氨基酸分析在重組蛋白類生物制品質(zhì)量控制中的應(yīng)用研究

◎ 魏 欣

（華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司，河北 石家莊 050035）

1 氨基酸分析基本原理和方法綜述

氨基酸分析是用化學(xué)或者生物化學(xué)方法準(zhǔn)確地確定蛋白質(zhì)或者多肽的氨基酸成分、順序和含量。氨基酸分析方法包括高效液相色譜法（HPLC）、毛細(xì)管電泳法、氨基酸自動(dòng)分析儀法和質(zhì)譜法等。這些方法可以實(shí)現(xiàn)樣品的定性與定量分析，從而為深入了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能，提供關(guān)鍵信息[1]。

2 重組蛋白類生物制品的意義及其挑戰(zhàn)

重組蛋白類生物制品被廣泛用于醫(yī)學(xué)治療、疫苗開發(fā)和診斷試劑中，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且容易受到生產(chǎn)過程的影響，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量發(fā)生變異。因此，保證這類產(chǎn)品的安全非常重要。同時(shí)，重組蛋白分子量較大、穩(wěn)定性較差，且翻譯后修飾種類繁多，給其質(zhì)量控制帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此，相關(guān)機(jī)構(gòu)有必要建立一種嚴(yán)格而有效的檢測手段。氨基酸分析能夠直觀地反映蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)特征，評價(jià)重組蛋白類生物制品的純度、完整性，以及折疊和翻譯后的修飾狀態(tài)?；诖?，本研究探索了氨基酸分析技術(shù)在重組蛋白類生物制品質(zhì)量控制方面的運(yùn)用，以揭示該技術(shù)的潛在價(jià)值，為重組蛋白類生物制品質(zhì)量控制體系的進(jìn)一步優(yōu)化，提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

3 氨基酸分析用于重組蛋白類生物制品的質(zhì)量控制

3.1 序列確認(rèn)

氨基酸組成及序列分析，對于重組蛋白精確性及一致性的檢驗(yàn)至關(guān)重要。通過將實(shí)際測得氨基酸序列同預(yù)期設(shè)計(jì)理論序列進(jìn)行比對，能夠準(zhǔn)確判斷蛋白質(zhì)表達(dá)的正確性，評價(jià)批次之間的一致性，保證藥物有效安全。在重組蛋白類生物制品質(zhì)量控制過程中，序列確認(rèn)是保證產(chǎn)品結(jié)構(gòu)正確一致的核心步驟，氨基酸分析技術(shù)對這一進(jìn)程有著至關(guān)重要的作用[2]。

3.2 純度評估

氨基酸含量的比例分析，可以有效反映重組蛋白的純度高低。通過準(zhǔn)確測定目標(biāo)蛋白各氨基酸的含量，可計(jì)算目標(biāo)蛋白和其他雜質(zhì)（如宿主細(xì)胞的蛋白、降解產(chǎn)物）之間的配比，定量評價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量。

3.3 端點(diǎn)氨基酸識別

通過識別N 端、C 端的氨基酸，可以識別重組蛋白能否完成適當(dāng)?shù)姆g，以及有無截短、延長等現(xiàn)象。同時(shí)，N/C 端氨基酸狀態(tài)可揭示乙酰化和甲基化等翻譯、修飾對蛋白質(zhì)活性的意義。

3.4 疏水性

電荷分布及其他理化性質(zhì)分析表明，氨基酸組成決定了蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)與功能特性。利用氨基酸分析得到的疏水性和電荷分布等數(shù)據(jù)，可以間接推測重組蛋白空間構(gòu)象及穩(wěn)定性，這對于優(yōu)化生產(chǎn)工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量，具有重要參考意義。

3.5 差異性糖基化或者磷酸化位點(diǎn)的檢測

蛋白質(zhì)翻譯、修飾后，會(huì)顯著影響重組蛋白活性、穩(wěn)定性、藥代動(dòng)力學(xué)等。因此，對其進(jìn)行檢測和定量，尤為重要。氨基酸分析可通過對實(shí)測氨基酸序列和理論序列進(jìn)行比較，定位可能存在的糖基化或者磷酸化部位，以保證產(chǎn)品的均一性及臨床療效[3]。

4 將氨基酸分析技術(shù)運(yùn)用于實(shí)際案例

4.1 具體事例簡介

以重組蛋白食品為例，在此過程中，需先對樣品進(jìn)行提取和純化，再利用高效液相色譜或者質(zhì)譜（MS）技術(shù)，酶解蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成游離氨基酸混合物。接著，對這幾種氨基酸進(jìn)行定量與定性分析，并測定其組成、順序及具體氨基酸殘基含量。有研究以重組人胰島素為例，準(zhǔn)確測定了各氨基酸所占比例及C 端蘇氨酸與A 鏈、B 鏈之間二硫鍵的狀態(tài)，保證了產(chǎn)物符合天然胰島素的結(jié)構(gòu)[4]。

4.2 案例研究

根據(jù)氨基酸分析數(shù)據(jù)，可綜合評價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量。有研究對特定批重組生長激素進(jìn)行了氨基酸分析，結(jié)果表明，目標(biāo)蛋白具有較高純度，且氨基酸組成完全符合預(yù)期設(shè)計(jì)，但是疏水性氨基酸所占比例比理論值略大，可能影響藥物穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上，研究學(xué)者提出要優(yōu)化生產(chǎn)工藝，如調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)條件、完善純化步驟等，以減少疏水氨基酸片段生成，進(jìn)而提高產(chǎn)物穩(wěn)定性及活性。另外，如果檢測到有異常糖基化位點(diǎn)時(shí)，需要進(jìn)一步探究糖基化修飾過程中的影響因素，并對生產(chǎn)流程進(jìn)行調(diào)整，以保證產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)。

5 氨基酸分析技術(shù)發(fā)展動(dòng)向及前景

5.1 新型氨基酸分析技術(shù)研究與發(fā)展動(dòng)態(tài)

近幾年，氨基酸分析技術(shù)發(fā)展迅速。例如，高效液相色譜技術(shù)分辨率、靈敏度高，將其與熒光檢測及紫外檢測相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品氨基酸的準(zhǔn)確測定；質(zhì)譜技術(shù)，包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）等，可以提供更為全面的氨基酸序列信息及翻譯后修飾狀態(tài)等信息，具有高通量、高精度等特點(diǎn)。此外，串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）、多維蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等生物質(zhì)譜新技術(shù)，也為氨基酸分析提供了更深入的可能。

①液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，將高效液相色譜技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，是氨基酸定量和定性分析的重要方法，其經(jīng)過樣品預(yù)處理，衍生化技術(shù)及色譜分離條件等優(yōu)化后，可準(zhǔn)確確定蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物氨基酸成分。同時(shí)，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)一步增強(qiáng)了對氨基酸序列信息和翻譯后修飾位點(diǎn)的識別能力。②毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對氨基酸等小分子的快速分離，具有高分辨率、靈敏度高的特點(diǎn)，特別適合復(fù)雜生物樣品痕量氨基酸的測定，以及對異構(gòu)體、同分異構(gòu)體和其他精細(xì)結(jié)構(gòu)的判別[5]。③以芯片為核心的微流控技術(shù)，可以對樣品進(jìn)行微型化處理分析，極大地減少樣本及試劑的消耗，提高分析速度。④多維度蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)將生物質(zhì)譜、核磁共振（NMR）技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫和計(jì)算生物學(xué)方法相結(jié)合，為氨基酸組成綜合表征提供了一種新的可能性，其既能揭示蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)信息，又能對蛋白質(zhì)相互作用及其功能狀態(tài)進(jìn)行深入研究。

5.2 將氨基酸分析用于重組蛋白類生物制品質(zhì)量控制的思路

隨著氨基酸分析技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步，其對重組蛋白類生物制品的質(zhì)量控制作用也愈加突出。一方面，未來有望出現(xiàn)更多針對特殊氨基酸位點(diǎn)（磷酸化、糖基化、甲基化）的特異性分析方法，有助于重組蛋白的翻譯后修飾進(jìn)行全面準(zhǔn)確的表征；另一方面，將大數(shù)據(jù)與人工智能技術(shù)相結(jié)合，氨基酸分析數(shù)據(jù)可望形成更加系統(tǒng)化的質(zhì)量評價(jià)體系，以提升產(chǎn)品質(zhì)量評估智能化程度。與此同時(shí)，以單分子分析或者實(shí)時(shí)監(jiān)測為基礎(chǔ)的新型氨基酸分析技術(shù)，有望用于生產(chǎn)過程監(jiān)控以實(shí)現(xiàn)重組蛋白在合成、折疊和修飾等環(huán)節(jié)中的動(dòng)態(tài)跟蹤，可有效優(yōu)化生產(chǎn)工藝，保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。

總之，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，氨基酸分析用于重組蛋白類生物制品的質(zhì)量控制，將會(huì)更廣泛、更深入。通過開發(fā)更敏感、特異性更強(qiáng)的質(zhì)譜技術(shù)及手段，有望實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)糖基化、磷酸化、乙?；捌渌麖?fù)雜翻譯后改造過程的準(zhǔn)確定位及定量分析，對于評價(jià)重組蛋白的活性和藥效，意義重大。

6 結(jié)語

氨基酸分析是評價(jià)重組蛋白類生物制品核心性質(zhì)的一種關(guān)鍵技術(shù)手段，對于質(zhì)量控制過程具有重要影響。因此，加大對氨基酸分析技術(shù)的研發(fā)力度，是增強(qiáng)重組蛋白類生物制品質(zhì)量控制能力、保障公共健康與生命安全的戰(zhàn)略措施之一。