微生物菌劑與植物協(xié)同修復鉛污染土壤

韓冰, 周麗鵬,, 姚文利, 徐佳婷, 董莉莉, 張明, 孫世梅*

(1.吉林建筑大學事故預防研究院, 長春 130118; 2.吉林建筑大學松遼流域水環(huán)境教育部重點實驗室, 長春 130118)

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、工業(yè)、運輸業(yè)的迅速發(fā)展,出現(xiàn)了多種重金屬在生態(tài)環(huán)境中累積的情況,導致土壤的生物多樣性遭受破壞,加劇對資源的破壞、生物的安全和健康的威脅,是當下急需處理的問題。根據(jù)世界各國調(diào)查結(jié)果,鎳(Ni)、鉛(Pb)、鈷(Co)、鎘(Cd)、錳(Mn)、鉻(Cr)、鋅(Zn)等重金屬污染問題在美國、日本等國家凸顯[1]。根據(jù)相關(guān)部門近20年調(diào)查顯示,世界重金屬污染情況越來越嚴重,遭受重金屬污染的糧食已累積300萬t以上,造成的經(jīng)濟損失也高達400億元[2]。其中,Pb在土壤中存在著移動性差、富集、難處理、毒性強等特點,導致土壤基質(zhì)受到破壞、酶活性降低、肥力下降,人類的正常生命活動也面臨更嚴重的威脅。因此,日漸加劇的Pb污染情況已成為多領(lǐng)域?qū)W者的重點關(guān)注和亟待處理的問題[3]。目前,國內(nèi)外學者主要通過物理、化學、生物等方法開展污染土壤的修復研究,由于土壤的理化特性、重金屬污染種類、污染程度的差異,導致修復效果不理想,需要進一步拓展綜合研究方法,減少重金屬的殘留,降低重金屬毒性、增加微生物的數(shù)量,促進微生物群落多樣性,提升生態(tài)恢復效率,美化生活環(huán)境,消除污染帶來的不利影響[4]。國外學者通過調(diào)控離子載體物,開展油菜修復Zn、Mn、Pb的研究,增大土壤肥料,改善了土壤的使用性能[5]。中國學者通過種植蜈蚣草、龍葵、黑麥草、魚腥草等植物有效富集Cd、Cs、Pb、Zn、Cu,改變了重金屬的多種價態(tài)比例,優(yōu)化了生物有效性,促進營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運[6]。隨著生物科技的進步,中國學者開發(fā)微生物菌劑促進植物吸附重金屬效率,減少重金屬的殘留,減輕土壤污染和潛在的危害[7]。金裕華等[8]通過活性菌與草本植物聯(lián)合修復污染土壤研究,達到了良好的效果。姜宇[9]通過培育重金屬抗性菌株,提升植物的耐受范圍和強度,促進吸附量和生物量,提高了污染土壤中微生物群落多樣性。研究結(jié)果表明,國內(nèi)外的修復研究多數(shù)根系不深、穩(wěn)固能力有限的草本植物,雖然能夠富集重金屬,但是去除能力相對不強。此外,由于各地污染物的種類、污染濃度、程度、自然條件、經(jīng)濟發(fā)展水平存在一定的差別,需要根據(jù)實際情況,創(chuàng)建重金屬高效去除技術(shù)。因此,詳析土壤重金屬的污染范圍和污染程度,培育促進重金屬吸附的微生物,探究微生物菌劑調(diào)控重金屬修復效應和機制,闡明微生物-植物協(xié)同修復機理,消減環(huán)境污染引起的危害,提升人民的幸福指數(shù),對構(gòu)建友好的社會環(huán)境具有十分重要的意義。

在本研究中,將培養(yǎng)的微生物菌劑分別與富集植物協(xié)同修復污染土壤,通過土壤、植物中葉綠素、重金屬鉛殘留量、酶活性、微生物群落多樣性的檢測,分析聯(lián)合修復對Pb去除效率影響因素,闡明聯(lián)合修復體系中生物催化活性效應機理,為研究協(xié)同修復重金屬污染提供重要的技術(shù)儲備和支撐。系中生物催化活性效應機理,為研究協(xié)同修復重金屬污染提供重要的支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑

微生物菌劑(Biological agents,B)由吉林建筑大學松遼流域水環(huán)境教育部重點實驗室構(gòu)建和培養(yǎng)。Pb標準品和分析純試劑購置于北京奧博生化公司。井欄草(PteriscreticaL.var.nervosa,P-C) 和矮棕(ChamaedoreaElegans,Ch-E)購置于吉林省長春市青怡坊花卉市場。

1.2 實驗設計

選擇吉林建筑大學校園內(nèi)土壤,清理雜質(zhì)后,過篩,隨機分布到花盆中,確保土壤理化特性一致。大小和長勢相同的井欄草和矮棕購于長春市花卉市場。將實驗室制備的菌株接種到LB培養(yǎng)基中,180 r/min、25 ℃震蕩培養(yǎng)后,4 ℃、8 000 r/min離心10 min,用磷酸鹽緩沖液清洗菌體3次,調(diào)整濃度為 1.0×108CFU/mL制備降解菌。將10 mL降解菌投加植物根系附近,間隔30 d再次投加。金屬Pb脅迫濃度為400 mg/kg,分別為接種和不接種菌株;每盆栽種10株植物,分別于種植30、60 d進行相關(guān)指標的測定。使用枝剪分別剪下植物、采集貼近植物根際土壤3 kg 左右留存;使用滅菌自封袋分別裝入植物和土樣,分別存放到-20 ℃和-80 ℃冰箱待測。

1.3 重金屬殘留量的檢測

收集土壤樣品和植物樣品依次經(jīng)去除雜質(zhì)、磨碎、過篩后,采用王水-高氯酸體系進行樣品消解后,使用原子吸收分光譜儀檢測Pb的殘留量,分析吸附效率[10]。計算公式為

吸附率=(修復后檢查濃度-修復前檢查濃度)/修復前檢查濃度× 100%

(1)

1.4 植物葉綠素測定

按照文獻[11]的方法,稱取0.3 g左右樣品,移入少量蒸餾水研磨后移取勻漿、10倍比稀釋后加入丙酮,6 000 r/min、離心10 min,移取上清液,使用熒光光度計(OD663和OD645)檢測葉綠素含量。

1.5 酶活性的檢測

按照文獻[12]的方法,將少量的磷酸緩沖液加大研缽后,分別放入井欄草、矮棕,經(jīng)過研磨、離心后,再將上清液移取到滅菌的容量瓶內(nèi),分別通過次氯酸鈉-苯酚鈉比色、高錳酸鉀滴定、氯化三苯基四氮唑等方法,進行土壤修復前后的Dehydrogenase、Urease、Fungal catalase、Sucrase活性的檢測。

1.6 重金屬抗性菌的檢測

按照文獻[13]方法,分別制備未添加重金屬的平板,加入用 1 mol/L除菌的 Pb2+終濃度調(diào)至適量的濃度。在已制備的培養(yǎng)板上,分別滴入100 μL稀釋的樣品、100 μL Pb2+溶液,37 ℃培養(yǎng)24～48 h 后,將隨機挑取單菌落劃線培養(yǎng)在含有重金屬的培養(yǎng)基中進行重金屬抗性菌的檢測[14]。檢測結(jié)果計算公式為

檢測比例=(未使用降解菌檢測數(shù)-使用降解菌檢測數(shù))/未使用降解菌檢測數(shù)

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1.7 土壤微生物數(shù)量和微生物群落的測定

按照文獻[15-16]方法,按照牛肉膏蛋白胨、馬丁氏、高氏一號等稀釋涂抹法,依次對重金屬污染土壤修復前后真菌、細菌、放線菌的數(shù)量進行檢測;土壤的微生物群落多樣性和豐度的分析由上海派生諾生物科技公司進行。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS18.0 軟件和Origin 8.0 做圖軟件進行數(shù)據(jù)整理統(tǒng)計分析修復效果的顯著意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬殘留量的檢測結(jié)果

中國學者認為土壤經(jīng)植物和微生物協(xié)同處理后,可改善土壤的酸堿度、孔隙、容重等理化特性,有利于對重金屬的富集和去除[17]。國外學者認為因開采冶煉導致Pb在土壤殘留量增加,富集植物有效地吸附重金屬,在植物地上和地下部分吸附,降低在土壤中殘留,降解菌可有效促進植物吸附重金屬的效果[18]。本研究中,實驗各組經(jīng)污染濃度400 mg/kg吸附30 d后,土壤中Pb殘留量分別為215.6、198.4、183.5、168.2 mg/kg;各組吸附60 d后土壤中Pb殘留量分別為187.9、169.3、157.1、141.7 mg/kg。在依次處理30 d和60 d后,加入微生物菌劑后分別比未加入菌劑組相比提高17.49%、17.95%和19.61%、19.48%。60 d比30 d吸附率各組分別提高14.74%、17.19%、16.82%、17.83%。同樣,微生物菌劑也可促進植物吸附重金屬,在地下吸附作用比地上吸附作用顯著增強,60 d處理效率比30 d顯著提高。檢測結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 污染土壤重金屬含量Fig.1 Heavy metal content in contaminated soil

圖2 植物中重金屬含量Fig.2 Heavy metal content in contaminated plants

2.2 葉綠素的檢測結(jié)果

文獻[19]結(jié)果顯示,殘留的重金屬污染濃度、富集植物種類及種植時間對光合作用產(chǎn)生不同的影響,在低于50 mg/kg范圍內(nèi)可促進植物產(chǎn)生葉綠素,但因重金屬累積效應,超過植物耐受時間后抑制葉綠素的產(chǎn)生。土壤中殘留過量的重金屬與植物葉片的活性基團結(jié)合后破壞葉綠體結(jié)構(gòu)和功能,阻礙葉綠素合成,抑制了葉綠素酶的活性,致使葉綠素的濃度快速下降[20]。本實驗中,在2種植物中,在修復60 d后葉綠素的含量變化差別較高,P-C、Ch-E組與對照(CK)組相比處理效率分別提高了8.12%、7.95%,井欄草對重金屬富集效果優(yōu)于P-C組。當鉛的污染濃度為400 mg/kg時可促進植物的葉綠素分泌,分別為9.16%、9.18%,微生物菌劑可有效調(diào)整重金屬的價態(tài)結(jié)構(gòu),降低對植物造成的損傷,促進葉綠素的持續(xù)合成,提升植物的生長速度、耐受能力。結(jié)果如表1所示。

表1 植物葉綠素含量的檢測結(jié)果Table 1 Results of plant chlorophyll content

2.3 多種酶活性的檢測結(jié)果

土壤中多種酶調(diào)節(jié)植物的生長及其重要的生理特性,同時土壤的基質(zhì)、重金屬殘留量也對酶的活性產(chǎn)生重大的影響。重金屬的種類、殘留濃度、殘留時間、價態(tài)結(jié)構(gòu)、土壤基質(zhì)等因素對酶活性影響作用也存在一定的差別。經(jīng)檢測結(jié)果表明,土壤經(jīng)過聯(lián)合修復后,多種酶活性均出現(xiàn)不同程度的變化。一定濃度重金屬對土壤酶的活性存在抑制作用,同時低濃度、長時間累積對酶活性有一定的相應限制作用[21]。此外,重金屬對土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)和豐度產(chǎn)生一定的影響,對參與營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運、生物化學反應的多種酶的活性產(chǎn)生抑制作用,導致植物生長受到限制,吸附能力下降。不同的植物對去除重金屬的調(diào)節(jié)作用存在一定的差異性,不同類型的酶對土壤基質(zhì)的調(diào)節(jié)機制也存在一定的差別。其次,重金屬的累積時間對各種酶的活性也造成不同程度的破壞。過氧化氫酶、磷酸酶、脲酶和蔗糖酶在60 d的活性高于30 d,而污染對照組的等活性在30 d高于60 d的活性。P-C組修復中,根系土壤在Pb濃度環(huán)境下,起主要作用的是過氧化氫酶與蔗糖酶,脲酶活性相對于出現(xiàn)增加的現(xiàn)象。Ch-E組中各種酶活性出現(xiàn)不同的結(jié)果[22]。經(jīng)檢測,污染60 d后,過氧化氫酶由對照組的5.6 mg/kg增加到11.4、15.9 mg/kg;堿性磷酸酶的活性由45.6 mg/kg增加到88.4、93.4 mg/kg;蔗糖酶的活性由4.2 mg/kg增加到9.6、9.9 mg/kg;脲酶的活性由32.6 mg/kg增加到66.3、71.2 mg/kg。結(jié)果如圖3所示。

CK為空白對照組圖3 土壤酶活性的檢測結(jié)果Fig.3 Detection results of enzyme activity in soil

2.4 重金屬抗性菌的檢測結(jié)果

微生物的生長、繁殖需要多種微量元素和金屬元素參與,金屬離子跨膜運輸與微生物表面攜帶電荷存在一定的影響,但過量的重金屬對微生物的繁殖產(chǎn)生一定抑制作用,導致微生物的生長對數(shù)期延遲、總生長量降低[23]。其中,具有較高的電負性Pb易與有機質(zhì)、氧化物、碳酸鹽形成共價化合物,極大地影響了物吸收利用能力,導致Pb處理效率不高。經(jīng)過植物和微生物菌劑聯(lián)合修復后,重金屬得到有效去除,在土壤中累積性降低,殘留量下降,對微生物的抗性降低,抗性菌數(shù)量明顯下降[24]。微生物菌劑與P-C、Ch-E協(xié)同修復后,污染30 d污染中重金屬抗性菌后分別減少18.03%、25.68%;污染60 d污染中重金屬抗性菌后分別減少25.68%、22.47%;P-C和Ch-E對污染60 d的土壤比污染30 d的土壤相比,增加29.17%、17.2%,而使用降解菌后,分別未使用降解菌增加了21.31%,20.27%,證明降解菌可有效地減少土壤中重金屬的殘留,獲得提升土壤肥力、減少污染的修復效果。結(jié)果如圖4所示。

圖4 土壤中重金屬抗性菌檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of heavy metal resistant bacteria in soil

2.5 土壤微生物數(shù)量檢測結(jié)果

經(jīng)微生物菌劑與P-C、Ch-E協(xié)同修復后,土壤中微生物的數(shù)量均比修復前出現(xiàn)了不同比例的增加現(xiàn)象。其中,各組真菌的最低數(shù)量為20.7×104CFU/g、最高數(shù)量為34.7×104CFU/g;細菌的最低數(shù)量為21.6×106CFU/g、最高數(shù)量為42.7×106CFU/g;實驗各組的放線菌的最低數(shù)量為 10.9×104CFU/g、最高數(shù)量為33.8×104CFU/g。在鉛污染30 d后,各個修復組中微生物數(shù)量均高于對照組;Pb污染60 d,由于植物的吸附能力強,土壤中殘留的Pb的濃度出現(xiàn)下降的趨勢,微生物的數(shù)量出現(xiàn)增加的趨勢。同時,微生物菌劑對植物的重金屬富集能力也有促進作用,在使用微生物菌劑30 d后,細菌、真菌、放線菌的數(shù)量分別比污染土壤增加46.46%和49.11%、25.23%和32.57%、41.04%和47.76%;使用微生物菌劑60 d后微生物數(shù)量分別增加了89.35% 和 97.68%、63.77%和67.63%、208.26%和210.09%。Pan等[25]開展了植物與生物炭協(xié)同修復Cu、Ni、Pb等重金屬污染的土壤進行研究,增加了污染土壤微生物的結(jié)構(gòu)和數(shù)量,促進了植物修復重金屬的能力,緩解了重金屬造成的危害,土壤污染得到了有效地治理。結(jié)果如圖5所示。

圖5 微生物數(shù)量檢測結(jié)果Fig.5 Composition of microbial quantity in soil

2.6 土壤微生物群落多樣性檢測結(jié)果

植物體內(nèi)重金屬及營養(yǎng)元素含量接種植物地下和地上積累重金屬總量存在一定的差別[26]。由圖6 可知,在收集的修復前后土壤樣品中,變形菌門(Proteobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)是數(shù)量最多的優(yōu)勢菌群。其中,P-C、Ch-E單獨和微生物菌劑聯(lián)合修復的各組中Proteobacteria的相對豐度分別為28.2%、26.9%、27.3%、25.9%;Acidobacteria的相對豐度分別為23.4%、23.5%、23.1%、23.7%;平均相對豐度分別為27.08%、23.4%。其中微生物菌劑與植物聯(lián)合吸附后,放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和藍藻菌門(Cyanobacteria)所占比例均出現(xiàn)了相對減少,而其他微生物群落所占比例均出現(xiàn)了相對增加,修復30 d所占比例分別由1.5%增加到2.1%、1.8%,修復60 d所占比例分別由1.8%增加到2.7%、2.9%,Stefanowicz等[27]認為重金屬殘留的濃度、時間、土壤基質(zhì)、理化特性、溫度等因素對微生物群落多樣性也產(chǎn)生一定的影響,木本植物種植可完善微循環(huán)結(jié)構(gòu),提升污染土壤的抗氧化能力,降低了重金屬的生物毒性,強化重金屬的修復效果。結(jié)果如圖6所示。

圖6 土壤微生物群落多樣性組成的檢測結(jié)果Fig.6 Composition microbial community diversity of class level bacterial flora in soil

3 結(jié)論

通過以上實驗研究,得到以下結(jié)論。

(1) 選擇植物與微生物菌劑協(xié)同修復后,土壤中重金屬殘留量顯著減少,重金屬抗性菌的數(shù)量也降低,使用的微生物菌劑對兩種植物消除重金屬毒性具有良好的促進作用。

(2) 投加微生物菌劑到后,影響重金屬賦存形態(tài),改變了遷移性能,提高了酶催化作用,增加富集植物葉綠素的含量,提升耐受能力,消減了重金屬抗性菌的殘留和毒害作用。

(3) 污染土壤經(jīng)微生物菌劑和富集植物協(xié)同修復后,微生物群落的多樣性和豐度均顯著增加;隨著協(xié)同修復時間推移,更為顯著地提高了重金屬污染的綜合治理水平。