斑石鯛irf3 基因鑒定及其在虹彩病毒感染下的表達模式

李開敏， 王 磊， 鞏志宏， 王清濱， 李 華，楊桂文， 黃友華， 陳松林,3

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，海水養(yǎng)殖生物育種與可持續(xù)產(chǎn)出全國重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)與可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，山東 青島 266071；2. 山東師范大學，山東 濟南 250014；3. 嶗山實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266237；4. 萊州明波水產(chǎn)有限公司，山東 萊州 261418；5. 華南農(nóng)業(yè)大學海洋學院，海洋生物資源保護與利用粵港澳高校聯(lián)合實驗室，廣東省水產(chǎn)免疫與健康養(yǎng)殖工程技術研究中心，廣東 廣州 510642)

干擾素調(diào)節(jié)因子(IRFs)是一類細胞內(nèi)轉錄因子，參與調(diào)節(jié)多種生物學過程，最開始被認為是調(diào)節(jié)干擾素(interferon，IFN)表達的轉錄因子[1]；后來研究發(fā)現(xiàn)IRFs 還參與Toll 樣受體和其他模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)引發(fā)的基因表達調(diào)控，從而證實了它們在宿主抵抗病原體中的核心作用[2-4]。此外IRFs 在造血細胞發(fā)育分化方面也發(fā)揮重要作用[5]。目前在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了11 個IRF 家族成員，哺乳動物中發(fā)現(xiàn)9 個成員(irf1～irf9)[6-7]，鳥類中鑒定出irf1～irf10[8]，在硬骨魚斑馬魚(Danio rerio)中首次鑒定出irf11，說明魚類具有完整的干擾素調(diào)節(jié)機制[9-12]。與哺乳動物相似，魚類先天免疫系統(tǒng)中也有防御系統(tǒng)和調(diào)節(jié)機制[13]，魚類利用IFN 誘導系統(tǒng)對抗病毒感染[14-15]。研究表明，病毒感染誘導的魚類IFNs 可增強抗病毒活性，并加速IFN 刺激基因(interferonstimulated gene，ISG)的表達以抑制病毒復制[16]。在魚類中IRFs 家族在DNA 和RNA 病毒感染過程中發(fā)揮重要作用[17-22]。干擾素調(diào)節(jié)因子3 (interferon regulatory factors 3，irf3)是IRF 家族成員，在誘導病毒感染細胞中I 型IFN (IFN-α 和IFN-β)的表達上發(fā)揮重要作用，在結構上與irf7 同源[7-8]，irf3在大多數(shù)組織和細胞中均呈組成型表達[23-24]，主要存在于細胞質中[25]。病毒感染后，PRRs 啟動信號轉導并激活絲氨酸/蘇氨酸激酶(TANK-binding kinase 1，TBK1)，使irf3 的C 端富含絲氨酸區(qū)域特定幾個絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化，誘導IRF3和NF-κB 蛋白復合體從細胞質到細胞核的易位。易位到細胞核后，IRF3 和NF-κB 啟動轉錄，導致經(jīng)典的JAK-STAT 通路和干擾素刺激基因因子3(ISGF3)的激活[26-27]。研究報道，小鼠(Mus musculus)缺乏irf3 導致體內(nèi)產(chǎn)生的IFN 急劇減少，因而更容易受到病毒感染[28]。目前，在大黃魚(Larimichthys crocea)[18]、鯉(Cyprinus carpio)[19]、半 滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)[29]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[30]、尖吻鱸(Lates calcarifer)[31]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[12]、鱖(Siniperca chuatsi)[32]等魚類中開展了irf3 基因的克隆鑒定和初步表達分析。

斑石鯛(Oplegnathus punctatus)又名斑鯛、黑金鼓，屬于鱸形目(Perciformes)石鯛科(Oplegnathidae)石鯛屬(Oplegnathus)，主要分布在西太平洋溫帶水域，具有顯著的經(jīng)濟和生態(tài)價值[33]。斑石鯛在我國東南沿海均有分布，是我國名貴的海水養(yǎng)殖品種之一。隨著國內(nèi)斑石鯛養(yǎng)殖業(yè)集約化水平不斷提高，從苗種到養(yǎng)成階段各種病害頻發(fā)，嚴重制約了斑石鯛的健康養(yǎng)殖，其中虹彩病毒病成為制約斑石鯛健康養(yǎng)殖的主要問題[34]。目前關于irf3 基因在斑石鯛抗虹彩病毒感染中的功能研究尚未見報道。

本研究以斑石鯛為對象，初步分析其irf3 基因的序列特征和進化地位，通過實時熒光定量PCR 檢測了Opirf3 在斑石鯛各健康組織以及虹彩病毒感染后免疫組織中的表達水平；構建斑石鯛腎細胞系poly I: C 體外刺激模型，在細胞水平上檢測Opirf3 的抗病毒免疫應答模式；在斑石鯛腎細胞上對Opirf3 進行siRNA 干擾后，檢測Opirf3下游免疫相關基因的表達水平，以期實現(xiàn)對Opirf3 在斑石鯛抗虹彩病毒感染過程中免疫作用初探，旨在為斑石鯛抗病分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

正常組織樣品 本實驗所用的斑石鯛購自山東萊州明波水產(chǎn)有限公司，健康無病，體重為(150±15) g，實驗前在水箱暫養(yǎng)1 周。隨機選取4尾斑石鯛，麻醉后解剖取肝臟、脾臟、腎臟、頭腎、腸道、鰓、皮膚、心臟、胃和腦組織，將組織立即放入盛有RNA 保存液的凍存管中，隨后轉移至-80 °C 冰箱保存。

虹彩病毒感染樣品 上述健康斑石鯛每尾腹腔注射100 μL (109個拷貝數(shù))虹彩病毒進行感染實驗，對照組腹腔注射100 μL 磷酸緩沖溶液(PBS)，在感染后0、1、4、7 和10 d 這5 個時間點取樣，每個時間點感染組和對照組各隨機選取5 尾斑石鯛，麻醉后解剖取其肝臟、脾臟和腎臟組織，立即放入盛有RNA 保存液的凍存管，存于-80 °C 冰箱保存。本感染實驗所用的虹彩病毒由華南農(nóng)業(yè)大學惠贈[35]。

斑石鯛細胞系 用于免疫刺激實驗和siRNA 干擾的斑石鯛腎細胞系均來源于中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室。

本研究獲得了中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所實驗動物管理和使用倫理委員會批準，實驗過程中操作人員嚴格遵守中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所倫理規(guī)范，并按照中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.2 斑石鯛RNA 提取和cDNA 合成

樣品使用TRIzol 法提取RNA，實驗方法嚴格參照說明書，用1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察各樣品RNA 條帶的完整度，并用DNA/Proteins Analyzer P100 測定RNA 的濃度及純度，選擇條帶完整、質量良好的RNA，進行cDNA 合成。使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉錄試劑盒(TaKaRa，日本)進行cDNA 合成。反轉錄產(chǎn)物經(jīng)PCR 反應驗證質量，PCR 反應體系：cDNA 1 μL，TaKaRa ExTaq10 μL，正反引物各1 μL，ddH2O 7 μL；反應條件34 個循環(huán)：94 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C 30 s，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，選擇質量好的cDNA 用于后續(xù)熒光定量實驗。

1.3 Opirf3 序列分析

Opirf3 序列來源于本實驗室的斑石鯛基因組數(shù)據(jù)庫[36]。使用DNAman 軟件預測Opirf3 基因的氨基酸序列；使用SWISS-PROT (https: //www.expasy.org/)預測Opirf3 基因分子質量和理論等電點；使用SMART 在線網(wǎng)站(https: //smart.embl.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)預測同源保守功能結構域。在NCBI 下載不同脊椎動物的Irf3 氨基酸序列，并用BLAST 進行同源比對；使用DNAman進行物種間Irf3 氨基酸序列多重比對；使用MAGE7軟件的ClustalW 進行序列比對，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，設置Bootstrap method 重復1 000 次，來計算各分支的置信度。

1.4 Opirf3 的組織表達分析

使用Primer premier 5.0 軟件，根據(jù)Opirf3 的CDS 區(qū)設計熒光定量引物(表1)，以斑石鯛β-actin為內(nèi)參基因，反轉錄得到的健康斑石鯛肝臟、脾臟、腎臟、頭腎、腸道、鰓、皮膚、心臟、胃和腦組織的cDNA 為模板，使用AG 熒光定量試劑盒、 ABI 7500 Fast Real-time PCR 儀 (Applied Biosystems，美國)測定Opirf3 基因的表達水平。PCR 反應體系：10 μL SYBR mix、0.4 μL ROX、0.8 μL F (10 μmol/L)、0.8 μL R (10 μmol/L )、7 μL ddH2O、1 μL cDNA 模版。反應程序：95 °C 30 s，40 個循環(huán)：95 °C 5 s，60 °C 34 s。利用 2-ΔΔcT方法計算Opirf3 基因在各組織中的相對表達量。

表1 本研究所用的引物及其序列Tab. 1 Primers used in this study

1.5 虹彩病毒感染后Opirf3 在免疫組織中的表達分析

以斑石鯛β-actin為內(nèi)參基因，反轉錄得到的虹彩病毒感染的肝臟、脾臟和腎臟組織的cDNA為模板，使用上述相同的熒光定量方法檢測Opirf3在虹彩病毒感染的免疫組織中的相對表達水平。

1.6 斑石鯛腎細胞體外刺激實驗

將單層培養(yǎng)、生長狀態(tài)良好的斑石鯛腎細胞系接種到12 孔板上，24 h 后細胞覆蓋率達到90%左右。將12 孔板的培養(yǎng)基吸棄去，1×PBS 洗滌3 次后換上新鮮的L15 培養(yǎng)基。不同濃度poly I: C 刺激斑石鯛腎細胞實驗：向12 孔板的每個孔中分別加入終濃度為0、50、100 和200 μg/mL 的poly I: C，對照組加入等體積的PBS，將上述細胞樣品放在24 °C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h 后，分別收集細胞樣品，TRIzol 法提取RNA，制備定量模板。熒光定量PCR 檢測poly I: C 刺激后斑石鯛腎細胞系中Opirf3 的相對表達水平。

1.7 siRNA 干擾實驗

委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成Opirf3 的siRNA，根據(jù)Opirf3 的ORF 區(qū)序列篩選到3 個siRNA 位點，分別為siRNA1、siRNA2 和siRNA3，siRNA 序列和Opirf3 免疫相關基因引物序列見表1。將適量生長狀態(tài)良好的斑石鯛腎細胞系接種到2 個12 孔板中，在24 °C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁且覆蓋率達到30%～50%即可進行siRNA 轉染實驗。使用riboFECTTMCP 轉染試劑盒進行Opirf3 的siRNA 轉染，siRNA 轉染終濃度為50 nmol/L，每孔轉染體系：1×CP buffer 60 μL，CP Regent 6 μL，siRNA (siRNA1-3; NC; cy3)2.5 μL。3 個Opirf3-siRNA 位點重復6 個孔，NC重復4 個孔，用于檢測熒光轉染效率的cy3 有2個孔。轉染后24 h 熒光顯微鏡下觀察，判斷轉染效率；72 h 使用TRIzol 收集細胞，使用TRIzol 法提取RNA，制備定量模板，熒光定量PCR 檢測3個位點的敲降效率。以敲降效率最高的位點轉染的斑石鯛腎細胞的cDNA 為模板，熒光定量PCR檢測irf3 免疫相關基因IFN-α、CD40、CD80、IL-6 和IL-1β的表達水平。

1.8 熒光定量PCR 引物擴增效率檢測

熒光定量PCR 產(chǎn)物送青島睿博興科生物技術有限公司進行測序，測序成功后，將公司返還的PCR 純化產(chǎn)物與pEASY?T1 載體[天根生化科技(北京)有限公司] 進行連接轉化，嚴格按照說明書進行操作。挑取白色單克隆接種于含有氨芐(AMP＋)的LB 液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 °C 培養(yǎng)15 h。用無內(nèi)毒素質粒小提中量試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司] 提取質粒，測定質粒濃度為100 ng/μL。參考北京擎科生物科技股份有限公司《絕對定量標準曲線制作方法》，將上述提取的質粒梯度稀釋10～10 000 倍，作為熒光定量PCR 模板，上機進行熒光定量檢測，得到對應的CT 值和拷貝數(shù)，從而制作標準曲線，標準曲線的斜率即為引物的擴增效率。

1.9 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進行方差分析，組織表達數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著。其余實驗數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗進行方差分析，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

2 結果

2.1 Opirf3 序列分析

Opirf3 cDNA 開放閱讀框為1 362 bp，編碼453 個氨基酸，預測蛋白分子質量為50.0 ku，理論等電點為4.97。SMART 軟件預測顯示Opirf3有1 個IRF 結構域和1 個IRF-3 結構域，分別位于第1～108 和250～430 位氨基酸(圖1)。

圖1 斑石鯛與其他物種Irf3 氨基酸序列多重比對黑色區(qū)域. 氨基酸位點相似性為100%；粉色區(qū)域. 氨基酸位點相似性≥75%；藍色區(qū)域. 氨基酸位點相似性≥50%。Fig. 1 Multiple alignment of the deduced amino acids of Irf3 between O. punctatus and other species Black region. amino acid site similarity is 100%; pink region. amino acid site similarity≥75%; blue area. amino acid site similarity≥50%.

2.2 Opirf3 多序列比對與系統(tǒng)進化分析

經(jīng)BLAST 比對發(fā)現(xiàn)，Opirf3 編碼的氨基酸序列與其他硬骨魚類irf3 編碼的氨基酸序列具有較高的相似性，與條石鯛(O.fasciatus)、花鱸(Lateolabrax japonicus)、鱖和條紋狼鱸(Morone saxatilis)的相似性分別為91.90%、84.47%、84.26%和84.01%；與兩棲動物非洲爪蟾(Xenopus laevis)的相似性最低，為31.08%；與人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和黑猩猩(Pan troglodytes)等的相似性較低，分別為31.41%、31.47%和31.41%(表2)。

表2 斑石鯛與其他脊椎動物Irf3 的氨基酸序列相似性Tab. 2 Degree of homology between Irf3 of O. punctatus and other vertebrates

使用DNAman 對表1 所述氨基酸序列進行多重比對，發(fā)現(xiàn)不同物種間Irf3 氨基酸序列非常保守(圖1)。為探究確定斑石鯛Irf3 在動物進化過程中的地位，利用MAGE 7 軟件，通過Neighborjoining 法構建了脊椎動物的系統(tǒng)進化樹。系統(tǒng)分析結果顯示，哺乳動物小鼠、人和黑猩猩的Irf3聚為一支，兩棲類非洲爪蟾單獨為一支，斑石鯛Irf3 與其他硬骨魚類聚為另一支。說明在進化上斑石鯛Irf3 與哺乳動物的親緣關系較遠，而與硬骨魚條石鯛的親緣關系最近，與牙鲆、半滑舌鰨等的親緣關系較近(圖2)。

圖2 IRF3 氨基酸序列系統(tǒng)進化樹分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of IRF3 amino acid sequence

2.3 Opirf3 組織表達分析

為了研究Opirf3 在斑石鯛各組織中的表達模式，通過熒光定量PCR 檢測健康斑石鯛肝臟、鰓、心臟、皮膚、脾臟、腸道、腦、腎臟、胃和頭腎組織中Opirf3 相對表達水平。結果顯示，Opirf3在斑石鯛各組織中均有表達，但表達水平有差異(圖3)，在肝臟中的表達水平顯著高于其他組織。

圖3 斑石鯛組織中Opirf3 的相對表達水平1. 肝臟，2. 鰓，3. 心臟，4. 皮膚，5. 脾臟，6. 腸道，7. 腦，8. 腎臟，9. 胃，10. 頭腎，n=4；數(shù)值用平均值±標準差表示，不同字母表示各表達水平之間差異顯著(P＜0.05)，下同。Fig. 3 Relative expression of Opirf3 in O. punctatus tissues 1. liver, 2. gill, 3. heart, 4. skin, 5. spleen, 6. intestine, 7. brain, 8. kidney,9. stomach, 10. head kidney, n=4; values are expressed bymean±SE, and different letters inditace significant differences in expression levels(P＜0.05); the same below.

2.4 虹彩病毒感染后Opirf3 在免疫組織中的表達分析

斑石鯛腹腔注射SKIV-SD 后，于不同時間點取肝臟、脾臟和腎臟3 種免疫組織，通過熒光定量PCR 檢測Opirf3 的表達水平變化。結果顯示，肝臟、脾臟和腎臟組織中Opirf3的表達水平在注射時間為7 和10 d 時均顯著升高，但不同組織中Opirf3 的相對表達水平略有差異(圖4)。注射時間為7 和10 d 時，肝臟中Opirf3 相對表達水平分別為0 d 的4.6 倍、5.7 倍；脾臟中Opirf3 相對表達水平分別為0 d 的7.3 倍和7.0 倍；腎臟中Opirf3 的相對表達水平分別為對照組的8.9 倍和14.2 倍。

圖4 虹彩病毒感染后不同時間點肝臟(a)、脾臟(b)和腎臟(c)中Opirf3 的表達水平PBS 組4 個平行(n=4)，SKIV-SD 組5 個平行(n=5)；數(shù)值用平均值±標準誤表示，*. P＜0.05，**. P＜0.01，***. P＜0.001，下同。Fig. 4 Relative expression of Opirf3 in the liver (a),spleen (b) and kidney (c) at difference time points after SKIV-SD infection There were 4 parallels (n=4) in PBS group and 5 parallels (n=5) in SKIVSD group. Values are represented by mean±SE, *. P＜0.05, **. P＜0.01,***. P＜0.001; the same below.

2.5 斑石鯛腎細胞體外刺激實驗

為了進一步探討Opirf3 在斑石鯛抗病毒感染中發(fā)揮的作用，本實驗設計了斑石鯛腎細胞系的體外刺激實驗。分別用不同濃度的poly I: C 刺激斑石鯛腎細胞系，6 h 后收集細胞，提取細胞RNA 制備定量模板，熒光定量PCR 檢測poly I: C刺激后腎細胞中Opirf3 的表達水平，PBS 作為對照組。結果顯示，不同濃度poly I: C 刺激后，腎細胞中Opirf3 的表達水平均顯著升高(圖5)，在刺激濃度為50、100 和200 μg/mL 時，Opirf3 的表達水平分別是刺激濃度為0 μg/mL 時的80.8、86.8 和60.6 倍。

圖5 不同濃度poly I: C 刺激6 h 后斑石鯛腎細胞中Opirf3 的表達水平每組3 個平行，n=3。Fig. 5 Expression level of Opirf3 in kidney cells at 6 h after stimulation by different concentrations of poly I: C There were 3 parallel per group, n=3.

2.6 siRNA 干擾

由轉染效率圖可知，Opirf3 的siRNA 在腎細胞中的轉染效率較高，為90%以上，實驗結果可靠(圖版)。熒光定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，3 個位點均有敲降，其中siRNA-3 對Opirf3 的干擾效果最為明顯，較對照組siRNA-NC 顯著下降(下調(diào)了30%，圖6)。因此，實驗檢測siRNA-3 干擾后Opirf3 免疫相關基因的表達，以期探究Opirf3 對下游免疫相關基因表達的影響。在siRNA 干擾Opirf3 后，分 別 檢 測 了 干 擾 素α (interferon alpha，IFN-α)、CD40 抗原(CD40 antigen，CD40)、CD80 抗原(CD80 antigen，CD80)、白細胞介素6 (interleukin 6，IL-6)和白細胞介素1β (interleukin 1 beta，IL-1β)的表達水平，結果顯示，IFN-α、CD40、CD80 和IL-1β的表達水平較對照組siRNA-NC 顯著下降，IL-6表達水平較對照組顯著上調(diào)(圖7)。

圖6 不同靶點siRNA 對Opirf3 的干擾效果1. siRNA-NC，2. siRNA-1，3. siRNA-2，4. siRNA-3，siRNA-NC組4 個 平 行(n=4)，siRNA-1、siRNA-2 和siRNA-3 組6 個 平 行(n=6)。Fig. 6 Changes in the expression of three sites after knocking down Opirf3 1. siRNA-NC, 2. siRNA-1, 3. siRNA-2, 4. siRNA-3, there were 4 parallel (n=4) in the siRNA-NC group and 6 parallel (n=6) in the siRNA-1,siRNA-2 and siRNA-3 groups.

圖7 Opirf3 siRNA 干擾后免疫相關基因在斑石鯛腎細胞中的表達水平1. IFN-α，2. CD40，3. CD80，4. IL-6，5. IL-1β，siRNA-NC 作為陰性對照，siRNA-NC 組4 個平行(n=4)，siRNA-3 組6 個平行(n=6)。Fig. 7 The relative expression levels of immune-related genes in O. punctatus kidney cells after Opirf3 siRNA treatment 1. IFN-α, 2. CD40, 3. CD80, 4. IL-6, 5. IL-1β, siRNA-NC as a negative control, there were 4 parallel (n=4) in the siRNA-NC group and and 6 parallel (n=6) in the siRNA-3 group.

3 討論

IRF 家族的功能由特定的蛋白質結構域決定[32]。本研究預測了斑石鯛Irf3 的蛋白結構，發(fā)現(xiàn)N 端有一個IRF 結構域，作為DNA 結合域(DBD)，這一結構域在硬骨魚和哺乳動物中略有差別，在哺乳動物中，Irf3 的DBD 有5 個色氨酸重復序列，而硬骨魚中僅有4 個間隔的色氨酸重復序列[3,9]。該重復序列是Irf3 與啟動子元件結合必不可少的，它們可以形成螺旋-轉角-螺旋結構而與下游靶基因啟動子中的IRF 調(diào)節(jié)元件(IRFE)和IFN 刺激反應元件(ISRE)共有序列結合[37]。在C 端是IRF3結構域，能夠激活雙鏈RNA 激活因子1 并防御病毒入侵[38]。這些結構特征表明Opirf3 在斑石鯛Ⅰ型干擾素激活和抗病毒免疫方面發(fā)揮重要作用。

斑石鯛組織特異性表達分析顯示，Opirf3 在斑石鯛肝臟、鰓、心臟、皮膚、脾臟、腸道、腦、腎臟、胃和頭腎組織中均有表達，在肝臟中的表達水平最高。這種普遍存在的表達模式，與其他已報道的魚類相似，半滑舌鰨、虹鱒、尖吻鱸和花鱸中irf3 在各組織中均有表達，但不同組織中的表達水平略有差異，尖吻鱸中irf3 在脾臟和腎臟中表達水平最高，花鱸中irf3 在肝臟中的表達水平最高[12,23,29,31]。

poly I: C 類似于雙鏈RNA，是一些病毒的關鍵病原體成分[39]，研究表明病毒和poly I: C 處理誘導硬骨魚中irf3 轉錄?；|中，赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒(RGNNV)和poly I: C 刺激后，細胞和組織中irf3 的表達水平均顯著上調(diào)；鱖中poly I: C刺激后，顯著上調(diào)了免疫相關組織中irf3 的表達水平；半滑舌鰨感染細胞腫大虹彩病毒(Megalocytivirus)后，irf3 在免疫組織中的表達水平顯著上升；尖吻鱸感染神經(jīng)壞死病毒RGNNV 后，腦和肝臟、脾臟和腎臟中irf3 的表達水平顯著上升[23,29,31-32]。本研究中SKIV-SD 感染斑石鯛7 d 后，Opirf3 在肝臟、脾臟和腎臟中的表達水平顯著上調(diào)。以上結果提示，irf3 在硬骨魚抗病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。

圖版 斑石鯛腎細胞siRNA 轉染效率圖1. 明場觀察； 2. 紅色熒光觀察。Plate Map of siRNA transfection efficiency in kidney cells of O. punctatus 1. brightfield observation; 2. red fluorescence observation.

IRF3 是硬骨魚中一種重要的轉錄因子，調(diào)節(jié)I 型干擾素的表達以抵御病毒感染[9,12]。在花鱸腦細胞中過表達的irf3 顯著抑制了RGNNV 復制。鱖中，irf3 的過表達刺激干擾素-β 啟動子和含有ISRE 的啟動子的活性。牙鲆中，poly I: C 刺激下過表達的irf3 極大提高了Ⅰ型IFN 的轉錄活性[23,32,40]。這些研究結果表明，硬骨魚irf3 參與了病毒感染的先天免疫應答，并且誘導產(chǎn)生Ⅰ型干擾素以應對病毒感染[23]。在斑石鯛腎細胞中對Opirf3 進行siRNA 干擾后檢測免疫相關基因，發(fā)現(xiàn)IFN-α顯著下調(diào)，證明Opirf3 直接調(diào)控Ⅰ型干擾素信號通路。檢測其他免疫相關基因發(fā)現(xiàn)，CD40、CD80、IL-6 和IL-1β被不同程度的激活或抑制。其中CD40 是表達于多種細胞表面的跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族，在生發(fā)中心應答、T 依賴抗原應答和觸發(fā)促炎癥反應等發(fā)面發(fā)揮重要作用[41-44]。CD80 是免疫球蛋白超家族成員，調(diào)控T 細胞適度活化所必須的膜糖蛋白，若表達失調(diào)將導致一系列免疫疾病的發(fā)生[45]。IL-6和IL-1β在免疫和癌癥等方面發(fā)揮著重要的作用[46]。此外研究證明，irf7 也是Ⅰ型IFN 表達的關鍵調(diào)控因子，在硬骨魚的抗病毒反應中發(fā)揮重要作用[327]，主要在免疫組織中表達[24]。半滑舌鰨感染細胞腫大虹彩病毒(Megalocytivirus)后，irf7 在免疫組織肝臟、脾臟和腎臟中的表達水平顯著上調(diào)[29]；神經(jīng)壞死病毒(RGNNV)感染尖吻鱸后，腦和肝臟、脾臟等免疫組織中irf7 的表達量均顯著上調(diào)[31]。本團隊在前期研究中克隆了irf7 序列，并發(fā)現(xiàn)irf7 在斑石鯛感染虹彩病毒后表達量升高[47]。斑石鯛irf3 和irf7 的結構存在相似性，活化的irf3 形成同二聚體或與irf7 形成異二聚體，與 NF-κB、轉錄共刺激分子 CBP /p300 等形成全復合體，進入細胞核啟動Ⅰ型 IFN 的 轉錄[3,47]。本研究對Opirf3 基因進行了鑒定和表征；分析了斑石鯛感染虹彩病毒后免疫組織的表達模式，同時還進行了體外細胞刺激實驗和siRNA 實驗。以上實驗結果初步表明，虹彩病毒感染后，斑石鯛免疫組織和細胞中Opirf3 基因的表達上調(diào)，進而激活Ⅰ型IFN 通路來抵抗病毒對宿主細胞的侵襲。但關于斑石鯛Opirf3 介導的Ⅰ型IFN 通路的激活機制仍需要后續(xù)研究。本實驗為斑石鯛抗虹彩病毒病的研究奠定一定的理論基礎，也為斑石鯛的分子抗病育種提供一定的理論參考依據(jù)。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）