再生醫(yī)學制劑在馬骨關節(jié)炎治療中的應用進展

蔣 輝,彭 聰,湯小朋,李 靖,朱怡平

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京100193)

骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是導致馬跛行、影響其運動性能的重要疾病之一,大約60%的馬匹跛行與骨關節(jié)炎有關,其中高達66%的運動馬患有骨關節(jié)炎[1]。據(jù)報道,在美國每年平均治療一匹骨關節(jié)炎患馬需要花費3 000～5 000美元,對馬產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟損耗。

馬骨關節(jié)炎發(fā)病過程不僅會影響關節(jié)軟骨,還會累及整個關節(jié),包括軟骨下骨、關節(jié)韌帶、關節(jié)囊、滑膜和關節(jié)周圍組織[2]。其發(fā)病機制復雜且尚未闡明,越來越多證據(jù)顯示先天免疫系統(tǒng)在調(diào)節(jié)關節(jié)內(nèi)炎性反應進而導致關節(jié)軟骨損傷的過程中起到關鍵作用。骨關節(jié)炎目前被視為一種多因素疾病,常見因素包括重復性關節(jié)軟骨微損傷、發(fā)育性骨軟骨病、自發(fā)性退行性病變、關節(jié)感染等[3]。

馬骨關節(jié)炎尚無治愈方法,傳統(tǒng)治療主要通過系統(tǒng)性使用非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)和關節(jié)內(nèi)注射皮質(zhì)類固醇類藥物,傳統(tǒng)藥物治療可以緩解疼痛和炎癥等癥狀,但無法逆轉(zhuǎn)骨關節(jié)炎發(fā)病或修復受損軟骨結(jié)構(gòu)。另外有研究顯示,針對馬骨關節(jié)炎長期使用皮質(zhì)類固醇類藥物會抑制M2型巨噬細胞極化及白介素-10(interleukin-10,IL-10)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)等抗炎因子的產(chǎn)生,從而降低機體固有免疫系統(tǒng)活性、破壞關節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài),進一步損傷關節(jié)軟骨[4]。

再生醫(yī)學(regenerative medicine,RM)是一門新興的、發(fā)展迅速的學科,具有促進細胞、組織或器官再生修復、抑制炎性反應等作用,在運動損傷治療中具有巨大潛力[5]。目前常用于治療馬骨關節(jié)炎的再生醫(yī)學制劑主要包括間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)、富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)、自體條件血清(autologous serum conditions,ACS)和自體蛋白溶液(autologous protein solution,APS)[6]。

1 再生醫(yī)學作用機理和分類

再生醫(yī)學(RM)的起源可追溯到20世紀80年代的軟骨再生工程,旨在替換或再生細胞、組織或器官,以恢復或建立因疾病、損傷、老齡化及先天缺陷等因素而喪失的正常功能[5]。再生醫(yī)學根據(jù)不同方法和功能成分主要分為三大類:①組織工程與生物材料;②細胞與細胞因子療法;③類器官。再生醫(yī)學的應用通常結(jié)合了多種技術手段,在組織損傷修復上不斷突破,有望取代傳統(tǒng)的移植和替代療法[7]。

組織工程和生物材料這種方式是在體外培養(yǎng)并構(gòu)建具有組織形態(tài)及生物特點的生物支架,移植進體內(nèi)后可調(diào)節(jié)周圍組織、細胞等進行修復和再生。細胞與細胞因子療法通常是對組織中有利于抑制炎癥、組織再生的細胞或細胞因子等成分進行富集或培養(yǎng),再應用到體內(nèi)的目標部位。干細胞就是這類方法中的典型代表,具有較強的分化和再生功能,還常與生物遺傳學、納米技術等學科重新整合來提高應用效果,在再生醫(yī)學領域發(fā)展十分迅速[8]。再生醫(yī)學之所以具有較強的促進組織再生能力,主要是通過培養(yǎng)自體或異體細胞、組織或基質(zhì)架構(gòu)等建立起復雜的生物信號環(huán)境,其中的分子及細胞得以根據(jù)周圍環(huán)境釋放不同生物信號,來建立更為穩(wěn)定健康的生物環(huán)境。當在體內(nèi)應用這些再生制劑后,將通過生物信號調(diào)節(jié)周圍受損組織或細胞的生物活動,甚至動員體內(nèi)免疫系統(tǒng)的其他成員,共同達到組織修復的目的[9]。

目前軟骨組織工程方法已用于局灶性關節(jié)軟骨缺損的再生,并取得了一定的效果[10]。這種技術對于治療骨關節(jié)炎具有重要意義。在馬臨床治療中,再生醫(yī)學同樣應用廣泛,主要以細胞及細胞因子療法為主,常用再生療法包括MSC、PRP、ACS和APS,在過去10年中已用于治療包括馬骨關節(jié)炎在內(nèi)的臨床運動損傷[6]。

2 再生醫(yī)學制劑在馬骨關節(jié)炎治療中的應用

2.1 自體條件血清在治療馬骨關節(jié)炎中的應用

自體條件血清(ACS)是一種自體血液制品,它由患馬自身血液無菌孵育后,通過離心并提取血清組分獲得,是一種無細胞產(chǎn)物,富含球蛋白、白蛋白、白介素1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1RA)等,可抑制炎癥級聯(lián)反應,具有較強抗炎功能[6,11]。

此外,ACS還含有高濃度抗炎細胞因子和生長因子(growth factor,GF),例如IL-4、IL-6、血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板源生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)等。PDGF、TGF-β1、VEGF等生長因子都存在于血小板顆粒中,參與調(diào)節(jié)關節(jié)軟骨代謝和軟骨細胞表達,有助于組織損傷修復。

目前,商品化ACS制劑是白介素受體拮抗劑蛋白(interleukin receptor antagonist protein,IRAP),在一項關于馬血IRAP蛋白質(zhì)譜的檢測中,發(fā)現(xiàn)應用IRAP的樣本中檢測的細胞因子水平均高于對照組,其中IL-1RA和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平顯著升高,表明IRAP具有良好的抗炎效果[12]。在實際應用中,由于ACS中的無細胞成分,也便于儲存和運輸[6]。

在一項臨床研究中,顯示應用ACS的馬匹在治療5周后其骨關節(jié)炎關節(jié)跛行癥狀顯著改善,并且在治療后10周滑膜增生明顯減少[13]。盡管有證據(jù)顯示ACS可顯著緩解馬骨關節(jié)炎臨床癥狀并改善組織學表現(xiàn),但由于ACS細胞因子和生長因子含量存在較大的個體差異,使得ACS在一些骨關節(jié)炎治療實驗中效果并不明顯[6],所以進一步進行ACS臨床評估以了解其細胞因子譜效果十分必要。

2.2 富血小板血漿在治療馬骨關節(jié)炎中的應用

富血小板血漿(PRP)是通過離心富集血液中血小板成分后得到的生物制劑。它的生產(chǎn)成本相對較低,可以較容易地從全血中分離出來,因其富含對傷口愈合至關重要的PDGF-BB、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、TGF-β1等而被用于促進損傷修復。

PRP具有復雜的生物活性微環(huán)境,除血漿中的細胞因子、凝血素、GF外,血小板脫顆?？舍尫蓬~外的GF,與一系列關鍵的組織愈合機制有關[14]。其中PDGF-BB和TGF-β1可促進軟骨細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和滑膜細胞的分化,緩解關節(jié)炎癥和疼痛,并對關節(jié)滑膜和軟骨具有促合成代謝、抗炎作用[15]。

在一項應用PRP治療馬匹肌腱損傷的研究中,結(jié)果顯示由于PRP的纖維基質(zhì)重塑作用,短期內(nèi)使用PRP可促進修復組織、改善跛行。長期來看,使用PRP治療肌腱損傷有利于馬恢復到正常的運動水平[16]。在目前PRP治療馬骨關節(jié)炎的相關研究中,大多數(shù)研究顯示PRP有較好治療效果。研究顯示,PRP可以通過刺激軟骨細胞增殖、蛋白多糖合成和Ⅱ型膠原的胞外基質(zhì)合成,促進軟骨組織修復。PRP還具有保護軟骨作用,其能促進滑膜細胞透明質(zhì)酸的合成、分泌以及抑制軟骨細胞炎癥反應[17]。將PRP注射到馬匹骨關節(jié)炎關節(jié)后,馬的跛行程度、運動范圍和步態(tài)均有顯著改善[17]。由于目前關于PRP制備技術和PRP治療方案尚未統(tǒng)一,導致不同試驗中得到的PRP治療效果存在較大差異。因此,標準化PRP制備方案及治療方案仍值得進一步探究。

2.3 自體蛋白溶液在治療馬骨關節(jié)炎中的應用

自體蛋白溶液(APS)是一種濃縮血小板和抗炎細胞因子的制劑。它由富血小板血漿濃縮而成,通過兩步離心法濃縮血小板、生長因子和抗炎細胞因子而成。與全血相比,含有更少紅細胞的同時,APS含有明顯更多白細胞(white blood cell,WBC)、血小板。有試驗表明,APS通過白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)靶向介導的炎癥通路來治療骨關節(jié)炎,通過關節(jié)內(nèi)注射APS可以有效減輕疼痛并減緩骨關節(jié)炎的進展[18]。

骨關節(jié)炎發(fā)病過程中,炎性因子IL-1和TNF-α是介導炎性反應、組織損傷的主要角色,而APS中含有多種抗炎因子,包括IL-1RA及TNF-α的Ⅰ型、Ⅱ型可溶性受體,即腫瘤壞死因子受體Ⅰ(tumor necrosis factor receptor Ⅰ,TNF-RⅠ)、腫瘤壞死因子受體Ⅱ(tumor necrosis factor receptor Ⅱ,TNF-RⅡ)來緩解炎性反應。在一項研究中,應用APS治療自然發(fā)生骨關節(jié)炎的馬14天后,馬跛行、屈曲疼痛的癥狀顯著改善。與對照組相比,接受APS(IL-1RA/IL-1>1 000)治療的馬匹關節(jié)液蛋白質(zhì)濃度顯著降低,臨床治療效果良好[19]。在另一項研究中,APS治療骨關節(jié)炎患馬12周和52周后,其基于美國馬獸醫(yī)協(xié)會(American Association of Equine Practitioners,AAEP)的跛行評分和舒適度有顯著提升,治療后患馬無進一步骨贅和軟骨下硬化的影像學病變形成,無關節(jié)間隙狹窄情況[17]?？偟膩碚f,APS由于其豐富的抗炎成分可促進關節(jié)組織的合成代謝、緩解炎性反應,是用于治療骨關節(jié)炎的重要療法之一[20]。

與ACS相比,APS的生產(chǎn)不需要24 h的孵育期,在治療效率方面存在優(yōu)勢。與不含血小板等細胞成分的ACS相比,APS中的PDGF等抗炎因子在減少軟骨細胞炎性級聯(lián)反應方面具有較好效果[21]。另外有研究顯示,APS中的TGF-β濃度顯著高于ACS,而IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α等細胞因子與ACS濃度相似[21]。從目前的研究結(jié)果來看,單次關節(jié)內(nèi)注射APS是治療早期骨關節(jié)炎的一種有效療法。但目前對于ACS的討論大部分限于體外研究,在其臨床治療效果方面還需要更多研究[18]。

2.4 間充質(zhì)干細胞在治療馬骨關節(jié)炎中的應用

間充質(zhì)干細胞(MSC)具有一定自我更新能力,能在體外分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨母細胞等多種組織細胞。在馬骨關節(jié)炎治療中,MSC可從多種組織獲得(例如骨髓、脂肪、外周血、臍帶血、關節(jié)滑膜等),且增殖迅速并能在體外反復傳代后仍保持分化潛能,還具有低免疫排異反應、在宿主體內(nèi)長期共存等特點[22]。

MSC在抑制馬骨關節(jié)炎炎癥和緩解疼痛方面起到關鍵作用。一方面,它可通過巨噬細胞和輔助T細胞調(diào)節(jié)適應性免疫系統(tǒng)和先天免疫系統(tǒng)中的其他細胞。另一方面,MSC可通過許多趨化因子和抗炎細胞因子進行細胞間通訊,或通過生物活性物質(zhì)(如IL-6、IL-10和TGF-β)來調(diào)節(jié)炎性反應。TGF-β具有一定促軟骨細胞分化能力,在關節(jié)軟骨細胞合成細胞外基質(zhì)過程中發(fā)揮著重要作用[22]。也有研究表明,MSC通過減少調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)復制、募集和轉(zhuǎn)化來提升促炎活性,并促進細胞凋亡。且在一些MSC應用于馬軟組織損傷模型的研究中,證明了MSC具有較低免疫原性,同種異體應用MSC具有良好的安全性和有效性[23]。

MSC在馬骨關節(jié)炎治療中有改善局部軟骨微環(huán)境和新陳代謝的作用。在一項臨床前研究中,MSC治療組的馬骨關節(jié)炎關節(jié)在跛行檢查中顯示出7周后,其基于AAEP跛行評分顯著低于對照組,關節(jié)檢查結(jié)果顯示關節(jié)積液減少,滑液粘度提高,尸檢過程中發(fā)現(xiàn)關節(jié)軟骨形態(tài)改善,表現(xiàn)出良好的馬骨關節(jié)炎治療效果[24]。但目前認為,MSC用于治療早期骨關節(jié)炎效果更好,可促進纖維軟骨再生,當骨關節(jié)炎發(fā)展到一定程度后更多的是發(fā)揮抑制炎性、緩解疼痛等效果[25]。

MSC來源豐富,對于馬骨關節(jié)炎的治療最有價值和最可靠的MSC來源仍然存在爭議。骨髓和脂肪來源的干細胞是最常見的干細胞來源,但圍產(chǎn)期組織例如臍帶血、臍帶組織、羊膜或羊水來源的MSC也越來越常見。臍帶血干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cell,UCMSC)目前被認為是MSC的最佳來源,它的獲取不涉及侵入性操作,符合動物福利,且有研究表明UCMSC具有更強的增殖能力和免疫調(diào)節(jié)能力[26]。一項研究已表明異源馬UCMSC(EUC-MSCs)可通過免疫調(diào)節(jié)的作用機制,緩解骨關節(jié)炎患馬的跛行癥狀和疼痛、減緩骨關節(jié)炎的進展、促進組織再生,并具有良好的使用安全性。因此,EUC-MSCs可能是未來治療馬骨關節(jié)炎一種很好的選擇。

由于MSC軟骨形成潛能和免疫抑制特性,其有望成為治療骨關節(jié)炎的新興療法。然而,用于治療重度或全身性骨關節(jié)炎時MSC的最佳劑量或治療方案、以及自體或同種異體MSC的安全性和有效性方面還需更多研究驗證[27]。目前,內(nèi)源性滑膜間充質(zhì)干細胞的擴增以及提高同種異體骨髓間MSC治療效果是骨關節(jié)炎再生醫(yī)學中的研究重點[23]。

3 展望

再生醫(yī)學的效果盡管在多個試驗、臨床前研究、病例報告和對照研究中取得了良好的結(jié)果,但仍需更多設計嚴謹、試驗對象數(shù)量充足的研究證明其臨床應用效果。此外,再生醫(yī)學領域還面臨著幾個挑戰(zhàn),如缺乏明確的細胞或生物活性成分來源作為治療手段,再生醫(yī)學制劑的作用機制尚不明確等。再生醫(yī)學方面研究還需進一步規(guī)范不同類型再生制劑的制備及應用規(guī)范,明確發(fā)揮作用成分及機制,以便進一步發(fā)揮其抑制炎癥、組織修復等作用。例如,標化馬ACS孵育時間和條件來研究其對骨關節(jié)炎模型中細胞因子和生長因子含量和濃度的影響;規(guī)定馬PRP制備和治療骨關節(jié)炎方案來研究其治療機制和效果;進一步探究APS在馬骨關節(jié)炎不同階段細胞因子發(fā)揮的作用機制;研究MSC免疫調(diào)節(jié)相關信號通路以提高骨關節(jié)炎治療效果。綜上所述,再生醫(yī)學治療骨關節(jié)炎仍是如今馬運動醫(yī)學中的研究重點,未來還需更多深入研究繼續(xù)挖掘再生醫(yī)學的應用潛力。