雅魯藏布江中游拉薩裸裂尻魚環(huán)境DNA檢測及生物量評(píng)估

李冰 馮秀 朱仁 隋曉云 賈銀濤 陳毅峰

摘要：建立快速和準(zhǔn)確的環(huán)境DNA（eDNA）檢測方法，可為魚類的長期監(jiān)測提供便利，為魚類資源保護(hù)和管理提供技術(shù)支撐。2019年在雅魯藏布江中游干流及拉魯濕地和茶巴朗濕地采集了20種魚和水樣，針對拉薩裸裂尻魚（Schizopygopsis younghusbandi younghusbandi）設(shè)計(jì)Cytb基因的特異性引物和探針，利用微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）檢測水樣中eDNA拷貝數(shù)，并分析其與生物量和豐度之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，正反向引物及探針序列與其他19種魚之間的平均錯(cuò)配堿基數(shù)分別為6.8、6.9和3.6，且對其基因組DNA進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增沒有熒光信號(hào)。通過對比ddPCR和網(wǎng)捕2種方法，70%樣點(diǎn)中檢測結(jié)果相同，剩余30%樣點(diǎn)都是網(wǎng)捕未捕獲但ddPCR檢出的情況。在拉魯濕地和雅魯藏布江干流的樣點(diǎn)中，水樣eDNA拷貝數(shù)與拉薩裸裂尻魚生物量和豐度之間均具有顯著的相關(guān)性，拉魯濕地水樣eDNA與二者的相關(guān)系數(shù)分別為0.987和0.647，雅魯藏布江水樣eDNA與二者的相關(guān)系數(shù)分別為0.786和0.756，表明eDNA技術(shù)是魚類分布和生物量監(jiān)測的有效方法。eDNA檢測易受到近緣物種和水體理化性質(zhì)的影響。

關(guān)鍵詞：環(huán)境DNA；微滴式數(shù)字PCR；拉薩裸裂尻魚；物種檢測；雅魯藏布江中游

中圖分類號(hào)：Q503? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1674-3075（2024）02-0084-08

環(huán)境DNA（eDNA）指從空氣、水、土壤、排泄物、沉積物等環(huán)境樣品中提取的DNA（Bohmann et al，2014）。環(huán)境DNA技術(shù)通過對eDNA進(jìn)行定性和定量分析，進(jìn)而獲得eDNA中的生物多樣性信息，已逐漸發(fā)展成為魚類多樣性監(jiān)測的新方法（徐念和常劍波，2016；吳昀晟等，2019；王夢等，2022）。與傳統(tǒng)方法相比，環(huán)境DNA技術(shù)具有靈敏度高、省時(shí)省力、環(huán)境友好、對調(diào)查對象無損傷、不依賴于分類學(xué)專家等優(yōu)點(diǎn)（邢迎春等，2022）。魚類的eDNA監(jiān)測主要有2個(gè)方面，即通過高通量測序和eDNA宏條形碼（eDNA metabarcoding）對多物種進(jìn)行檢測，及通過定量PCR對特定物種進(jìn)行檢測（高天翔等，2018）。高通量測序和eDNA宏條形碼雖然能同時(shí)檢測多物種，但由于擴(kuò)增引物及測序過程的偏差，對單一物種豐度的評(píng)估不理想（Balasingham et al，2018）；而定量PCR使用物種特異引物，可對單一目標(biāo)物種的存在和生物量進(jìn)行檢測（Doi et al，2015）。

常用的定量PCR包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）等，在魚類eDNA研究中均有應(yīng)用（Doi et al，2015；Mauvisseau et al，2019；Brys et al，2021；Wang et al，2021）。qPCR技術(shù)雖具有快速、簡單、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，可用于分析eDNA中目標(biāo)物種的相對豐度，但需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，且在目的序列含量低或含有大量其他序列的情況下靈敏度和精確度會(huì)受限制（王芮等，2021）；而ddPCR可在沒有參考曲線的情況下提供目標(biāo)物種DNA的絕對定量，在魚類生物量調(diào)查中更具有優(yōu)勢（Doi et al，2015）。ddPCR是一種定量分析核酸的技術(shù)，通過把反應(yīng)體系分散到10 000～20 000個(gè)微滴中，再由PCR擴(kuò)增和陽性信號(hào)讀取，計(jì)算得出樣本中DNA最初拷貝數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)對DNA的絕對定量（Hindson et al，2011）。研究表明，與qPCR相比，ddPCR的誤差更小，且更適用于低濃度下的eDNA檢測（Rusch et al，2018）。

拉薩裸裂尻魚（Schizopygopsis younghusbandi younghusbandi）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）裂腹魚亞科（Schizothoracinae）裸裂尻魚屬（Schizopygopsis）（陳毅峰和曹文宣，2000），自然分布于雅魯藏布江中上游干支流水體中，是我國特有的高原性魚類，也是西藏地區(qū)主要經(jīng)濟(jì)魚類之一，對研究生物地理學(xué)、系統(tǒng)演化和營養(yǎng)生理等方面具有極為重要的科學(xué)參考價(jià)值（He & Chen，2007；Liang et al，2017; 曾本和等，2019）。隨著近幾十年來西藏經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，水利設(shè)施建設(shè)、外來物種入侵及環(huán)境污染等導(dǎo)致拉薩裸裂尻魚資源出現(xiàn)急劇下降的趨勢（楊漢運(yùn)等，2010；朱挺兵等，2017），拉薩裸裂尻魚已被列入中國脊椎動(dòng)物紅色名錄（蔣志剛等，2016）。此外，拉薩裸裂尻魚由于生長緩慢、性成熟晚、繁殖力低等特點(diǎn)，其資源一旦遭到破壞，將很難得到恢復(fù)（邵儉等，2019）。因此，建立快速、便捷、準(zhǔn)確的eDNA檢測方法，對拉薩裸裂尻魚資源狀況進(jìn)行長期監(jiān)測，可為其資源保護(hù)和管理提供科學(xué)依據(jù)。本研究在雅魯藏布江中游干流及拉魯濕地和茶巴朗濕地采集魚類和水樣，針對拉薩裸裂尻魚，設(shè)計(jì)物種特異的Cytb引物和探針，評(píng)估其擴(kuò)增效果，利用ddPCR檢測水樣中eDNA拷貝數(shù)，并分析其與物種生物量與豐度之間的相關(guān)性。

1? ?材料與方法

1.1? ?樣品采集

2019年在雅魯藏布江中游干流（YJ1～YJ8）、拉魯濕地（LL1～LL10）和茶巴朗濕地（CBL1～CBL5）設(shè)置23個(gè)樣點(diǎn)（圖1）開展樣本采集工作。使用地籠（開口40 cm×30 cm，長8 m）經(jīng)10～12 h起捕采集2個(gè)濕地的魚類樣本；對于雅魯藏布江的樣點(diǎn)，除了使用地籠之外，還使用三層流刺網(wǎng)（網(wǎng)目2～8 cm，高1.5 m，長20 m）作業(yè)0.5 h采集魚類樣本。統(tǒng)計(jì)拉薩裸裂尻魚的個(gè)體數(shù)量和體重，剪取部分個(gè)體的一小塊鰭條組織保存在無水乙醇中。用采水器采取上、中、下層混合水樣共1 L，在4 h內(nèi)用真空抽濾泵和混合纖維濾膜（直徑47 mm，孔徑0.45 μm）對水樣進(jìn)行抽濾。每個(gè)樣點(diǎn)采集3個(gè)平行水樣，并設(shè)置1個(gè)陰性對照。濾膜立即放入2 mL無酶無菌離心管，并置于液氮中保存，直至放入實(shí)驗(yàn)室的超低溫（-80℃）冰箱。每次采集水樣和抽濾之后，利用10%的商用漂白液對采集和抽濾工具進(jìn)行消毒，并用純凈水沖洗干凈。

1.2? ?eDNA提取

每次實(shí)驗(yàn)前用DNA-off試劑（Takara公司）對實(shí)驗(yàn)用具和實(shí)驗(yàn)桌面進(jìn)行浸泡和擦拭，3 min后用清水沖洗或濕紙巾擦拭干凈。用DNeasy Blood & Tissue Kits試劑盒（Qiagen公司）提取水樣DNA，實(shí)驗(yàn)步驟按說明書進(jìn)行。水樣DNA最終用200 μL TE溶液稀釋，并于-20℃條件下保存。

1.3? ?引物和探針設(shè)計(jì)

在魚類eDNA研究經(jīng)常使用的線粒體分子標(biāo)記中，選擇進(jìn)化速度較快的Cytb基因序列（Zardoya & Meyer，1996）作為分子標(biāo)記，采用通用引物（F： GRCTTGAARAACCACCGTTGT; R： CGGWTTACAAGACCGRYGCT）（Feng et al，2023）經(jīng)DNA測序獲得漁具捕撈得到的20種魚Cytb基因序列。為了擴(kuò)大引物和探針的應(yīng)用范圍，將分布于雅魯藏布江流域上游或湖泊的尖裸鯉（Oxygymnocypris stewartii）、高原裸鯉（Gymnocypris waddelli）、蘭格湖裸鯉（Gymnocypris chui）和軟刺裸鯉（Gymnocypris dobula）（陳毅峰和曹文宣，2000；朱挺兵等，2017；劉明典等，2020）等4種魚對eDNA檢測的影響也考慮在內(nèi)，從NCBI數(shù)據(jù)庫中提取它們的Cytb基因序列。利用MEGA軟件的ClustalW功能（Thompson et al，1994；Tamura et al，2013）對上述24種魚的Cytb基因序列進(jìn)行線性排列，利用Primer5軟件根據(jù)以下原則設(shè)計(jì)檢測拉薩裸裂尻魚的引物和探針：（1）正反向引物序列與其他23種魚相比至少具有2個(gè)堿基的差異；（2）正反向引物及探針序列在種內(nèi)保守，沒有變異；（3）擴(kuò)增長度為100～200 bp；（4）其他參照常規(guī)引物和探針的設(shè)計(jì)規(guī)則（Rozen & Skaletsky，2000）。

1.4? ?引物擴(kuò)增效果評(píng)估

將拉薩裸裂尻魚的基因組DNA稀釋至1 ng/μL作為模板進(jìn)行ddPCR，設(shè)置53～59℃的退火溫度梯度，用于篩選最佳擴(kuò)增溫度。反應(yīng)體系包含2 μL DNA 模板，250 nmol/L上下游引物和150 nmol/L探針，10 μL 2× ddPCR Supermix for Probes（不含 dUTP），并用超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)至20 μL。用微滴生成卡將20 μL反應(yīng)體系與70 μL微滴生成油（Droplet Generator Oil for Probes）在微滴生成儀中生成微滴。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在密封的96孔板內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，退火1 min，40個(gè)循環(huán)；98℃保持10 min；4℃保持至拿出。擴(kuò)增結(jié)束后放入微滴讀取儀中，用QuantaSoft軟件讀取結(jié)果。

將拉薩裸裂尻魚基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，稀釋至10、1、0.1、0.01和0.001 ng/μL作為模板進(jìn)行ddPCR實(shí)驗(yàn)，檢測ddPCR的擴(kuò)增效率及可檢出的濃度范圍。將捕撈得到的20種魚以及從羊卓雍措采集的高原裸鯉基因組DNA分別稀釋到1 ng/μL作為模板進(jìn)行ddPCR，檢測ddPCR擴(kuò)增的物種特異性。

1.5? ?eDNA的ddPCR擴(kuò)增及數(shù)據(jù)處理

對每個(gè)eDNA樣品進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上。用QuantaSoft 軟件讀取檢測結(jié)果，即ddPCR反應(yīng)體系中目標(biāo)DNA拷貝數(shù)（copies/μL），根據(jù)水樣體積和eDNA的稀釋體積計(jì)算每個(gè)水樣中拉薩裸裂尻魚Cytb基因片段的拷貝數(shù)，計(jì)算公式為：

式中：x為ddPCR反應(yīng)體系中目標(biāo)DNA拷貝數(shù)（copies/μL），y為水樣中目標(biāo)DNA拷貝數(shù)（copies/mL）。利用SPSS軟件分析水樣中eDNA拷貝數(shù)與物種生物量和豐度之間的相關(guān)性。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?引物和探針

根據(jù)種間特異性高、種內(nèi)保守、擴(kuò)增子長度適合的原則，在Cytb基因的編碼區(qū)914～935 bp和1 067～1 090 bp分別設(shè)計(jì)了正反向引物（SyCytb-F/R），在編碼區(qū)942～964 bp設(shè)計(jì)了探針（SyCytb-P）。引物和探針序列為：SyCytb-F，5-CTCTGCTCCATACCTCCAAGCT-3；SyCytb-R， 5-TGAGAAACAGTGCAAAGTACAGGG-3；SyCytb-P，5-FAM-ACTAACATTCCGCCCAATCACCC-MGB-3。正向引物、反向引物和探針序列與拉薩裸裂尻魚之間沒有錯(cuò)配堿基，與尖裸鯉及3種裸鯉（高原裸鯉、蘭格湖裸鯉和軟刺裸鯉）之間的平均錯(cuò)配堿基數(shù)分別為2.2、1.3和1.0個(gè)，與其他19種魚之間的平均錯(cuò)配堿基數(shù)分別為6.8、6.9和3.6個(gè)（圖2）。

2.2? ?擴(kuò)增效果

溫度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在退火溫度的梯度范圍內(nèi)，ddPCR都檢測到有效DNA拷貝數(shù)，其中，在56℃時(shí)拷貝數(shù)達(dá)到峰值，因此，將56℃作為ddPCR的最佳退火溫度。濃度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在拉薩裸裂尻魚基因組DNA濃度為0.001～1 ng/μL時(shí)均可獲得有效DNA拷貝數(shù)，當(dāng)模板DNA濃度為10 ng/μL時(shí)，陽性微滴數(shù)遠(yuǎn)大于陰性微滴數(shù)，檢測結(jié)果顯示無信號(hào)（圖3-a）。DNA拷貝數(shù)與DNA濃度之間擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.998。物種特異性檢測結(jié)果顯示，引物和探針具有物種特異性，僅在拉薩裸裂尻魚和高原裸鯉中獲得熒光信號(hào)，在其他19種魚中均未檢出（圖3-b）。因此，當(dāng)水體中存在尖裸鯉或3種裸鯉時(shí)，都可能影響拉薩裸裂尻魚的eDNA檢測結(jié)果，說明本研究的探針和引物不適用于雅魯藏布江流域的湖泊或上游等有其他近緣種（裸鯉屬和裸裂尻魚屬）分布的水體。

2.3? ?eDNA的ddPCR檢測

在陰性對照中，均未檢測出熒光信號(hào)。共在14個(gè)樣點(diǎn)中檢測出拉薩裸裂尻魚的eDNA，其中，在茶巴朗濕地、拉魯濕地和雅魯藏布江干流中檢測出的樣點(diǎn)數(shù)分別為4、4和6個(gè)（表1）。在茶巴朗濕地、拉魯濕地和雅魯藏布江干流樣點(diǎn)中檢測出拉薩裸裂尻魚eDNA的拷貝數(shù)分別為2.4～6.3、1.9～319.3和1.6～2.3 copies/mL。

2.4? ?eDNA檢測與捕撈結(jié)果的比較

將ddPCR檢測與捕撈結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，70%樣點(diǎn)ddPCR檢測結(jié)果與捕撈結(jié)果相同，30%樣點(diǎn)中未捕獲但ddPCR檢出，沒有樣點(diǎn)捕獲到但ddPCR未檢出的情況（圖4）。其中，在拉魯濕地各樣點(diǎn)中的檢測結(jié)果均相同；在大部分茶巴朗濕地樣點(diǎn)（4/5）及部分雅魯藏布江樣點(diǎn)（3/8）中未捕獲但ddPCR檢出。

總體上，eDNA拷貝數(shù)（copies/mL）與物種生物量（g）和豐度（尾）之間均無顯著相關(guān)性（表2）。但是，單獨(dú)對拉魯濕地和雅魯藏布江的樣點(diǎn)進(jìn)行分析，eDNA拷貝數(shù)與物種生物量和豐度之間均存在顯著相關(guān)性。

在拉魯濕地樣點(diǎn)中，eDNA拷貝數(shù)與物種生物量和豐度之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.987（P<0.01）和0.647（P<0.05），擬合線性方程分別為：

式中：y1、y2和x分別為物種生物量和豐度及eDNA拷貝數(shù)。

在雅魯藏布江的樣點(diǎn)中，eDNA拷貝數(shù)與物種生物量和豐度之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.786和0.756（P<0.05），擬合線性方程分別為：

拉魯濕地樣點(diǎn)的單位質(zhì)量的eDNA拷貝數(shù)[copies/（mL·g）]和單位個(gè)體的eDNA拷貝數(shù)[copies/（mL·個(gè)）]顯著大于雅魯藏布江的樣點(diǎn)。

3? ?討論

對于單一目標(biāo)物種的eDNA檢測，需要種間特異性高、種內(nèi)通用性強(qiáng)的擴(kuò)增引物，否則極易出現(xiàn)假陽性或者假陰性的錯(cuò)誤結(jié)果（高天翔等，2018）。本研究中，拉薩裸裂尻魚的ddPCR引物序列與其他物種之間具有較多的錯(cuò)配堿基數(shù)量，且在其他物種中的擴(kuò)增沒有熒光信號(hào)，但尖裸鯉及3種裸鯉除外，它們的存在會(huì)影響拉薩裸裂尻魚的eDNA檢測。我們對拉薩裸裂尻魚與其他23種魚的線粒體基因組DNA序列進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)拉薩裸裂尻魚與尖裸鯉、高原裸鯉、蘭格湖裸鯉和軟刺裸鯉分別僅有1 240、1 241、1 239和91個(gè)差異堿基，而與其他19種魚的差異堿基數(shù)為1 551～4 640個(gè)（圖5）。基于線粒體DNA及基因組SNP標(biāo)記的分析表明，裸鯉屬（Gymnocypris）和裸裂尻魚屬（Schizopygopsis）的物種在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上不以屬名而以水域形成聚類分支（Tang et al，2019）；DNA條形碼的研究結(jié)果也表明，裸鯉屬和裸裂尻魚屬的部分物種共享操作分類單元（OTUs）（Shen et al，2019）。因此，裸鯉屬或裸裂尻魚屬內(nèi)單一物種的eDNA檢測不可避免地受到裸鯉屬和裸裂尻魚屬其他魚類的影響。但是，對于本研究的樣點(diǎn)區(qū)域，拉薩裸裂尻魚的eDNA檢測結(jié)果不受尖裸鯉或其他裸鯉的影響。首先，在所有樣點(diǎn)區(qū)域未采集到這些魚類樣本；其次，近期的調(diào)查研究表明，尖裸鯉僅在雅魯藏布江仁布以上江段出現(xiàn)（朱挺兵等，2017；劉明典等，2020），且高原裸鯉、蘭格湖裸鯉和軟刺裸鯉主要分布于湖泊水體中?？傊?，在使用本研究的ddPCR引物對自然水體的拉薩裸裂尻魚進(jìn)行分子檢測時(shí)，需要考慮尖裸鯉屬、裸鯉屬或裸裂尻魚屬其他魚類的影響。

大量研究表明，與網(wǎng)捕相比，eDNA技術(shù)在物種檢測方面具有明顯的優(yōu)勢（Czeglédi et al，2021）。在本研究中，與網(wǎng)捕相比，基于eDNA的物種檢測同樣有優(yōu)勢，2種方法在70%樣點(diǎn)中的檢測結(jié)果相同；在剩余30%樣點(diǎn)中，均是網(wǎng)捕未捕獲但eDNA檢出的情況，主要體現(xiàn)在茶巴朗濕地和雅魯藏布江的樣點(diǎn)。茶巴朗濕地位于拉薩河附近，雖然水源來源于拉薩河（連接拉薩河的水渠長4 km），但是采樣時(shí)未見水渠中有水，在茶巴朗濕地檢測的拉薩裸裂尻魚eDNA來源于拉薩河的可能性較小。茶巴朗濕地是西藏主要土著魚類（包括拉薩裸裂尻魚）的養(yǎng)殖繁育基地，而水樣采于非養(yǎng)殖用途的淺水池塘。在茶巴朗濕地樣點(diǎn)中未捕獲拉薩裸裂尻魚但水樣中檢出其eDNA，說明有2種可能：（1）樣點(diǎn)水體中確實(shí)有拉薩裸裂尻魚個(gè)體，但由于個(gè)體小等原因未能捕獲；（2）樣點(diǎn)水體中沒有拉薩裸裂尻魚個(gè)體，目標(biāo)eDNA來源于臨近養(yǎng)殖池塘的個(gè)體。拉薩裸裂尻魚在雅魯藏布江中游干流中分布廣泛（朱挺兵等，2017），通過eDNA幾乎在所有樣點(diǎn)中檢測出其存在，但通過網(wǎng)捕僅在部分樣點(diǎn)采集到其個(gè)體，說明eDNA具有更高的檢出率。

大量研究表明，在實(shí)驗(yàn)室條件下，物種的eDNA拷貝數(shù)與生物量或豐度之間具有顯著的相關(guān)性（Doi et al，2015；Mauvisseau et al，2019；閆卉果等，2022），但在自然水體中的研究較少。本研究中，總體上，水樣中eDNA拷貝數(shù)與拉薩裸裂尻魚生物量和豐度之間均無顯著相關(guān)性；但是，單獨(dú)對拉魯濕地和雅魯藏布江的樣點(diǎn)進(jìn)行分析，均存在顯著的相關(guān)性。研究表明，eDNA檢測易受水體理化性質(zhì)影響，如溫度、pH、溶解氧、礦化度、水流速度和微生物等（Jane et al，2015；Eichmiller et al，2016；Jo et al，2019）。拉魯濕地和雅魯藏布江樣點(diǎn)的水體在水流速度、溫度[（13.11±1.40）℃ vs（11.48±1.56）℃， P<0.05]、溶解氧[（6.87± 0.8）mg/L vs （7.72±0.29）mg/L， P<0.05]和pH[（9.00±0.53）vs（7.75±0.11）， P<0.01]等方面具有明顯的差異，導(dǎo)致不同水體中拉薩裸裂尻魚eDNA的脫落和降解速度及停留時(shí)間都可能存在顯著差異，因此，不能通過eDNA來比較這2個(gè)水體中拉薩裸裂尻魚的生物量和豐度。與雅魯藏布江中游干流相比，拉魯濕地的水體流速較緩且各樣點(diǎn)水體理化性質(zhì)差異較小，這可能是拉魯濕地樣點(diǎn)eDNA拷貝數(shù)與生物量之間的相關(guān)系數(shù)更大，且單位質(zhì)量eDNA拷貝數(shù)更大的主要原因。

4? ?結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)了檢測拉薩裸裂尻魚的eDNA特異性高、時(shí)效性好、擴(kuò)增效率高的引物和探針，并利用ddPCR對雅魯藏布江中游干流及拉魯濕地和茶巴朗濕地的水體進(jìn)行了拉薩裸裂尻魚的檢測。與網(wǎng)捕相比，eDNA技術(shù)在物種檢測方面具有更高的檢出率。在拉魯濕地和雅魯藏布江的樣點(diǎn)中，水樣中eDNA拷貝數(shù)與拉薩裸裂尻魚生物量和豐度之間均具有顯著的相關(guān)性。表明eDNA技術(shù)是魚類分布和生物量監(jiān)測的有效方法。但是，eDNA檢測結(jié)果易受到近緣物種和水體理化性質(zhì)的影響，是其不足之處。

志謝：感謝中國科學(xué)院水生生物研究所分析測試中心的喬志仙、柴小翠及周園園在實(shí)驗(yàn)中提供的幫助，感謝熊雄副研究員提供環(huán)境數(shù)據(jù)。

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（責(zé)任編輯? ?熊美華）

收稿日期：2022-01-12? ? ? 修回日期：2023-08-29

基金項(xiàng)目：第二次青藏高原綜合科學(xué)考察研究項(xiàng)目（2019QZKK0304，2019QZKK0501），中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)（XDA2005020403）。

作者簡介：李冰，1996年生，女，碩士研究生，主要從事魚類環(huán)境DNA研究。E-mail： 15007195038@163.com

馮秀，1989年生，男，副研究員，主要從事魚類分子生態(tài)學(xué)研究。E-mail： fengxiu@ihb.ac.cn

通信作者：陳毅峰，男，研究員。E-mail： chenyf@ihb.ac.cn