微血管內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體對血管性癡呆模型小鼠腦血管形成及神經(jīng)損傷的作用研究

林東曉，陳貞君，李華，黃星華

摘要目的：探究微血管內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體對血管性癡呆（VD）模型小鼠腦血管形及神經(jīng)損傷修復(fù)的影響。方法：采用超高速離心法提取小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3的外泌體，透射電子顯微鏡（TEM）觀察外泌體形態(tài)，納米顆粒追蹤分析（NTA）測定外泌體徑粒分布情況，蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）測定外泌體標(biāo)志蛋白CD63、TSG101、Alix表達(dá)；將40只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)（Sham）組、模型（Model）組、外泌體（b-Exo）組、陽性對照（DP）組，每組10只，除假手術(shù)組，其余3組小鼠均采用雙側(cè)頸總動脈縮窄法構(gòu)建VD模型，b-Exo組腹腔注射100 μL的b-Exo（100 μg/mL），DP組腹腔注射鹽酸多奈哌齊（1 mg/kg），假手術(shù)組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水，每日1次，持續(xù)28 d；Morris水迷宮行為學(xué)實驗分析小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察小鼠海馬組織病理學(xué)變化，免疫熒光染色檢測小鼠腦組織血管形成情況，Western Blot檢測小鼠海馬組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）蛋白表達(dá)水平，免疫熒光染色檢測小鼠海馬組織中神經(jīng)元特異核蛋白（NeuN）表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定小鼠血清腦損傷相關(guān)因子星形膠質(zhì)源性蛋白（S-100β）與神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）水平。 結(jié)果：從bEnd.3細(xì)胞分離的顆粒物呈圓形囊泡狀，CD63、TSG101及Alix蛋白均高表達(dá)，說明該顆粒物為外泌體，記為b-Exo；與假手術(shù)組比較，模型組小鼠逃避潛伏期延長，通過目標(biāo)象限次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時間百分比減少，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少，出現(xiàn)明顯病理學(xué)損傷，血管形成減少，VEGF蛋白相對表達(dá)量下調(diào)，NeuN表達(dá)減少，血清S-100β與NSE水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，b-Exo組和DP組小鼠逃避潛伏期縮短，通過目標(biāo)象限次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時間百分比增加，海馬CA1區(qū)損傷明顯減輕，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量有所增加，血管形成增加，VEGF蛋白相對表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05），NeuN表達(dá)增加，同時，血清中S-100β與NSE水平降低（P＜0.05）。結(jié)論：微血管內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體能明顯促進(jìn)VD小鼠的血管形成，并修復(fù)神經(jīng)損傷，對VD小鼠起到治療作用。

關(guān)鍵詞血管性癡呆；微血管內(nèi)皮細(xì)胞；外泌體；血管形成；神經(jīng)保護(hù)；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.08.010

Effect of Exosomes Derived from Microvascular Endothelial Cells on Cerebrovascular Formation and Neurological Injury in Vascular Dementia Model

LIN Dongxiao， CHEN Zhenjun， LI Hua， HUANG Xinghua

Cangshan Campus， The 900th Hospital of Joint Logistics Support Force， Fuzhou 350003， Fujian， China

Corresponding AuthorLI Hua， E-mail： lihua476476@126.com

AbstractObjective：To investigate the effects of exosomes derived from microvascular endothelial cells on cerebrovascular formation and nerve injury repair in vascular dementia（VD） model mice.Methods：The exosomes of mouse brain microvascular endothelial cells bEnd.3 were extracted by ultra-high-speed centrifugation method.The morphology of exosomes was observed by transmission electron microscopy（TEM），and the diameter distribution of exosomes was detected by nanoparticle tracking analysis（NTA）.The expressions of exosomal marker proteins CD63，TSG101 and Alix were detected by Western Blot.Forty mice were divided into Sham group，Model group，exosome group（b-Exo group） and positive control group（DP group） according to numerical random table method，with 10 mice in each group.Except for sham group，the VD model of the other 3 groups was constructed by bilateral common carotid artery constriction method，b-Exo group was intraperitoneally injected with 100 μL b-Exo（100 μg/mL），DP group was intraperitoneally injected with Donepezil hydrochloride（1 mg/kg），sham group and model group were intraperitoneally injected with equal volume normal saline，once a day，for 28 days.Morris water maze behavior experiment was used to analyze the learning and memory ability of mice，hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the histopathological changes of mice′s hippocampus，immunofluorescence staining was used to detect the formation of blood vessels in mouse brain tissue，and Western Blot was used to detect the expression level of vascular endothelial growth factor（VEGF） protein in mouse hippocampus.The expression of neuron-specific nucleoprotein（NeuN） in the hippocampus of mice was detected by immunofluorescence staining，and the levels of astroglia-derived protein（S-100β） and neuron-specific enolase（NSE） in serum of mice were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：The particles isolated from bEnd.3 cells showed a round vesicular shape，and CD63，TSG101 and Alix proteins were highly expressed，indicating that the particles were exosomes，denoted b-Exo.Compared with the sham group，the escape latency of mice in the model group? prolonged，the number of passing the target quadrant and the percentage of residence time in the target quadrant were reduced，the number of neurons in hippocampal CA1 region? reduced，there was obvious pathological injury，angiogenesis was reduced，the relative expression of VEGF protein down-regulated，and the expression of NeuN? reduced.Serum levels of S-100β and NSE increased（P＜0.05）.Compared with the model group，the escape latency of mice in the b-Exo group and DP group? shortened，the number of passing the target quadrant and the percentage of residence time in the target quadrant? increased，the damage in hippocampal CA1 region? significantly reduced，the number of neuron cells? increased，the formation of blood vessels increased，the relative expression of VEGF protein? up-regulated，and the expression of NeuN was increased.Serum levels of S-100β and NSE decreased（P＜0.05）.Conclusion：Exosomes derived from microvascular endothelial cells could significantly promote angiogenesis and repair neurological injury in VD mice，and play some therapeutic role in VD mice.

Keywordsvascular dementia; microvascular endothelial cells; exosomes; angiogenesis; neuroprotection; experimental study

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是一種獲得性智力損害綜合征，也是繼阿爾茨海默病之后第二大常見的癡呆病因，約占癡呆病例的20%［1］，主要由于長期暴露于腦缺血、缺氧損傷、腦動脈硬化等各種腦血管疾病中而引起［2］。VD持續(xù)發(fā)展會對病人的認(rèn)知功能、情緒以及記憶進(jìn)一步產(chǎn)生負(fù)面影響。近年來，隨著人口老齡化進(jìn)程的加快，腦血管疾病的發(fā)病率不斷上升，VD的發(fā)病率也在不斷上升，且該疾病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前臨床上治療VD的方法卻十分有限［3］。因此，探討VD的發(fā)病機(jī)制并尋找新型潛在療法意義重大。

外泌體是由各種細(xì)胞分泌的直徑為30～150 nm 的小膜包被的細(xì)胞外囊泡，其包含各種分子成分，包括來自母體細(xì)胞的蛋白質(zhì)和RNA，并且可以充當(dāng)橋接細(xì)胞間通訊的介質(zhì)［4］。越來越多的證據(jù)表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞外泌體可以通過改善血管生成、減少細(xì)胞凋亡和抑制炎癥等途徑為多種腦血管疾病的治療提供新方法［5-6］。例如，神經(jīng)干細(xì)胞來源的外泌體可以改善神經(jīng)功能損傷，減少腦卒中后的腦水腫［7］；星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體抑制神經(jīng)元凋亡和膠質(zhì)瘢痕形成，起到改善神經(jīng)功能及腦損傷的作用［8］。然而，關(guān)于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中外泌體的特征以及其介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞與腦內(nèi)其他細(xì)胞之間信號傳遞的作用報道卻很少。有研究指出，小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3來源的外泌體能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，這對腦缺血損傷后神經(jīng)與血管修復(fù)起到關(guān)鍵作用［9］。但腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體能否在VD中發(fā)揮作用仍缺少研究。本研究通過構(gòu)建VD小鼠模型，給予bEnd.3來源的外泌體干預(yù)后，通過檢測動物行為學(xué)、腦血管形成以及神經(jīng)損傷等相關(guān)指標(biāo)，以觀察bEnd.3來源的外泌體對VD小鼠的治療效果，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物

40只無特定病原體（SPF）級健康C57BL/6J小鼠，雄性，8～10周齡，體質(zhì)量25～30 g，由福州海王福藥制藥有限公司［生產(chǎn)許可證號：SCXK（閩）2020-0001］提供，并通過了中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九ＯＯ醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所有小鼠均飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物房內(nèi)，室溫為20～25 ℃，相對濕度為40%～60%，自動控制光照/黑暗12 h交替，實驗期間自由取食與飲水。

1.2主要材料與試劑

小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3購自廣州博輝生物科技公司，鹽酸多奈哌齊購自美國Selleck公司，外泌體提取試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，醋酸雙氧乙鈾購自上海吉至生化科技公司，RIPA裂解液、二喹啉甲酸法（BCA）檢測試劑盒、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜及增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色液購自上海碧云天生物研究所，二脒基苯基吲哚（DAPI）染液和蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京中衫金橋生物公司，星形膠質(zhì)源性蛋白（S-100β）檢測試劑盒與神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）檢測試劑盒購自上海仁捷生物科技公司，兔抗人CD63多克隆抗體、兔抗鼠TSG101單克隆抗體、兔抗鼠Alix單克隆抗體、兔抗人CD31多克隆抗體、兔抗人NeuN單克隆抗體、兔抗人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）多克隆抗體、兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體及Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體均購自英國Abcam公司。

1.3實驗方法

1.3.1腦血管內(nèi)皮細(xì)胞外泌體的提取與鑒定

1）提取：采用超高速離心法提取bEnd.3細(xì)胞的外泌體，收集細(xì)胞條件培養(yǎng)基，以1 000 r/min低溫4 ℃離心5 min，取上清轉(zhuǎn)移至干凈離心管。以3 000 r/min低溫4 ℃離心15 min，取上清轉(zhuǎn)移至干凈離心管。所得上清以10 000 r/min低溫4 ℃離心60 min。將獲得的上清液分裝于超高速離心管，以28 000 r/min低溫4 ℃離心80 min，棄掉上清，留沉淀，用無菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）級清洗沉淀后重懸，得到bEnd.3細(xì)胞來源的外泌體，記為b-Exo。2）鑒定：利用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察外泌體形態(tài)，將10 μL外泌體懸液滴入銅網(wǎng)，待其沉淀2 min，2%醋酸雙氧乙鈾液復(fù)染，清洗后濾紙吸水，室溫干燥，在TEM上成像，觀察外泌體形態(tài)并采集圖像，納米顆粒追蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）測定外泌體徑粒分布情況。

1.3.2蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）測定外泌體蛋白標(biāo)志物表達(dá)

取外泌體或細(xì)胞，加入RIPA裂解液放于冰上裂解，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。制備10%為十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），待其完全凝固后，固定電泳裝置，將等量蛋白樣品加入凝膠孔，進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。將膜浸入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST漂洗，加入稀釋的一抗（1∶1 000），4 ℃孵育；次日，TBST漂洗，加入對應(yīng)稀釋的二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h， TBST再次漂洗。加入ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，觀察外泌體表面標(biāo)記蛋白CD63、TSG101、Aix表達(dá)。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，Image-pro Plus軟件分析蛋白表達(dá)條帶灰度值。

1.3.3VD小鼠模型構(gòu)建與分組給藥

將40只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，包括假手術(shù)組、模型組、外泌體（b-Exo）組、陽性對照（DP）組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余3組小鼠均制備VD模型，參考文獻(xiàn)［10］方法進(jìn)行，利用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，將其四肢固定在動物手術(shù)臺上，備皮、消毒，以鑷子鈍性分離頸部組織和迷走神經(jīng)，暴露兩側(cè)頸總動脈，利用動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈20 min后再灌注10 min，重復(fù)該操作3次。假手術(shù)組小鼠僅分離頸部組織和迷走神經(jīng)，術(shù)后縫合切口，并消毒，將小鼠放入保暖箱中，單籠飼養(yǎng)，流質(zhì)飲食，注意觀察生命體征。術(shù)后第1天即用藥，b-Exo組小鼠腹腔注射100 μL的b-Exo（100 μg/mL），DP組小鼠腹腔注射鹽酸多奈哌齊（1 mg/kg），假手術(shù)組和模型組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，每日1次，持續(xù)28 d。

1.3.4Morris水迷宮行為學(xué)實驗

給藥結(jié)束后，檢測各組小鼠空間記憶能力，對小鼠進(jìn)行5 d的Morris水迷宮訓(xùn)練，然后進(jìn)行測試。1）定位航行試驗：將第1象限作為小鼠入點處，記錄小鼠在60 s內(nèi)尋找并達(dá)到平臺的時間，即逃避潛伏期，若未能到達(dá)，則將其引導(dǎo)至平臺停留30 s，記錄逃避潛伏期平均值。2）空間探索試驗：訓(xùn)練后撤去平臺，在第1 象限入點處，將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠在60 s內(nèi)通過目標(biāo)象限的次數(shù)以及其在原平臺象限停留時間。

1.3.5HE染色法

處死各組小鼠，無菌環(huán)境下解剖獲得海馬組織，將標(biāo)本清洗干凈，4%多聚甲醛常規(guī)固定，脫水至透明，浸蠟包埋，制備石蠟切片，厚度為5 μm。切片再脫蠟，并進(jìn)行水化，加入蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化，再次清洗，加入伊紅染色2 min，常規(guī)脫水與透明，室溫干燥，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織學(xué)變化。

1.3.6免疫熒光染色

取制備的各組小鼠海馬組織切片，脫蠟水化，PBS洗滌，浸于抗原修復(fù)液中，置于微波爐高溫煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)，取出室溫冷卻后，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌，在切片上滴加山羊血清封閉液，室溫震蕩10 min。分別滴加稀釋的兔抗大鼠CD31（1∶200）、NeuN（1∶200）多克隆抗體，4 ℃孵育，次日，PBS洗滌，滴加稀釋的Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶500），室溫避光孵育1 h，PBS再次洗滌，滴加DAPI工作液，室溫避光孵育15 min，洗滌切片，常規(guī)脫水與透明，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察組織染色情況并采集圖像。

1.3.7酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定

給藥結(jié)束后，對各組小鼠進(jìn)行眼球取血，室溫靜置2 h后，2 000 r/min常溫離心15 min，取上清并保存于－80 ℃冰箱備用。采用ELISA測定血清S-100β與NSE含量，嚴(yán)格按照各試劑盒說明書操作，運用酶標(biāo)儀讀數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；GraphPad Prism 8.30繪制結(jié)果統(tǒng)計圖。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1b-Exo鑒定結(jié)果

在TEM下觀察到分離的顆粒物呈圓形囊泡狀，具有經(jīng)典的“茶托”樣形狀，直徑為184 nm，并且包含外泌體標(biāo)志蛋白CD63、TSG101及Alix，且均呈高表達(dá)，以上結(jié)果證明所分離到的沉淀顆粒物為外泌體，記為b-Exo。詳見圖1。

2.2b-Exo對VD小鼠行為學(xué)的影響

Morris水迷宮測定結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠逃避潛伏期延長（P＜0.05），通過目標(biāo)象限次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時間百分比顯著減少（P＜0.05）；與模型組比較，b-Exo組和DP組小鼠逃避潛伏期則縮短（P＜0.05），通過目標(biāo)象限次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時間百分比也均增加（P＜0.05）。詳見圖2。

2.3b-Exo對VD小鼠海馬區(qū)病理組織學(xué)的影響

HE染色觀察到假手術(shù)組小鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，海馬神經(jīng)元排列整齊，未見損傷；與假手術(shù)組比較，模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少，排列紊亂，部分出現(xiàn)壞死、核固縮的現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)不清晰；相較于模型組，b-Exo組和DP組海馬CA1區(qū)病理損傷明顯減輕，海馬神經(jīng)元排列較為整齊，數(shù)量也明顯增加。詳見圖3。

2.4b-Exo對VD小鼠海馬區(qū)血管形成的影響

通過免疫熒光染色觀察各組小鼠海馬組織血管形成情況，綠色熒光為血管形成標(biāo)志物CD31表達(dá)。相較于假手術(shù)組，模型組海馬組織CD31的熒光強(qiáng)度明顯減弱，說明血管形成減少；b-Exo組和DP組海馬組織CD31的熒光強(qiáng)度則明顯要強(qiáng)于模型組，說明血管形成增加。詳見圖4。

2.5b-Exo對VD小鼠海馬區(qū)NeuN表達(dá)的影響

經(jīng)免疫熒光染色觀察各組小鼠海馬組織NeuN表達(dá)，與假手術(shù)組比較，模型組海馬組織NeuN的熒光強(qiáng)度明顯減弱，說明NeuN表達(dá)減少；與模型組比較，b-Exo組和DP組海馬組織NeuN的熒光強(qiáng)度明顯增加，說明NeuN表達(dá)增加。詳見圖5。

2.6b-Exo對VD小鼠海馬區(qū)VEGF表達(dá)的影響

Western Blot檢測結(jié)果顯示，模型組海馬組織中VEGF蛋白相對表達(dá)量低于假手術(shù)組（P＜0.05），而b-Exo組和DP組海馬組織中VEGF蛋白相對表達(dá)量均高于模型組（P＜0.05）。詳見圖6。

2.7b-Exo對VD小鼠血清S-100β與NSE水平的影響

ELISA測定結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清S-100β與NSE水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，b-Exo組和DP組小鼠血清S-100β、NSE水平顯著降低（P＜0.05）。詳見圖7。

3討論

VD是隨著年齡的增長而發(fā)展的常見疾病之一，由于其發(fā)生發(fā)展與心腦血管疾病密切相關(guān)，VD病人的平均生存時間僅為3～5年［11］。腦卒中、動脈粥樣硬化、糖尿病、肥胖和高血壓是VD的常見危險因素，這些疾病使身體處于慢性炎癥狀態(tài)下，從而使皮層下血管功能惡化，引起神經(jīng)炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致彌漫性白質(zhì)病變，最終導(dǎo)致癡呆［2］。與其他神經(jīng)退行性疾病相比，VD病人的認(rèn)知障礙更加多變，除了以癡呆為主要臨床表現(xiàn)外，還伴有意識渾濁、哭泣或爆發(fā)性大笑，部分病人還會出現(xiàn)淡漠、抑郁或偏執(zhí)等人格改變。這些癥狀不僅會降低病人的生活質(zhì)量，還會給病人家屬帶來巨大痛苦，并給社會經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。

細(xì)胞間通訊有多種類型，外泌體是其中的重要形式之一。來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外泌體存在于腦脊液和外周體液中，其含量會隨著疾病的發(fā)生而改變。由于外泌體可以穿透血腦屏障并且在外周循環(huán)中高度穩(wěn)定，因此，其不僅是生理和病理狀態(tài)下理想的生物標(biāo)志物，也是藥物遞送載體［12］。大量研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中許多類型的細(xì)胞都能夠分泌外泌體，包括少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等，這些外泌體可以啟動并參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，改善神經(jīng)損傷和神經(jīng)源性定位，對一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有潛在意義。例如，少突膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體通過改善代謝狀態(tài)和促進(jìn)營養(yǎng)剝奪神經(jīng)元的軸突運輸來維持神經(jīng)元活性［13］；神經(jīng)元來源的外泌體通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化來促進(jìn)神經(jīng)功能行為的恢復(fù)，在小鼠脊髓損傷中發(fā)揮保護(hù)作用［14］；星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體通過調(diào)節(jié)自噬抑制神經(jīng)元凋亡，從而改善實驗性缺血性腦卒中小鼠的神經(jīng)功能［15］。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障的重要組成部分，對于維持正常腦內(nèi)環(huán)境與形態(tài)結(jié)構(gòu)具有重要作用。目前，關(guān)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體的作用研究報道也逐漸增多。崔永志等［16］研究表明腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3來源的外泌體能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，這對骨再生和骨質(zhì)疏松癥的無細(xì)胞治療提供了思路；Gao等［17］研究指出腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3來源的外泌體能夠促進(jìn)大腦動脈閉塞/再灌注模型大鼠的運動功能恢復(fù)，并對于缺血性腦損傷中突觸功能的重建至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3來源的外泌體作用的VD小鼠表現(xiàn)為逃避潛伏期縮短，通過目標(biāo)象限次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時間百分比均增加，結(jié)合病理學(xué)結(jié)果觀察到海馬CA1區(qū)病理損傷明顯減輕，且神經(jīng)元數(shù)目增加。由此說明，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3來源的外泌體能夠?qū)D小鼠起到較好的治療作用。

在VD中腦缺血會導(dǎo)致局部毛細(xì)血管和神經(jīng)元受損，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷。因此，立即恢復(fù)腦缺血區(qū)的血液供應(yīng)對于神經(jīng)功能的恢復(fù)至關(guān)重要。而腦缺血區(qū)血流的恢復(fù)取決于側(cè)支循環(huán)的建立和毛細(xì)血管的形成，因此，促進(jìn)腦血管形成可能是治療VD的有效策略之一［18］。VEGF屬于一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原和趨化因子，通過與其受體（VEGFR）結(jié)合促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活、血管生成以及突觸的形成和成熟［19］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3來源的外泌體作用的VD小鼠海馬組織內(nèi)血管形成標(biāo)志蛋白CD31的熒光強(qiáng)度明顯增加，VEGF蛋白相對表達(dá)量也表現(xiàn)為上調(diào)，提示腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3來源的外泌體能夠促進(jìn)VD小鼠腦血管形成，從而改善腦損傷。

本研究結(jié)果還顯示，VD模型小鼠海馬組織內(nèi)NeuN表達(dá)減少，血清中S-100β與NSE水平均升高。NeuN存在于多種神經(jīng)細(xì)胞中，是成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物，其表達(dá)減少表示神經(jīng)元發(fā)生損傷或死亡，這一現(xiàn)象常出現(xiàn)在包括VD在內(nèi)的腦血管疾病中，促進(jìn)其表達(dá)能夠減輕或緩解疾病的發(fā)生發(fā)展［20］。S-100β與NSE為2種重要的反映腦損傷程度的細(xì)胞因子，現(xiàn)已被用作VD中神經(jīng)損傷的生物標(biāo)志物［21］。在本研究中，經(jīng)過腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3來源的外泌體作用的VD小鼠海馬組織內(nèi)NeuN表達(dá)增加，而血清中S-100β與NSE水平均降低，由此推測，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3來源的外泌體能夠通過提高海馬組織NeuN表達(dá)并抑制血清S-100β、NSE水平來減輕VD小鼠的神經(jīng)損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

4小結(jié)

綜上所述，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3來源的外泌體可以改善VD小鼠行為學(xué)，促進(jìn)腦血管生成，并減輕神經(jīng)損傷，較為全面檢測了腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3來源的外泌體對VD小鼠的改善效果。從分子生物學(xué)層面表明，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3來源的外泌體能夠促進(jìn)VD小鼠海馬組織CD31、VEGF及NeuN表達(dá)，并抑制血清S-100β與NSE水平，從而發(fā)揮治療作用。

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（收稿日期：2022-09-29）

（本文編輯王雅潔）