影響種子衰老過程。吲哚丙酮酸 （indole pyruvate pathway， IPA） 途徑是生長素生物合成的主要途徑，IPA途徑的突變體生長素水平略有降低卻表現(xiàn)出了更強(qiáng)的生長素反應(yīng)，同時(shí)壽命增加20%～30%，這可能是由于在成熟后期生長素在整個胚胎中的重新分布［38］。Yuan等［37］研究證明，OsGH3-2可促進(jìn)IAA與Asp結(jié)合，導(dǎo)致內(nèi)源性IAA降解。玉米? zmdreb2a基因突變體的基因?? GH3-2表達(dá)受到抑制，種胚中生長素含量較對照顯著升高，種子發(fā)芽后胚根和胚芽伸長，但耐老化能力顯著降低［39］。但是研究者認(rèn)為，突變體種子耐老化能力降低是因?yàn)槊拮犹呛铣上嚓P(guān)基因受到影響，是否與IAA含量變化相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。IAA通過刺激ABA信號傳導(dǎo)在調(diào)節(jié)種子活力中發(fā)揮關(guān)鍵作用。低濃度IAA可抑制ABA生物合成并誘導(dǎo)發(fā)育種子中的ABA代謝，IAA還參與誘導(dǎo)ABI3及LEA蛋白靶標(biāo)EM1的表達(dá)［37-38］。

除了IAA與ABA外，種子儲藏期間，茉莉酰異亮氨酸和水楊酸等其他激素含量也會發(fā)生變化［16］。這表明老化過程中的代謝調(diào)控不止單一激素作用，是多種激素平衡的結(jié)果，但目前關(guān)于激素平衡與種子衰老的關(guān)系鮮有報(bào)道。此外，關(guān)于種子老化和植物激素間的關(guān)系，目前的研究多數(shù)以激素變化為“因”，活力變化為“果”，直接通過人工方式增加或減少激素含量，而無法反映激素本身在老化過程中的變化。

2.4 種子衰老的遺傳機(jī)制

2.4.1 與衰老相關(guān)的基因及其定位 種子的耐老化特性通常為多基因控制的數(shù)量性狀，近年來利用多種技術(shù)手段，國內(nèi)外學(xué)者對種子衰老相關(guān)基因展開研究并取得一定成果。一些與種子耐老化相關(guān)的基因位點(diǎn)已被公布 （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 。不同品種在耐老化性能上會表現(xiàn)出差異性，在衰老相關(guān)數(shù)量性狀基因座 （quantitative trait locus， QTL） 定位的研究中，通常選用粳稻和秈稻這兩個極端亞群的雜交系作為研究對象。水稻種子耐老化相關(guān)基因位點(diǎn)在12條染色體上均有分布，其中第9號染色體上分布最多［40］。Yuan等［41］利用粳稻Nipponbare和秈稻9311的回交重組自交系構(gòu)建高密度單核苷酸多態(tài)性遺傳連鎖圖，鑒定了7個在自然老化條件下與老化相關(guān)的QTLs，分布在1、2、3、8、9和11號染色體上，并將一個控制種子老化的主效QTL （qG4S3.1） 精細(xì)定位在第3號染色體的26.2 kb區(qū)間。也有研究認(rèn)為種子活力是由多個微效基因共同作用，并不存在主效基因。例如，姜旋等［42］的研究定位了7個控制水稻種子活力的QTLs，分布在4條染色體上，單個QTL對性狀的貢獻(xiàn)率在5%～16%。在其他物種方面，通過人工老化處理，Wu等［43］在甜玉米中鑒定出18個QTLs，同時(shí)篩選了4個與種子活力相關(guān)的候選基因。

2.4.2 與衰老相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄因子 （transcription factors， TFs） 能與真核基因啟動子結(jié)合，從而激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，作為一種調(diào)節(jié)蛋白在多種生物途徑中都起到重要作用。在劉文童等［44］篩選的種子活力候選基因中，? GRMZM2G164082屬于WRKY基因家族，與萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)有關(guān)。在大麥中發(fā)現(xiàn)的HvERKY38對α-淀粉酶的表達(dá)起抑制作用，而HvERKY38的合成又受到激素調(diào)控，SA和ABA都能激活HvERKY38表達(dá)，GA則起抑制作用［45］。轉(zhuǎn)錄因子DOF4.1是種子壽命的負(fù)調(diào)節(jié)因子，擬南芥? DOF4-1功能缺失突變體種子在人工老化后表現(xiàn)出比野生型更高的活力［46］。Han等［39］關(guān)于DREB轉(zhuǎn)錄因子家族的研究發(fā)現(xiàn)，ZmDREB2A與調(diào)控棉子糖合成酶基因ZmRAFS啟動子的DRE基序結(jié)合上調(diào)其表達(dá)，可以直接調(diào)控種胚中棉子糖的積累水平從而影響了玉米種子的耐老化能力。而轉(zhuǎn)錄因子DELAY OF GERMINATION 1-like 4 （DOGL4） 可觸發(fā)約70個種子成熟特異性基因的表達(dá)，包括編碼白蛋白、十字花科蛋白和油質(zhì)蛋白等儲存蛋白的基因，被認(rèn)為是種子中貯藏物質(zhì)積累的主要調(diào)節(jié)因子［47］。NAC轉(zhuǎn)錄因子屬于植物特異性TF家族，響應(yīng)多種生物和非生物脅迫。在擬南芥中NAC轉(zhuǎn)錄因子JUB1過表達(dá)能夠延長種子壽命［48］。熱激轉(zhuǎn)錄因子能夠提高HSPs的含量，增強(qiáng)種子在高溫下的抗老化能力［49］。其他轉(zhuǎn)錄因子Bhlh，MYB和C2H2家族等在種子經(jīng)過高溫老化處理后也會發(fā)生變化，許多都與種子老化相關(guān)［48］。

2.4.3 與衰老相關(guān)的表觀遺傳 5-甲基胞嘧啶 （m5C） 是植物中一種保守的表觀遺傳標(biāo)記，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，對保持種子基因組完整性有重要作用。在頑拗型夏櫟 （Quercus robur Linnaeus）種子中，萌發(fā)率的降低與m5C水平的下降高度相關(guān) （P<0.001），m5C含量降低為初始含量的60%時(shí)是種子活力降低的關(guān)鍵時(shí)期。正常型西洋梨 （Pyrus communis Linn.） 種子儲存1 a后DNA甲基化水平反而顯著增加［50］。相較而言，正常型種子遺傳完整性更高，而頑拗型種子往往基因表達(dá)水平低，因此，維持高DNA甲基化水平的能力是正常型種子壽命長的原因之一。m5C水平和種子活力正相關(guān)的特性，使得其可作為一種反應(yīng)種子活力的分子標(biāo)記，Michalak等［51］還提出可以通過m5C水平預(yù)測種子的發(fā)芽能力。DNA低甲基化也可能解除染色質(zhì)的緊密堆積并促進(jìn)萌發(fā)相關(guān)基因的表達(dá)。DNA去甲基化基因? ROS1缺失通過影響發(fā)芽相關(guān)基因表達(dá)而損害種子發(fā)芽［52］。

2.5 種子衰老損傷修復(fù)

2.5.1 蛋白質(zhì)修復(fù) 蛋白質(zhì)主要依靠氧化還原機(jī)制免受脫水傷害。在種子成熟和脫水過程中，蛋白質(zhì)的還原性巰基被氧化產(chǎn)生以二硫鍵連接的穩(wěn)定二硫化物，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更緊密，減弱脫水作用對其活性的抑制，并防止其被蛋白酶水解。萌發(fā)完成后，種子蛋白質(zhì)形成的二硫化物又會在硫氧還原蛋白的作用下恢復(fù)巰基形式。此外，氧化脅迫會導(dǎo)致蛋白質(zhì)側(cè)鏈發(fā)生共價(jià)修飾，這些修飾大多是不可逆的，但某些氨基酸殘基的氧化是可逆的。甲硫氨酸亞砜還原酶? （methionine sulfoxide reductase， MSR） 可清除甲硫氨酸氧化形成的甲硫氨酸亞砜，可逆地修復(fù)氧化蛋白。苜蓿種子合成MSR的能力與其壽命之間存在正相關(guān)關(guān)系， MSR將甲硫氨酸亞砜還原為甲硫氨酸有助于維持模式豆科植物苜蓿種子的活力［53］。種子老化中羰基化產(chǎn)物的作用也是蛋白質(zhì)損傷的主要原因之一，醛酮還原酶家族1 （aldo-keto reductase1， AKR1） 可以催化羰基化合物的轉(zhuǎn)化。在煙草和水稻中的過表達(dá)AKR1可以降低羰基化合物含量，延長煙草和水稻的種子壽命［54］。前文中提到的HSP和LEA也可確保合成蛋白質(zhì)的正確折疊、防止氧化損傷以及損傷后的重折疊，參與蛋白質(zhì)損傷的修復(fù)。

2.5.2 DNA修復(fù) 老化造成的DNA損傷包括無堿基位點(diǎn)產(chǎn)生、堿基的共價(jià)修飾、單鏈 DNA 斷裂和 DNA 雙鏈斷裂等［55］，這些損傷主要由氧化脅迫引起，堿基的共價(jià)修飾也可能是美拉德反應(yīng)的結(jié)果［5］。人工老化的豌豆種子中，DNA斷裂隨著種子老化而累積，導(dǎo)致老化種子中 DNA 復(fù)制開始之前的 DNA 修復(fù)合成時(shí)間延長，老化種子發(fā)芽所需的時(shí)間是未老化處理種子的兩倍［56］。種子萌發(fā)階段的吸脹時(shí)期是DNA修復(fù)的重要時(shí)期。DNA 修復(fù)基因在擬南芥吸水3 h后高度表達(dá)［57］，水稻在吸脹后DNA小片段也明顯減少［20］。種子中受損 DNA 的修復(fù)依賴于所有真核細(xì)胞的通用機(jī)制：非同源末端連接 （non-homologous end joining， NHEJ）、同源重組 （homologous recombination， HR）、核苷酸切除修復(fù) （nucleotide excision repair， NER）、堿基切除修復(fù) （base-excision repair， BER） 和未配對 DNA 堿基的校正。多種DNA連接酶 （DNA Ligase， LIG） 參與DNA損害的修復(fù)過程，影響種子的壽命長短［57］。

2.5.3 RNA修復(fù) RNA的親水基團(tuán)“-OH”使得其易水解，mRNA的單鏈結(jié)構(gòu)比雙鏈DNA更不穩(wěn)定，非常容易受到ROS的氧化損傷。mRNA 結(jié)構(gòu)的改變可能導(dǎo)致翻譯受阻，而翻譯活性的喪失與種子萌發(fā)率的降低有關(guān)［5］。成熟干種子可以在轉(zhuǎn)錄抑制劑的存在下發(fā)芽，但是會被翻譯抑制劑阻斷，這說明萌發(fā)所需的蛋白質(zhì)直接由成熟干種子中預(yù)先存在的 mRNA 模板翻譯而來［58］。植物的RNA 修復(fù)系統(tǒng)包括 ATP 依賴性 RNA 連接酶、核苷酸轉(zhuǎn)移酶和修飾 RNA 末端以進(jìn)行連接 （磷酸酶和激酶） 或保護(hù) （甲基化酶） 的酶，但種子中的RNA修復(fù)機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

3 影響種子衰老的因素

3.1 種子質(zhì)量對衰老的影響

3.1.1 糖類含量與組成 許多干種子中都含有大量的寡糖。誘導(dǎo)表達(dá)棉子糖水解酶基因? ZmAGA1既可以提高種子棉子糖含量和耐儲性，又可以提高種子萌發(fā)過程中棉子糖的水解能力和萌發(fā)速度［59］。Christina Walters研究的溫度-水活性模型展現(xiàn)了種子中的水分狀態(tài)，玻璃態(tài)模型則展現(xiàn)了水溶液的狀態(tài)，兩個模型都假定了狀態(tài)的變化會影響種子內(nèi)部發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)和物理反應(yīng)［60］。種子的耐貯性與其細(xì)胞胞內(nèi)的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度 （class-to-liquid transition temperature， Tg） 密切相關(guān)。棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖等寡糖可以通過增加粘度和從玻璃態(tài)到液體態(tài)的Tg提高胞內(nèi)玻璃態(tài)的穩(wěn)定性。在巴西本土樹種紅蘚 （Paubrasilia echinata） 的種子含水量發(fā)生顯著變化之前，蔗糖和RFO含量就會開始上升，在種子成熟后期從液泡儲備重新分配到細(xì)胞質(zhì)中，可能有助于將細(xì)胞玻璃態(tài)的維持，與種子干燥耐受性和壽命呈正相關(guān)［61］。

干燥種子中酶促反應(yīng)較弱，而非酶促反應(yīng)A-M反應(yīng)即使在非常低的含水量條件下也能發(fā)生［5］。衰老過程中還原糖含量和糖基化蛋白的關(guān)系，以及其和衰老程度表現(xiàn)出的負(fù)相關(guān)關(guān)系，可以用A-M反應(yīng)來解釋。A-M反應(yīng)是指在初始羰基胺反應(yīng)后發(fā)生的一系列復(fù)雜反應(yīng)，通常遵循4個步驟： （1） 還原糖、醛糖或酮糖與蛋白質(zhì)或核酸的游離氨基進(jìn)行非酶促縮合形成糖胺 （可逆步驟） ； （2） 重排糖胺轉(zhuǎn)化為 Amadori 產(chǎn)物、1-氨基-α-脫氧酮糖； （3） Amadori 產(chǎn)物降解和脫水為氨基或羰基中間體； （4） 羰基中間體與其他氨基反應(yīng)，隨后重排形成高級糖基化終產(chǎn)物 （AGE-產(chǎn)物） 。前文中提到了A-M反應(yīng)通過形成糖基化蛋白質(zhì)，影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，除此之外其還能對DNA進(jìn)行修飾影響其轉(zhuǎn)錄。果糖、半乳糖和葡萄糖等還原糖的存在是 A-M反應(yīng)的主要驅(qū)動力。大豆中，棉子糖和水蘇糖在貯藏過程中水解形成還原糖，一旦形成，這些還原糖會在美拉德反應(yīng)中被迅速消耗掉［62］。

3.1.2 脂類含量與組成 種子內(nèi)的脂類包括貯藏脂質(zhì)和結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。貯藏脂質(zhì)如甘油三脂 （triacylglycerol， TAGs） ，是主要儲能物質(zhì)。結(jié)構(gòu)脂質(zhì)如膜脂，包括磷脂酰膽堿 （phosphatidylcholine， PC） 、單半乳糖甘油二酯 （monogalatosyl diglyceride， MGDGs） 和雙半乳糖甘油二酯 （digalactosyl diglyceride， DGDGs） 等，是生物膜的主要組成成分。TAGs、PCs和DGDGs是貯藏脂質(zhì)和膜脂合成途徑的最終產(chǎn)物，在處于休眠狀態(tài)的種子中不會通過酶促反應(yīng)積累。相比之下，通過種子老化過程中的甘油酯、磷脂 （phospholipid， PL） 或半乳糖脂 （galactolipid， GL） 水解可以少量生成甘油二酯 （diacylglycerol， DAGs） 、單酰甘油 （monoacylglycerol， MAGs） 和脂肪酸 （fatty acid， FA） ［63］。Wiebach等［64］研究分析表明，在種子儲藏過程中完全?；头茄趸膬Υ嬷|(zhì) （如三酰基甘油） 和結(jié)構(gòu)脂質(zhì) （如磷脂和半乳糖脂） 的水平下降。隨著自然老化時(shí)間的延長，花生種子油酸含量增高，亞油酸含量降低［65］。

完整脂質(zhì)的含量減少與脂質(zhì)氧化損傷有關(guān)，長期儲存的小麥種子中會形成數(shù)百種不同種類的單一和多重氧化脂質(zhì)［63］。大量氧化變體和水解產(chǎn)物 （如DAGs、MAGs和FA） 會隨著小麥活力的下降而積累［64］。1998年收獲的小麥種子在自然條件下貯藏19 a后，40%的TAGs被氧化，其含量的減少與氧化TAG s的積累同時(shí)發(fā)生［63］。然而，氧化可能不是完整脂質(zhì)含量減少的唯一原因。不飽和脂肪酸比飽和脂肪酸更易氧化。但是與正常種子相比，頑拗型種子中膜磷脂中的飽和脂肪酸水平更高［66］。小麥完整膜脂含量的減少與它們的氧化產(chǎn)物的積累不一致（如PCs、MGDGs和DGDGs），而氧化膜脂的水平降低與GL含量密切相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)表明，除氧化外還有其他途徑導(dǎo)致完整PL和GL含量的減少［63］。

3.1.3 蛋白質(zhì)含量與組成 種子老化過程中也會涉及到蛋白質(zhì)組成的變化，通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)可以挖掘出與種子活力相關(guān)的蛋白。氧化損傷的發(fā)生，主要影響與能量產(chǎn)生、新陳代謝和防御相關(guān)的蛋白質(zhì)豐度。胡根海等［67］的研究表明，老化處理5 d后小麥 （Triticum aestivum L.） 種子水溶蛋白降解加速，第5～6天水溶蛋白部分組分消失，鹽溶和醇溶特征條帶出現(xiàn)并增強(qiáng)。在不同儲藏時(shí)間的中國古代蓮 （Nelumbo nucifera Gaertn） 種子蛋白組學(xué)比較研究中定量鑒定到? 4? 002種蛋白質(zhì)，其中有558種差異性積累蛋白，涉及淀粉和蔗糖代謝、細(xì)胞膜穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)加工、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等生理活動，參與抗氧化系統(tǒng)和維持核酸穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)在貯藏期間大多上調(diào)［68］。

3.1.4 含水量 在一定范圍內(nèi)，種子含水量越低，壽命越長，萌發(fā)率也就相對越高。含水量過高的種子代謝旺盛，貯藏營養(yǎng)物質(zhì)也易消耗，使得活力下降較快，種子老化進(jìn)程提前，極易發(fā)生吸潮霉變。低溫下保持種子干燥狀態(tài)，可以最大限度地降低種子的代謝速率，但高含水量種子在低溫條件下自由水結(jié)冰也會損害其生存能力。在含水量為14%以上時(shí)，種子中水分含量每增加1%，活力就會降低50%［4］。某些非酶促反應(yīng)甚至可以發(fā)生在含水量非常低的種子中，影響蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸等分子的含量和功能［5］。雖然降低種子含水量可以提高種子的貯藏性和穩(wěn)定性，但過度干燥會破壞覆蓋細(xì)胞結(jié)構(gòu)的水膜界面并暴露膜的大分子，使其容易受到 ROS 的影響［29］。Ellis等［69］的研究表明，在適宜的儲藏溫度下，紫花苜蓿和紅車軸草 （Trifolium pratense L.） 種子的最適貯藏含水量在4%～6%，受環(huán)境溫度影響。一般來說，種子的活力及其抗衰老能力在? 4.78%～6.55%的水分含量內(nèi)相對較強(qiáng)，其他物理化學(xué)活性變化幅度也都較低。但不同物種種子的最佳含水量差異很大，同類種子的不同品種也有較大差異［70］。因此，了解每個物種的最佳水分含量對保持種子活力和壽命非常重要，有必要涉及各種物種及其生物共生體做進(jìn)一步儲存研究。

3.2 環(huán)境因素

3.2.1 濕度 貯藏期間，空氣相對濕度會直接影響種子水分含量，高濕度的情況下 （相對濕度70%以上） ，種子的酶活性增強(qiáng)，其代謝隨著種子含水量的增加而增強(qiáng)。紅豆杉［Taxus chinensis （Pilger） Rehd.］種子中可溶性糖、脫氫酶和葡萄糖六磷酸脫氫酶含量隨濕度的增加均呈現(xiàn)先降低后升高趨勢，粗脂肪含量逐漸下降［71］。花生作為油料作物，富含大量不飽和脂肪酸，在濕度較高的貯藏環(huán)境下，由于脂肪酶的作用，種子里的脂肪分解變?yōu)轱柡椭舅幔够ㄉN子的生活力下降［72］。適宜的濕度可以讓種子達(dá)到最佳貯藏狀態(tài)。

3.2.2 溫度 種子貯藏前需高溫干燥，但溫度過高會對種子造成傷害，例如，增加大豆種子的干燥溫度到40 ℃以上后，幼苗生長受到顯著影響，尤其是對根長的影響［73］。其原因是因?yàn)楦稍锼俾实脑黾訒?dǎo)致種子分生組織受損，從而損害胚胎軸的發(fā)育，加速種子老化。若儲藏溫度較高，種子的代謝更為旺盛，貯藏物質(zhì)不穩(wěn)定、易消耗，也會導(dǎo)致種子活力快速下降。貯藏溫度還會與其他條件因素共同影響種子的老化進(jìn)程。草木樨 （Melilotus suaveolens Ledeb.） 的種子萌發(fā)率、電導(dǎo)率、可溶性糖以及MDA含量會受到溫濕度共同作用的影響，其儲藏的最宜溫度和含水量分別為4 ℃和10%［74］。種子基因庫采用低溫條件對種子進(jìn)行儲藏，以延緩種子衰老，保持種子活力［23］。不過，長期貯藏于同一環(huán)境可能會增加種子對潛在損害的敏感性，甚至惡化變質(zhì)，從而降低產(chǎn)品的儲存潛力及其生理質(zhì)量。例如，三七 （Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen） 不宜長期采取低溫儲藏，長期低溫貯藏會導(dǎo)致酶活性整體下降［75］。

3.2.3 氣體成分 種子老化與氧氣、二氧化碳、氮?dú)獾葰怏w含量也有直接關(guān)系。氧氣充足可促進(jìn)種子的呼吸，貯藏物質(zhì)分解過快，積累有害物質(zhì)，從而加快種子的老化。通過水肺潛水罐增加氧氣濃度提高壓強(qiáng)到18? kPa，可以達(dá)到加速老化的目的［36］。Hourston等［76］對雜交洋蔥 （Allium cepa L.×Allium fistulosum L.cv.‘Guardsman）種子進(jìn)行高氧分壓儲存研究，也得到類似結(jié)論。氧氣含量較低時(shí)，種子內(nèi)貯藏物較為穩(wěn)定，不易老化。如白術(shù) （Atractylodes macrocephala Koidz.） 在低溫條件下密封儲存比通風(fēng)貯藏更能延長種子壽命［77］。但是缺氧也易造成種子無氧呼吸產(chǎn)生有害物質(zhì)，大幅度降低種子壽命?；钚缘^量可能導(dǎo)致氧化損傷，以及膜損傷，細(xì)胞死亡并隨后降低發(fā)芽速率、生長及產(chǎn)量。近年也有針對氬氣在種子貯藏過程中相關(guān)作用的研究，氬氣貯藏能夠降低種子的相對導(dǎo)電率及MDA和H2O2含量，提高SOD、APX的活性［78］。除了上述生理影響，氣體還對種子有著物理影響，儲藏時(shí)常通風(fēng)有利于散熱散濕。

4 展? 望

種子老化是一個復(fù)雜的過程，既受自身遺傳物質(zhì)的調(diào)控，也受環(huán)境條件影響。活力衰退也是種子長期貯藏中不可避免的事件，涉及到多樣的變化和調(diào)控，老化事件包括了酶活性失調(diào)、ROS積累、脂質(zhì)過氧化、生物大分子損傷以及激素含量變化等［4， 29］。動態(tài)監(jiān)控或利用模型定量估計(jì)ROS和A-M產(chǎn)物等老化相關(guān)化學(xué)物質(zhì)在老化種子不同組織部位的分布、軌跡，有利于探討種子不同部位的老化情況以及判斷老化的獨(dú)立性或者相依性的機(jī)理。

由于自然條件，尤其非極端干燥或低溫條件下，種子老化過程復(fù)雜且緩慢，采用人工老化技術(shù)加速種子活力喪失，可以促進(jìn)種子衰老研究［36］，然而自然條件和人工條件對種子衰老的影響存在差異［2］，因此如何用人工老化結(jié)果估計(jì)自然條件下種子衰老是亟待解決的問題。

分子標(biāo)記、組學(xué)研究和基因功能驗(yàn)證等技術(shù)的進(jìn)步以及生物資源和公共數(shù)據(jù)庫的建立與共享極大地推動了種子壽命相關(guān)基因的鑒定，這對種子老化的分子機(jī)制的理解做出了重大貢獻(xiàn)。目前，多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析已被應(yīng)用于種子發(fā)育、成熟和休眠調(diào)控等多個領(lǐng)域，但是在種子衰老領(lǐng)域卻少有應(yīng)用。從基因、轉(zhuǎn)錄組、蛋白、代謝物4個維度綜合分析能夠更好地探究在種子衰老過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為通過分子手段開展衰老種子生產(chǎn)提供依據(jù)。

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Advance in Research on Mechanism of Plant Seed Senescence

WEI Yongsheng1，PENG Qilang1， HUANG Yingao2，CHEN Yanru3， ZHAO-CHENG? Yafei4 and XI Xinyue1

（1.College of Life Sciences，Northwest A&F University，Yangling Shaanxi 712100， China; 2.College of

Plant Protection，Northwest A&F University， Yangling? Shaanxi 712100， China;3.College of Horticulture

and Gardening，Southwest University，Chongqing 400715， China;4.College of? Landscape

Architecture and Art，Northwest A&F University，Yangling Shaanxi 712100， China）

Abstract Senescence of seed during storage can result in delayed seedling establishment， which may eventually lead to aberrant seedlings and compromising crop yield.Moreover， seed longevity significantly affects the germplasm renewal rate and the survival of wild plants in their natural hibitats.Therefore， understanding the principle of seed senescence holds profound theoretical and practical implications for secure preservation of germplasm resources and sustainable agricultural production.This review outlines the manifestations of? seed senescence and investigates both the internal and external factors contributing to this process from genetic determinants to phenotypic outcoms，including anatomical， subcellular structural， physiological-biochemical， molecular biological aspects， and environmental factors.This review constructs a complete network diagram of seed senescence， the aim is to provide a fundamental theoretical framework for future research into seed senescence mechanism， seed vigor repair and germplasm resource conservation.

Key words Plant Seed; Senescence; Molecular mechanism; Longevity

Received ?2022-10-18??? Returned 2023-02-08

Foundation item the Undergraduate Training Program for Innovation and Entrepreneurship of Northwest A&F University（No.X202210712418，No.202310712469）.

First author WEI Yongsheng，male，Ph.D，professor.Research area：plant stress and nutrition physiology，biology? model.E-mail：wysh70@nwsuaf.edu.cn

PENG Qilang， female，undergraduate student.Research area：seed senescence， prediction model of seed longevity.E-mail：pqlang@126.com

Corresponding?? author WEI Yongsheng.

（責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）