外周血miR-497表達(dá)在缺血性腦卒中診斷和預(yù)后評價中的應(yīng)用

趙云肖，曾柳苑

摘要目的：研究外周血miR-497 mRNA表達(dá)水平對不同類型缺血性腦卒中的診斷價值及預(yù)后預(yù)測效能。方法：入選我院收治的650例缺血性腦卒中病人，經(jīng)臨床診斷后將病人分為短暫性腦缺血發(fā)作（TIA）組、可逆性腦缺血損傷（RIND）組、進(jìn)展性卒中（SIP）組和完全性卒中（CS）組。另選取同期在我院體檢的健康體檢者50名納入對照組。采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法檢測外周血血清中miR-497 mRNA表達(dá)水平，比較不同類型缺血性腦卒中病人和對照組miR-497表達(dá)水平，并進(jìn)行9個月隨訪。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析miR-497對不同類型缺血性腦卒中的診斷效能及對病人預(yù)后的預(yù)測效能。結(jié)果：腦卒中病人入院時血清miR-497表達(dá)水平低于對照組（P＜0.001），4組間的miR-497水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。腦卒中病人出院時miR-497水平高于入院時（P＜0.05），4組間的miR-497水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。ROC曲線顯示：入院時miR-497水平診斷缺血性腦卒中的ROC曲線下面積（AUC）為0.729，最佳診斷閾值為＜4.902，敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為73.85%、70.00%、96.97%、17.07%。出院時miR-497水平預(yù)測缺血性腦卒中病人預(yù)后良好的AUC為0.614，最佳診斷閾值為＜2.720，此時預(yù)測敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為30.96%、95.33%、93.10%和40.40%。結(jié)論：缺血性腦卒中病人血清miR-497水平明顯下降，且miR-497水平降低提示缺血性腦卒中病人病情進(jìn)展和預(yù)后不良。

關(guān)鍵詞缺血性腦卒中；miR-497；疾病進(jìn)展；預(yù)后

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.08.030

腦卒中是一種急性腦血管疾病，在中老年人中發(fā)病率較高。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2012年報告，腦卒中已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)僅次于冠心病和癌癥的第三大死亡原因。目前認(rèn)為，腦卒中發(fā)病是由于腦血管破裂或阻塞，導(dǎo)致血流不能完成正常的腦循環(huán)，腦組織氧化應(yīng)激和炎性損傷［1］。缺血性腦卒中是腦卒中最常見的類型，占所有病例的60%～70%［2］。臨床上對缺血性腦卒中的診斷和治療較為復(fù)雜，主要通過相關(guān)血液學(xué)標(biāo)志物結(jié)合頭顱影像進(jìn)行診斷［3］。但一直缺少良好的血清學(xué)指標(biāo)用于缺血性腦卒中的篩查、診斷和預(yù)后評價，造成部分病人無法及時預(yù)防、干預(yù)和治療，造成不可逆的神經(jīng)損傷，甚至危及生命。研究發(fā)現(xiàn)，miR-497在腦梗死等多種腦血管疾病的發(fā)生和進(jìn)展中起到重要作用［4］。Chen等［5］經(jīng)過大鼠實驗發(fā)現(xiàn)，抑制miR-497表達(dá)通過增強年輕和老年大鼠的神經(jīng)元自噬改善缺血性中風(fēng)后的功能結(jié)果。Zhong等［6］則發(fā)現(xiàn)miR-497低表達(dá)可能導(dǎo)致缺血性腦卒中進(jìn)展。但目前尚鮮見關(guān)于miR-497與缺血性腦卒中病人診斷和預(yù)后關(guān)系的研究報道。本研究旨在探究miR-497在缺血性腦卒中病人外周血的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1臨床資料

選取2020年2月—2021年6月我院收治的650例缺血性腦卒中病人，經(jīng)臨床診斷后分為短暫性腦缺血發(fā)作（transient ischemic attack，TIA）197例、可逆性腦缺血損傷（reversible ischemic neurologic deficit，RIND）190例、進(jìn)展性卒中（stroke in progression，SIP）181例、完全性卒中（complete stroke，CS）82例。另選取同期在我院體檢的健康體檢者50名納入對照組。5組臨床資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。詳見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：1）符合《2018美國卒中協(xié)會/美國心臟協(xié)會急性缺血性卒中病人早期管理指南》［7］中缺血性腦卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；2）接受早期溶栓治療；3）無腦卒中常規(guī)藥物禁忌證；4）接受隨訪；5）未接受相關(guān)治療；6）已簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）伴有惡性腫瘤、心腦血管疾病者；2）合并有免疫系統(tǒng)疾病者；3）合并有急性感染或在入院1個月內(nèi)接受過抗生素治療者；4）無法配合檢查者；5）入院前3個月有手術(shù)史者；6）妊娠期或哺乳期女性；7）預(yù)期壽命＜1個月者；8）非初診病人。

1.3治療方案

入院后所有病人均按照《2018美國卒中協(xié)會/美國心臟協(xié)會急性缺血性卒中病人早期管理指南》進(jìn)行治療，予以頭頸部血管造影、明確靜脈溶栓或機械取栓方案，并后續(xù)予以抗血栓或抗凝治療［7-8］。

1.4miR-497測定

病人在入院時和出院時采集5 mL空腹靜脈血，對照組在體檢時采集5 mL空腹靜脈血。室溫中靜置30 min后，于4 ℃、1 500 r/min離心15 min，收集上層清液儲存于－80 ℃冰箱待測。采用miRNA提取分離試劑盒（北京天根）提取血清中總RNA。以總RNA為模板，采用PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）合成互補DNA（complementary DNA，cDNA）。利用RealMaster Probe Kit試劑盒（北京天根）進(jìn)行實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測miR-497表達(dá)水平。其中正向引物序列為：3′-GGGGTTAACCAATTGG-5′，反向引物序列為：3′-TTTAAGCGGCCTATA-5′。所有反應(yīng)設(shè)置3個復(fù)孔和無模板的陰性對照，并以β-actin mRNA為內(nèi)參，計算標(biāo)準(zhǔn)化2－ΔΔCt值。

1.5隨訪與預(yù)后判斷

病人出院后進(jìn)行9個月隨訪，每個月通過門診、電話等方式進(jìn)行隨訪，內(nèi)容包括病人的精神狀態(tài)、用藥情況、恢復(fù)情況等。在末次隨訪時根據(jù)改良Rankin量表（mRS）評分評估病人預(yù)后情況：mRS評分＞2分，表明病人預(yù)后不良；mRS評分≤2分，表明病人預(yù)后良好。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理和分析。符合正態(tài)分布的定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行比較，多組間采用One-way ANOVA和最小顯著差異性（LSD）post-hoc檢驗進(jìn)行比較；定性資料采用例數(shù)和百分比（%）表示，比較采取χ2檢驗。采用受試者工作特征曲線（receiver operation characteristics，ROC）分析miR-497對預(yù)后的預(yù)測意義，計算ROC曲線下面積（area under curve，AUC）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1血清miR-497在腦卒中病人中的表達(dá)水平

入院時，腦卒中病人血清miR-497相對表達(dá)水平為4.09±1.23，顯著低于對照組的5.64±1.79（t＝－7.759，P＜0.001）；TIA組、RIND組、SIP組、CS組腦卒中病人的miR-497水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝252.366，P＜0.001），其中TIA組最高，CS組最低。出院時，各組腦卒中病人的miR-497水平較入院時升高（t＝3.482，P＜0.001），4組間miR-497水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝226.082，P＜0.001），其中TIA組最高，CS組最低。詳見表2。

2.2血清miR-497對腦卒中病人的診斷價值

采用ROC曲線對所有病人入院時miR-497表達(dá)進(jìn)行分析，AUC為0.729，對于腦卒中的最佳診斷閾值為＜4.902，詳見圖1。此時敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為73.85%、70.00%、96.97%、17.07%。對于4種不同類型腦卒中，miR-497的診斷閾值及相應(yīng)敏感度、特異度、AUC見表3。

2.3不同預(yù)后結(jié)局腦卒中病人miR-497水平比較

根據(jù)mRS評分結(jié)果，650例病人中有214例預(yù)后不良，436例預(yù)后良好，其中TIA組、RIND組、SIP組和CS組分別有43例、57例、72例和42例預(yù)后不良。各類型腦卒中預(yù)后良好組病人miR-497表達(dá)水平高于預(yù)后不良組（P＜0.05）。詳見圖2。

2.4出院時miR-497水平對預(yù)后的預(yù)測價值

對所有650例病人進(jìn)行為期9個月的隨訪，成功隨訪到584例病人，隨訪成功率為89.85%。對病人的預(yù)后進(jìn)行mRS評分，并采用出院時miR-497水平預(yù)測病人的預(yù)后情況。結(jié)果顯示，出院時miR-497表達(dá)水平預(yù)測腦卒中預(yù)后良好的ROC曲線的AUC為0.614，最佳診斷閾值為2.720，此時預(yù)測敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為30.96%、95.33%、93.10%和40.40%。詳見圖3。

3討論

缺血性腦卒中是一種發(fā)病率較高的心血管疾病，嚴(yán)重威脅人類生命健康和生活質(zhì)量，目前對于缺血性腦卒中的診斷主要依賴于體格檢查和影像學(xué)，且缺乏對其復(fù)發(fā)診斷的檢測方法［9］。探討缺血性腦卒中發(fā)病的分子機制目前仍是臨床研究的難點和熱點［10］。miRNAs是一種20～24個核苷酸長度的非編碼RNA，在各種生物通路中發(fā)揮重要作用，在對環(huán)境變化和應(yīng)激的細(xì)胞響應(yīng)中具有特定重要性，可以在血液、體液、組織和細(xì)胞等多種生物標(biāo)本內(nèi)檢測［11-12］，可以用于疾病大規(guī)模臨床篩查，能夠提高缺血性腦卒中的早期診斷效率［13-14］。miRNA能夠通過RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體降解或阻止靶信使RNA翻譯，從而參與調(diào)節(jié)靶蛋白的合成。在神經(jīng)病學(xué)領(lǐng)域，miRNs被認(rèn)為是大腦發(fā)育過程和病理事件的潛在調(diào)控因子。在缺血缺氧應(yīng)激后，細(xì)胞和分子事件引發(fā)了不同miRNAs的表達(dá)失調(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的長期進(jìn)展和擴大。由于其具有調(diào)節(jié)靶蛋白合成的能力，miRNA成為調(diào)控腦缺血事件后神經(jīng)元損傷的一種可能的治療策略。

miR-497屬于miR-15/107基因家族，該家族中miR-195在其他研究中也被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中存在異常表達(dá)。Sinoy等［15］研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中小鼠模型miR-497表達(dá)水平上調(diào)，并可能通過影響神經(jīng)元死亡促進(jìn)疾病進(jìn)展。 Yin等［16］研究也認(rèn)為miR-497過表達(dá)會導(dǎo)致小鼠神經(jīng)元丟失，加速腦卒中病情進(jìn)展，并影響預(yù)后。然而有研究表明miR-497在局灶性腦缺血中表達(dá)降低［17］。其他關(guān)于腦卒中以及腦缺氧缺血性損傷和miRNAs的研究報道中，均傾向于miR-497和miR-369可能通過影響細(xì)胞對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的反應(yīng)在腦神經(jīng)元壞死性凋亡過程中發(fā)揮作用。

本研究發(fā)現(xiàn)相對于健康人群，缺血性腦卒中病人外周血miR-497水平降低，也證實了miR-497異常低表達(dá)與腦卒中發(fā)病和進(jìn)展相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-497能夠降低白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和TNF-α等促炎因子表達(dá)水平［18］，對于缺血性腦卒中病人，miR-497水平降低可造成上述促炎因子表達(dá)增加，進(jìn)而造成腦卒中病情進(jìn)展。而關(guān)于腦膜瘤與miR-497的研究發(fā)現(xiàn)，腦膜瘤病人血清miR-497水平顯著低于正常人，高級別病人miR-497水平更低［19］。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，4種不同類型腦卒中病人入院時外周血miR-497表達(dá)水平存在顯著差異，其中CS病人水平最低，TIA病人水平最高，這說明miR-497水平降低可能與缺血性腦卒中進(jìn)展和嚴(yán)重程度相關(guān)。通過ROC曲線分析入院時miR-497在腦卒中診斷中的效能，結(jié)果顯示ROC曲線下面積為0.729，最佳診斷閾值為4.902時，此時預(yù)測腦卒中發(fā)生的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為73.85%、70.00%、96.97%、17.07%。對不同類型缺血性腦卒中診斷價值方面，病情越嚴(yán)重的類型，入院時miR-497表達(dá)水平的診斷性能越高，AUC、靈敏度和特異度越高。

進(jìn)一步的隨訪發(fā)現(xiàn)，預(yù)后良好病人出院時的miR-497表達(dá)水平更高，出院時miR-497表達(dá)水平預(yù)測腦卒中預(yù)后良好的AUC為0.614，最佳診斷閾值為2.720，此時預(yù)測靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為30.96%、95.33%、93.10%和40.40%。這也進(jìn)一步表明了miR-497對缺血性腦卒中的診斷和預(yù)后的預(yù)測具有一定的價值。

綜上所述，缺血性腦卒中病人血清miR-497水平明顯下降，且miR-497水平降低提示了缺血性腦卒中病人病情嚴(yán)重進(jìn)展和預(yù)后不良。本研究仍存在一些不足。首先，本研究雖然樣本量較大，但僅為單中心研究，樣本代表性不足；其次，本研究證明了miR-497與缺血性腦卒中有一定的關(guān)系，但并未對miR-497在不同性別、不同年齡的健康者與腦卒中病人間的表達(dá)進(jìn)行對比，同時并未明確血清中miR-497在腦脊液中表達(dá)的相關(guān)性，最后，本研究所涉及的隨訪周期較短，miR-497水平對腦卒中病人長期預(yù)后的影響評估不足。

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（收稿日期：2022-09-06）

（本文編輯王雅潔）