基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討胃復(fù)春治療慢性淺表性胃炎作用機制

俞雯雯，康年松，岑迎東，王丹，傅厚道

1. 余姚市中醫(yī)醫(yī)院，浙江 余姚 315400

2. 浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 杭州 310018

3. 寧波市第二醫(yī)院，浙江 寧波 315010

慢性淺表性胃炎（CSG）是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，可發(fā)展為慢性萎縮性胃炎（CAG），甚至存在癌變風(fēng)險[1-2]。臨床常通過胃黏膜保護制劑、質(zhì)子泵抑制劑等藥物治療CSG，但此類藥物長期使用會增加胃腸道營養(yǎng)物質(zhì)吸收、胃腸道黏膜增殖、骨代謝異常和感染等多種風(fēng)險[3]。胃復(fù)春（WFC）具有健脾益氣、活血解毒的功效，對治療CAG、胃十二指腸潰瘍、CSG等消化道疾病療效確切，且安全性良好[4-6]，但關(guān)于WFC 治療CSG 的具體生物學(xué)機制尚不明確。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討WFC治療CSG的作用機制，并運用分子對接技術(shù)進行驗證，為后續(xù)WFC 治療CSG研究提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分篩選及潛在靶點獲取通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）及中藥綜合資源數(shù)據(jù)庫（TCMID）（http：//119.3.41.228：8000/tcmid/）收集WFC（紅參、香茶菜、枳殼）的主要成分，并以類藥性（DL）≥0.18%、口服利用度（OB）≥30%或OB 為HIGH、DL 為YES 為條件篩選出藥性較好的活性成分[7]，并通過Cytoscape 3.7.2繪制中藥-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫及SwissTargetPrediction 網(wǎng)站（www.swisstargetprediction.ch）搜索藥物活性成分對應(yīng)的靶點，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）進行靶點信息比對和基因名校正，限定基因來源為人源性。

1.2 疾病相關(guān)靶點獲取通過檢索GeneCard 數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）及OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org），以“Chronic Superficial Gastritis”為檢索詞進行篩選。通過合并2個數(shù)據(jù)庫搜索得到的疾病靶點與藥物靶點進行映射獲取交集靶點，利用韋恩在線網(wǎng)站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）做交集靶點韋恩圖，采用Cytoscape3.7.2 軟件將結(jié)果進行可視化，構(gòu)建藥物-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建將交集靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/cgi/input.pl）構(gòu)建PPI，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，借助網(wǎng)絡(luò)分析工具，以選取連接度和結(jié)合分值為可視化參數(shù)，設(shè)置統(tǒng)計信息生成樣式為環(huán)形布局，作靶標蛋白互作信息圖。借助Cyto NCA 插件中的Degree、Betweenness、Closeness 等參數(shù)篩選節(jié)點，將連接度大于等于2倍中位數(shù)的節(jié)點確定為核心靶點[8]。將核心靶點與對應(yīng)的化合物一一對應(yīng)，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 作圖，以連接度值為篩選條件，選取排位靠前的有效成分，得到WFC治療CSG的關(guān)鍵成分。

1.4 基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）通路富集分析將關(guān)鍵靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行GO 和KEGG（https：//www.kegg.jp/kegg/）通路富集分析，獲取關(guān)鍵靶點的相關(guān)生物學(xué)信息，并利用R 軟件繪制氣泡圖。

1.5 活性成分和核心靶點分子對接從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）獲取靶點蛋白的三維結(jié)構(gòu)，篩選物種來源為人源，選擇方法為X射線，分辨率在2.50 ? 以下，下載靶蛋白PDB Format 文件；從PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取成分化學(xué)結(jié)構(gòu)，并用Chem3d 軟件轉(zhuǎn)化為mol2 格式；利用SYBYL-X 2.1.1 軟件中的Surflex-Dock 對接程序?qū)械鞍着c成分進行對接，以驗證成分-靶點之間的可能性。

2 結(jié)果

2.1 WFC 活性成分和潛在靶點獲取見表1、圖1。在TCMSP 及TCMID 中搜索WFC 活性成分，以DL≥0.18%、OB≥30%或OB 為HIGH、DL 為YES 為篩選條件，刪除重復(fù)項，共得到30 個活性成分，除去未搜索到靶點的化合物，最終得到25 個藥物活性成分（香茶菜主要成分OB 值及DL 值通過SwissADME 網(wǎng)站獲取，網(wǎng)址為www.swissadme.ch）。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫及SwissTargetPrediction 網(wǎng)站共獲得519 個藥物潛在靶點，利用Cytoscape 3.7.2 繪制中藥-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖。

表1 WFC主要活性成分

2.2 CSG 靶點獲取見圖2、圖3。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫里共找到896 個與CSG 相關(guān)基因，在OMIM 數(shù)據(jù)庫共找到88個相關(guān)基因。通過合并2個數(shù)據(jù)庫找到的CSG靶點與WFC活性成分潛在靶點進行對比，利用韋恩在線網(wǎng)站尋找交集靶點，共得到137 個共同靶點。將WFC 活性成分與CSG 靶點交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2將結(jié)果可視化，并構(gòu)建WFC活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

圖2 韋恩圖

圖3 活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 核心靶點互作圖見圖4、圖5。將上述137 個交集靶點導(dǎo)入STRING 在線數(shù)據(jù)庫，獲取蛋白質(zhì)相互作用信息，構(gòu)建PPI。137 個目標靶點存在復(fù)雜的相互作用，共有137 個結(jié)點，2 461 條邊，結(jié)點平均度值為35.9，結(jié)點度值的中位數(shù)為31，最大值為107，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，共得到WFC 治療CSG 的137 個靶點互作信息圖，設(shè)置度的篩選值為2 倍平均數(shù)值72 至最大值107，從交集靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出核心靶點17 個，分別為白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、抑癌基因53（TP53）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、表皮生長因子受體（EGFR）、原癌基因（JUN）、白細胞介素-1β（IL-1β）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（CASP3）、連環(huán)蛋白β 1（CTNNβ1）、雞肉瘤病毒基因（SRC）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）3、熱休克蛋白90α 型1（HSP90AA1）、缺氧誘導(dǎo)因子-1A（HIF1A）、環(huán)加氧酶2（PTGS2）等。根據(jù)度值大小，從核心靶點中篩選出10 個關(guān)鍵靶點，分別為IL-6、TNF、AKT1、VEGFA、TP53、STAT3、EGFR、JUN、IL-1B、CASP3。根據(jù)蛋白與蛋白的Degree 值繪制17 個核心靶點節(jié)點的條形圖，將17 個核心靶點對應(yīng)化合物進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。結(jié)果顯示，以度值為篩選條件，前8 味成分為人參皂苷Rh2（Ginsenoside Rh2）、柚皮素（Naringenin）、14-乙?；?耐陰午茶菜素b（14-acetylumbrosin b）、β-谷甾醇（β-sitosterol），川陳皮素（Nobiletin）、胡麻黃素（Pedalitin）、亞甲基苯甲酸（Amethystoicacid）、橙皮素（Hesperetin）。

圖4 WFC靶標蛋白互作信息圖

圖5 WFC有效成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO 分析將137 個交集靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，并限定物種來源為人源，選擇標記欄為 official gene symbol 進行檢索，設(shè)定閾值以錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.01 為前提，確定了338 個GO 條目。見圖6。其中生物過程（BP）相關(guān)條目258 個，主要包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細胞凋亡過程的負調(diào)控等；分子功能（MF）相關(guān)條目49 個，主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合、同類蛋白結(jié)合、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）結(jié)合等；細胞組分（CC）相關(guān)條目31 個，主要包括細胞質(zhì)、細胞質(zhì)基質(zhì)、細胞核等，分別取前10 條進行可視化分析。

圖6 GO分析

2.5 KEGG 通路富集分析見圖7。利用DAVID 平臺的KEGG通路富集分析功能對WFC與CSG的137個交集靶點在信號通路中的作用進行分析，共得到166 條信號通路。根據(jù)FDR＜0.01篩選出141條信號通路。利用R-4.0.5 進行KEGG 通路富集可視化分析，通過相應(yīng)通路基因數(shù)量、相應(yīng)通路基因占總體基因的比率和FDR 來衡量KEGG 富集程度，篩選并確定其中20 條最具統(tǒng)計意義的通路，發(fā)現(xiàn)WFC 作用于CSG的靶點常見通路有癌癥信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號通路等。

圖7 KEGG通路富集分析

2.6 分子對接結(jié)果見圖8、圖9。利用Surflex-Dock 對接程序?qū)PI 網(wǎng)絡(luò)中排名前8 的關(guān)鍵成分（人參皂苷Rh2、柚皮素、14-乙?；?耐陰午茶菜素b、β-谷甾醇、川陳皮素、胡麻黃素、亞甲基苯甲酸、橙皮素）與排名前10的關(guān)鍵靶點（IL-6、TNF、AKT1、VEGFA、TP53、STAT3、EGFR、JUN、IL-1β、CASP3）進行分子對接。當?shù)玫椒种翟酱?，表示配體與靶蛋白受體結(jié)合越穩(wěn)定，當分值大于5 時說明分子與靶點有較好的結(jié)合活性，分值大于7 則說明分子與靶點的結(jié)合構(gòu)型具有強烈的活性[9-10]。結(jié)果顯示，80 組分子對接平均分值為5.2，最高分值為11.8，表明篩選出的關(guān)鍵靶點與關(guān)鍵成分間具有較好的匹配度。

圖8 分子對接熱圖

圖9 部分活性成分-靶點分子對接模式圖

3 討論

CSG 是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，由細菌、病毒、幽門螺桿菌（Hp）感染等原因引起，癥狀表現(xiàn)為不同程度的食欲減退、消化不良、反胃、惡心嘔吐以及腹部不適等，嚴重影響患者日常生活。WFC 收載于《中華人民共和國藥典》[11]，由紅參、香茶菜、麩炒枳殼3味中藥組成，對治療CAG、胃十二指腸潰瘍等消化道疾病療效確切，且安全性良好[4]。本研究發(fā)現(xiàn)WFC 治療CSG 的主要有效成分有人參皂苷Rh2、柚皮素、14-乙?；?耐陰午茶菜素b、β-谷甾醇、川陳皮素、胡麻黃素、亞甲基苯甲酸、橙皮素等。人參皂苷Rh2是一種四環(huán)三萜類皂苷單體，為紅參的主要有效成分之一，研究表明人參皂苷Rh2可調(diào)節(jié)巨噬細胞、自然殺傷（NK）細胞等免疫細胞功能及多種細胞因子分泌，又能抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[12]。β-谷甾醇為紅參與枳殼的主要有效成分，其可降低Hp 感染的胃炎小鼠胃黏膜中Toll 樣受體2（TLR2）、磷酸化核因子κB 抑制蛋白α（p-IKBα）、磷酸化細胞核因子（NF-κB p65）、磷酸化κB抑制蛋白激酶α（IKK-α）蛋白表達水平，改善Hp 感染性胃炎小鼠炎癥和黏膜損傷，發(fā)揮胃保護作用[13]。川陳皮素為枳殼的有效成分之一，研究證實川陳皮素可以通過提高抗氧化活性及減少促炎細胞因子表達來發(fā)揮對乙醇誘導(dǎo)的小鼠急性胃損傷的保護作用[14]。柚皮素是一種黃酮類化合物，廣泛存在于枳殼等多種中藥中，具有較強的抗炎、抗氧化及抗癌功能，研究顯示，柚皮素對胃癌治療具有一定療效[15]。枳殼中的橙皮素與柚皮素同屬于黃酮類化合物，具有抗氧化和抗炎等多種生物學(xué)活性[16]。以上報道與本研究結(jié)果相互印證，表明運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究WFC 治療CSG 的分子機制具有一定科學(xué)性。

由PPI網(wǎng)絡(luò)圖可知，WFC治療CSG的關(guān)鍵靶點有IL-6、TNF、AKT1、VEGFA、TP53、STAT3、EGFR、JUN、IL-1β、CASP3 等，這些靶點主要與炎癥和免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)。AKT1 屬于蛋白激酶超家族，在調(diào)節(jié)細胞代謝、生長、凋亡和生存方面具有重要意義，且具有致癌作用[17]。IL-6 的表達與炎癥反應(yīng)、Hp 相關(guān)胃腸疾病發(fā)展息息相關(guān)，它不僅能誘導(dǎo)炎癥細胞的募集，還能刺激產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[18]。TNF 是促進Hp 感染、抑制胃酸分泌的關(guān)鍵性炎癥因子，也是介導(dǎo)CSG 發(fā)病的重要因子[19]。覃樂等[20]研究發(fā)現(xiàn)香茶菜能減少IL-1β、IL-18、IL-6、TNF 等炎癥因子的釋放。人參皂苷Rh2 可明顯降低IL-6、TNFα、IL-1β、一氧化氮合成酶（iNOS）和環(huán)氧化酶-抑制劑（COX2）表達，且對于引起炎癥的MAPK 和NF-κB 的磷酸化起到阻斷作用[21]。研究發(fā)現(xiàn)CSG患者多伴有Hp感染，磷酸化AKT表達水平在Hp模型組中顯著升高[22]。VEGFA 也被稱為血管通透性因子，具有較強的誘導(dǎo)血管滲漏的能力，其誘導(dǎo)的血管通透性增強是其在炎癥和其他病理環(huán)境中發(fā)揮重要作用的基礎(chǔ)。綜上所述，WFC 可能通過多途徑、多靶點抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療CSG作用。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，WFC治療CSG的交集靶點主要富集在癌癥信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路等?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，癌癥信號通路涵蓋范圍較廣，與磷脂酰肌醇-3-激酶-蘇氨酸激酶（PI3K-Akt）、MAPK、核因子κB/STAT3（NF-κB/STAT3）信號通路等聯(lián)系密切，可引起基因組損傷，化療抵抗等反應(yīng)[23]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，CSG 與WFC 的交集靶點有42%存在于癌癥信號通路上，表明WFC 對CSG 的干預(yù)作用可能與癌癥信號通路息息相關(guān)。臨床發(fā)現(xiàn)CSG患者大多檢測出Hp陽性，Hp感染是非萎縮性胃炎向萎縮性胃炎發(fā)展，發(fā)生癌前病變和癌癥的重要因素[24-25]。臨床上Hp 感染慢性胃炎患者血清中TNF-α和IL-6水平升高，且血清中TNF-α和IL-6 表達水平與慢性胃炎的嚴重程度密切相關(guān)[26]。研究發(fā)現(xiàn)隨著慢性胃炎病程的延長，Ⅱb 型早期胃癌的檢出率有上升趨勢[27]；刁卓等[28]研究表明TNF-α 在胃癌中的表達明顯高于癌旁正常組織，并證明了胃癌中受體相互作用蛋白激酶3（RIP3）/TNF-α 通路上調(diào)介導(dǎo)了程序性細胞壞死。TP53又被稱為p53，屬于抑癌基因，與抗炎活動有關(guān)，p53 可以顯著抑制小鼠原發(fā)性巨噬細胞 TNF-α 基因表達，降低血清TNF-α水平，發(fā)揮抗炎作用[29-30]。高尤亮[31]等研究發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)p53 的表達能夠促進炎癥細胞凋亡，抑制TNF-α 等炎癥細胞因子表達，減輕胃黏膜癥狀。藥理研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2能通過抑制PI3K/AKT通路，激活p53 信號通路，進一步誘導(dǎo)癌細胞凋亡[32]。此外，Hp 感染不僅可以加劇脂質(zhì)代謝紊亂，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成，還可能加劇炎癥反應(yīng)和增加動脈粥樣硬化的發(fā)生率[33]。分子對接結(jié)果初步驗證了WFC 治療CSG 的可靠性，分子對接結(jié)果顯示，80 組分子對接平均分值為5.2，表明關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點具有一定的結(jié)合活性，其中，14-乙?；?耐陰午茶菜素b與STAT3的結(jié)合得分最高，具有重要的參考價值，可為后續(xù)進一步開展相關(guān)中藥及成分研究提供數(shù)據(jù)支撐。

綜上所述，WFC 中人參皂苷Rh2、柚皮素、14-乙酰基-耐陰午茶菜素b 等活性成分能夠作用于IL-6、TNF、AKT1、VEGFA 等靶點，調(diào)控癌癥信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號等治療CSG。