不同種類氨基酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量的影響

王平 劉桂君 喬宇琛 周思靜 宋梅芳 顧?？? 侯莉

摘要? ［目的］研究液體培養(yǎng)基中添加氨基酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量的影響，并確定8種氨基酸最佳添加濃度。［方法］考察24種氨基酸（添加濃度為1 g/L）對蟲草素含量的影響，采用DPS V18.10軟件進(jìn)行差異顯著性分析，并對促進(jìn)蟲草素合成作用顯著的8種氨基酸添加濃度進(jìn)行研究。［結(jié)果］L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-天門冬酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-組氨酸、肌氨酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量具有不同程度的提高作用；4 g/L的L-甘氨酸對蟲草素的合成促進(jìn)作用最強(qiáng)，發(fā)酵液中蟲草素含量為1 022.25 mg/L。［結(jié)論］該研究為蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞? 蛹蟲草；蟲草素；氨基酸；含量；培養(yǎng)基；發(fā)酵液

中圖分類號(hào)? S567.3+5? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A? 文章編號(hào)? 0517-6611（2024）09-0152-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.09.034

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of Amino Acids on Cordycepin Content in the Fermentation Broth of Cordyceps militaris

WANG Ping1， LIU Gui-jun2， QIAO Yu-chen2 et al

（1. Beijing Academy of Science and Technology， Beijing 100089;2. National Natural History Museum of China， Beijing 100050）

Abstract? ［Objective］To study the effects of amino acids added in liquid culture medium on cordycepin content in the fermentation broth of Cordyceps militaris， and determine the optimal concentration of 8 kinds of amino acids added in liquid culture medium.［Method］The effects of 24 kinds of amino acids （adding concentration 1 g/L） on cordycepin content were studied. DPS V18.10 software was used for significant difference analysis. Adding L-lysine， L-cysteine， L-arginine， L-asparagine， L-glycine， L-alanine， L-serine， L-threonine， L-histidine and sarcosine had varying degrees of increasing effects on cordycepin content in the fermentation broth of Cordyceps militaris. 4 g/L L-glycine had the strongest promoting effect on cordycepin synthesis， and the cordycepin content in the fermentation broth was 1 022.25 mg/L. ［Conclusion］This study provides references for producing cordycepin by Cordyceps militaris liquid fermentation.

Key words? Cordyceps militaris;Cordycepin;Amino acid;Content;Culture medium;Fermentation broth

基金項(xiàng)目? 北京市科學(xué)技術(shù)研究院創(chuàng)新培育項(xiàng)目（23CB091）；北京市科學(xué)技術(shù)研究院北科萌芽計(jì)劃課題（BGS202213）。

作者簡介? 王平（1991—），女，北京人，工程師，從事食藥用資源開發(fā)與利用研究。

*通信作者，正高級(jí)工程師，博士，從事食藥用資源開發(fā)與利用研究。

收稿日期? 2023-07-09

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又稱北冬蟲夏草，是我國傳統(tǒng)的藥食兼用真菌［1］。蛹蟲草含有豐富的生物活性成分，包括蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、類胡蘿卜素、腺苷、N6-（2-羥乙基）腺苷及超氧化物歧化酶等［2-5］。蟲草素（ Cordycepin）即3′-脫氧腺苷是蛹蟲草重要活性成分之一［6］，具有抗腫瘤［7］、治療白血病［8］、抗炎［9］、抗病毒［10］、抗肥胖［11］等生物活性作用。英國牛津大學(xué)與NUCANA生物制藥公司利用ProTide技術(shù)，將5-O-phenyl-（benzyloxy-L- alaninyl）- phosphate基團(tuán)連接在蟲草素上，合成一種新型化療藥物NUC-7738，對晚期實(shí)體瘤患者具有很強(qiáng)的抗癌活性［12］，對蟲草素在抗癌中的應(yīng)用起到了極大的推進(jìn)作用，因此研究如何提高蛹蟲草中蟲草素產(chǎn)量，獲取更多的原料，對于蟲草素在醫(yī)藥中的應(yīng)用具有重要意義。

氨基酸是微生物生長過程中培養(yǎng)基的重要組成成分，也是微生物代謝中重要原料，會(huì)直接影響次生代謝物的合成，研究表明，氨基酸對蛹蟲草中蟲草素產(chǎn)量具有重要影響。早在2005年毛先兵等［13］研究氨基酸對液體培養(yǎng)蛹蟲草產(chǎn)蟲草素的影響，得出半胱氨酸、絲氨酸、丙氨酸等促進(jìn)蟲草素形成，添加20 mmol/L絲氨酸，蟲草素產(chǎn)量最大值為211 mg/L，比對照提高26%。Masuda等［14］優(yōu)化蛹蟲草NBRC9787菌株液體培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)甘氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、腺嘌呤、腺苷等能促進(jìn)蟲草素的產(chǎn)生。Das等［15］在培養(yǎng)基中以甘氨酸替代部分酵母提取物，可以將蟲草素產(chǎn)量提高12.40%。另有研究表明，添加丙氨酸、苯丙氨酸、L-天門冬酰胺、甘氨酸、L-谷氨酰胺、精氨酸等均可以在一定程度上促進(jìn)蟲草素的合成，從而提高蟲草素的產(chǎn)量［16-22］。已有研究報(bào)道多是對其中1種或者3～5種氨基酸進(jìn)行研究，研究不同添加時(shí)間、與腺苷或腺嘌呤不同配比等對蛹蟲草中蟲草素含量的影響，陳長蘭等［21］研究20種氨基酸對蛹蟲草菌絲體中蟲草素含量的影響，并未對發(fā)酵液進(jìn)行研究，而研究表明蛹蟲草中97%～98%的蟲草素分布在發(fā)酵液中，因此研究氨基酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量的影響對于蟲草素發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義。為此，該研究選定24種氨基酸，考察不同種類氨基酸和不同濃度氨基酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量的影響，為蟲草素的發(fā)酵生產(chǎn)提供重要參考。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

1.1.1? 菌種。

蛹蟲草（Cordyceps militaris）菌株CM11，經(jīng)過離子束輻射誘變篩選得到，北京市科學(xué)技術(shù)研究院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2? 培養(yǎng)基。

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基39 g/L，加熱溶解，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 自然，121 ℃，滅菌30 min。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖30.0 g/L，胰蛋白胨4.0 g/L，酵母粉2.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4 0.5 g/L，加熱溶解，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 自然，121 ℃，滅菌30 min。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖40.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCl2 1.0 g/L，pH自然，加熱溶解，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃，滅菌30 min。

1.1.3? 試劑。

葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、氯化鈣等均為分析純試劑，胰蛋白胨、酵母粉、蛋白胨等均為生物培養(yǎng)基級(jí)別，購自國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司；24種氨基酸均為生物培養(yǎng)基級(jí)別，購自北京酷來搏科技有限公司；蟲草素為高效液相色譜純級(jí)別，購自Sigma公司；甲醇為高效液相色譜級(jí)別，購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技公司。

1.1.4? 儀器與設(shè)備。

1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫儀器公司；5424型高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；ZHWY-2112B雙層恒溫?fù)u床，上海智誠分析儀器制造有限公司；SPX智能型生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 菌種活化與固體培養(yǎng)。

將4 ℃冷藏箱保存的蛹蟲草斜面菌種放置25 ℃生化培養(yǎng)箱中活化24 h，然后轉(zhuǎn)接到PDA固體平板培養(yǎng)基中，于25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15～20 d。

1.2.2 ?液體培養(yǎng)方法。

1.2.2.1

種子液培養(yǎng)方法。蛹蟲草PDA固體平板培養(yǎng)基菌種用無菌打孔器打出大小相同的接種塊，挑取5塊接種于裝有種子液培養(yǎng)基的三角瓶中，放置在25 ℃恒溫?fù)u床中，設(shè)定轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為5 d。

1.2.2.2

批量液體培養(yǎng)方法。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加24種氨基酸，添加濃度為1 g/L，對照組為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不添加任何氨基酸。按照5%的接種量將種子液接入裝有100 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，放置在25 ℃恒溫?fù)u床中，設(shè)定轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為7 d。

1.2.2.3

考察不同濃度氨基酸對蟲草素含量影響的方法。選取促進(jìn)蟲草素合成的氨基酸，分別添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加濃度為1、2、4、8、16 g/L。其余方法與“1.2.2.2”批量液體培養(yǎng)方法相同。

1.2.3? 發(fā)酵液中蟲草素含量的測定。

1.2.3.1

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。準(zhǔn)確稱取0.01 g蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水稀釋至10 mL，配制成1 000 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液，梯度稀釋，蟲草素的濃度為0、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00 μg/mL。采用高效液相色譜法（HPLC）測定蟲草素的含量，根據(jù)標(biāo)樣濃度與峰面積的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2

蟲草素測定方法。采用高效液相色譜法（HPLC）測定，DAD檢測器，檢測波長為260 nm，色譜柱XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇∶純水（V/V）15∶85，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫箱溫度為25 ℃。

1.2.3.3

蛹蟲草發(fā)酵液樣品制備方法。取蛹蟲草發(fā)酵混合物，裝入離心管中，采用冷凍離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速8 000 r/min，離心5 min后取上清液，0.22 μｍ水相無菌濾膜過濾，得到待測樣品。

1.2.4? 差異顯著性分析。

每組樣品均為3次平行，采用DPS V18.10軟件對所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 24種氨基酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量的影響

由表1可知，在液體培養(yǎng)基中添加的24種氨基酸，顯著促進(jìn)蟲草素合成的氨基酸有8種，其中非極性氨基酸有2種，分別為L-甘氨酸、L-丙氨酸，添加這2種氨基酸能夠顯著提高蟲草素含量，分別提高110.28和86.25 mg/L；堿性氨基酸有2種，分別為L-賴氨酸、L-精氨酸，其中添加L-賴氨酸對蟲草素含量提高257.87 mg/L，效果最為顯著；中性氨基酸有4種，分別為L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-半胱氨酸、L-天門冬酰胺，其中添加L-半胱氨酸對蟲草素含量提高較為顯著，提高159.56 mg/L。不同種類的氨基酸對蛹蟲草中蟲草素含量的提高幅度各不相同，堿性氨基酸總體上對蟲草素合成具有較為明顯的促進(jìn)作用。在液體培養(yǎng)基中添加L-組氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-谷氨酰胺、L-瓜氨酸、L-焦谷氨酸和肌氨酸這7種氨基酸對提高蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量影響差異不顯著。在液體培養(yǎng)基中添加L-胱氨酸和L-脯氨酸會(huì)顯著抑制蟲草素合成，導(dǎo)致蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量降低。在液體培養(yǎng)基中添加L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸、L-酪氨酸和L-天冬氨酸這7種氨基酸對蟲草素合成有一定的抑制作用，但效果不顯著。在上述24種氨基酸中，對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量提高作用最強(qiáng)的為L-賴氨酸，其次為L-半胱氨酸、L-精氨酸和L-天門冬酰胺。

2.2? 不同濃度氨基酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量的影響

根據(jù)各種氨基酸對蟲草素含量影響的試驗(yàn)結(jié)果，選取對蟲草素含量提高幅度最為顯著的8種氨基酸，分別為L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-天門冬酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸，將其按照不同濃度添加到蛹蟲草液體培養(yǎng)基中，考察不同濃度氨基酸對蟲草素含量的影響。

2.2.1? 不同濃度L-賴氨酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量的影響。

從圖1可以看出，L-賴氨酸濃度對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量影響較大，添加1和2 g/L的L-賴氨酸促進(jìn)蟲草素合成，從而提高發(fā)酵液中蟲草素含量，含量分別為846.20和656.22 mg/L；添加4 g/L的L-賴氨酸后開始抑制蟲草素的合成，蟲草素含量迅速降低，添加8和16 g/L的L-賴氨酸時(shí)蟲草素含量降低為106.60和7.81 mg/L。由此可知，高濃度的L-賴氨酸對蛹蟲草中蟲草素的合成抑制作用非常顯著，所以考察不同濃度的L-賴氨酸對蟲草素含量的影響對于發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化具有重要意義，L-賴氨酸的最適添加濃度為1 g/L，可以有效提高蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量。

2.2.2? 不同濃度L-半胱氨酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量的影響。

從圖2可以看出，隨著L-半胱氨酸添加濃度的增加，蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量逐漸降低；添加1 g/L的L-半胱氨酸能夠促進(jìn)蟲草素的合成，蟲草素含量為749.70 mg/L；添加2 g/L的L-半胱氨酸后開始抑制蟲草素的合成，蟲草素含量逐漸降低；添加16 g/L的L-半胱氨酸時(shí)蟲草素含量降低為248.84 mg/L。由此可知，高濃度的L-半胱氨酸對蛹蟲草中蟲草素的合成具有顯著抑制作用，因此L-半胱氨酸的最適添加濃度為1 g/L，可以將蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量提高27.93%。

2.2.3? 不同濃度L-精氨酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量的影響。

從圖3可以看出，隨著在液體培養(yǎng)基中添加L-精氨酸的濃度增大，蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量不斷降低。添加1 g/L的L-精氨酸能夠提高發(fā)酵液中蟲草素含量；添加2和4 g/L的L-精氨酸開始抑制蟲草素的合成；添加8 g/L的L-精氨酸時(shí)蟲草素含量為228.65 mg/L，已經(jīng)降低為對照的39.02%；而添加16 g/L的L-精氨酸時(shí)蟲草素含量低至7.60 mg/L，比對照減少了98.70%。因此，高濃度的L-精氨酸嚴(yán)重抑制蟲草素的合成，L-精氨酸的最適添加濃度為1 g/L，蟲草素含量為736.62 mg/L。

2.2.4? 不同濃度L-天門冬酰胺對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量的影響。

從圖4可以看出，添加1～8 g/L的L-天門冬酰胺對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量具有提高作用，提高的幅度與添加L-天門冬酰胺的濃度呈負(fù)相關(guān)，即添加L-天門冬酰胺的濃度越大，蟲草素含量提高的幅度越??；添加1 g/L的L-天門冬酰胺對蟲草素的提高效果最為顯著，蟲草素含量提高142.49 mg/L；添加16 g/L的L-天門冬酰胺抑制蟲草素的合成，蟲草素含量為509.11 mg/L，比對照降低76.87 mg/L。因此，L-天門冬酰胺的最佳添加濃度為1 g/L，發(fā)酵液中蟲草素含量為728.47 mg/L。

2.2.5? 不同濃度L-甘氨酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量的影響。

從圖5可以看出，蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量隨著L-甘氨酸添加濃度的增加先升高后降低；添加4 g/L的L-甘氨酸時(shí)發(fā)酵液中蟲草素含量最高，比對照提高436.27 mg/L；添加1、2和8 g/L的L-甘氨酸對發(fā)酵液中蟲草素含量具有不同程度的提高；添加16 g/L的L-甘氨酸對蟲草素的合成具有一定的抑制作用，導(dǎo)致蟲草素含量降低19.16 mg/L。因此，L-甘氨酸的最適添加濃度為4 g/L，發(fā)酵液中蟲草素含量為1 022.25 mg/L，比不添加氨基酸的發(fā)酵液中蟲草素含量提高74.45%，提高效果明顯。

2.2.6? 不同濃度L-丙氨酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量的影響。

從圖6可以看出，添加1～16 g/L的L-丙氨酸均可以提高發(fā)酵液中蟲草素含量，隨著添加濃度的增大，蟲草素含量先提高后降低，但總體是促進(jìn)蟲草素的合成，提高蟲草素的含量。添加8 g/L的L-丙氨酸時(shí)發(fā)酵液中蟲草素含量最高，比對照提高247.16 mg/L；添加16 g/L的L-丙氨酸時(shí)發(fā)酵液中蟲草素含量為609.70 mg/L，雖然比添加8 g/L時(shí)的含量降低，但與對照相比，仍然對蟲草素含量具有提高作用，提高23.72 mg/L。因此，L-丙氨酸的最適添加濃度為8 g/L，發(fā)酵液中蟲草素含量為833.14 mg/L，比對照發(fā)酵液中蟲草素含量提高42.18%。

2.2.7? 不同濃度L-絲氨酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量的影響。

從圖7可以看出，添加不同濃度的L-絲氨酸可以促進(jìn)蟲草素的合成，也可以抑制蟲草素的合成；添加1～4 g/L的L-絲氨酸可以提高發(fā)酵液中蟲草素含量；添加8～16 g/L的L-絲氨酸會(huì)降低發(fā)酵液中蟲草素含量；在添加1 g/L的L-絲氨酸時(shí)發(fā)酵液中蟲草素含量最高，為654.63 mg/L，比對照提高11.72%。

2.2.8? 不同濃度L-蘇氨酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量的影響。

從圖8可以看出，蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量隨著L-蘇氨酸添加濃度的增加先升高后降低，添加1和2 g/L的L-蘇氨酸可以促進(jìn)蟲草素的合成，從而提高發(fā)酵液中蟲草素含量；添加4～16 g/L的L-蘇氨酸會(huì)抑制蟲草素的合成，從而降低發(fā)酵液中蟲草素含量。添加2 g/L的L-蘇氨酸時(shí)發(fā)酵液中蟲草素含量最高，為667.64 mg/L，比對照提高13.94%。

3? 結(jié)論與討論

在考察的24種氨基酸中，添加濃度為1 g/L時(shí)，對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素合成促進(jìn)作用最強(qiáng)的為L-賴氨酸，蟲草素含量為846.20 mg/L，這與文獻(xiàn)報(bào)道添加賴氨酸可以促進(jìn)蟲草素合成、提高菌絲體中蟲草素含量的結(jié)果相似［18，21］。該研究還發(fā)現(xiàn)1 g/L 的L-半胱氨酸對蟲草素含量提高作用也較為顯著，這與文獻(xiàn)報(bào)道添加1 g/L 的L-半胱氨酸會(huì)降低蟲草素的含量［16］不一致，分析可能與菌株不同有關(guān)，不同的菌株對氨基酸的利用能力不同。1 g/L 的L-精氨酸對蟲草素含量提高作用僅次于L-賴氨酸和L-半胱氨酸，這與文獻(xiàn)報(bào)道添加2 g/L的精氨酸可以提高菌絲體中的蟲草素含量［18］的結(jié)果相似。在蛹蟲草培養(yǎng)基中添加甘氨酸的研究較多，研究表明添加1、5和14 g/L甘氨酸可以促進(jìn)蛹蟲草中蟲草素的合成，對其產(chǎn)量具有不同程度的提高作用［15，16-17，19-20］。

該研究發(fā)現(xiàn)1 g/L的L-賴氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-天門冬酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-絲氨酸和L-蘇氨酸這8種氨基酸對蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素合成均有顯著促進(jìn)作用，對提高蟲草素含量的影響程度各不相同；L-組氨酸、肌氨酸、L-焦谷氨酸、L-瓜氨酸、L-甲硫氨酸、L-谷氨酰胺和L-纈氨酸這7種氨基酸對提高蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素含量有一定程度的影響，但差異不顯著；L-酪氨酸、L-異亮氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-天冬氨酸、L-胱氨酸和L-脯氨酸這9種氨基酸對蟲草素合成有一定的抑制作用，影響程度各不相同。在對氨基酸添加濃度考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加4 g/L的L-甘氨酸對蟲草素的合成促進(jìn)作用最強(qiáng)，發(fā)酵液中蟲草素含量達(dá)到1 022.25 mg/L。該研究為蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素提供可靠的數(shù)據(jù)參考，對液體培養(yǎng)基中氨基酸的選擇具有指導(dǎo)意義。

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