槐米提取物對黃嘌呤氧化酶活性抑制評價及作用機制研究

摘要 為了探究槐米醇提物藥效物質對體外黃嘌呤氧化酶（XOD）活性抑制的作用機制，本研究采用體外XOD促動力學模型對槐米醇提物及其潛在活性成分蕓香葉苷、槲皮素及白樺脂醇進行XOD活性抑制評價，以分析其天然成分蕓香葉苷熱-酸性水解作用對XOD活性抑制的影響。試驗結果表明，槐米提取物A在藥劑濃度100～700 μg/mL，對體外XOD活性抑制具有良好作用，其最大抑制率可達36.68%，與對照藥劑別嘌呤醇（90 μg/mL，抑制率61%）相比，抑制率較弱?；泵字兄饕瘜W成分蕓香葉苷、槲皮素及白樺脂醇在一定藥劑濃度范圍內，蕓香葉苷抑制率不明顯，槲皮素表現(xiàn)出優(yōu)異的XOD抑制作用（抑制率61.64%，IC50值為203.6 μmol/L），白樺脂醇次之。在酸性水解作用的條件下，蕓香葉苷酸性水解混合物抑制XOD活性作用較熱水解作用混合物較高。研究認為槐米醇提物對體外XOD活性抑制的藥效物質可能為槲皮素。

關鍵詞 黃嘌呤氧化酶；槐米；蘆?。婚纹に?；活性抑制

中圖分類號 TS201.2；R284.1? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2024）08-0085-06

槐米為豆科植物槐的干燥花蕾，采收于夏季，主要分布于河南、山東、山西、陜西和貴州等地。蘆丁為中藥飲片槐米的主要評價指標之一，槐米中蘆丁成分含量較高，占比約20%～30%[1]，是槐米的主要成分之一[2-3]。此外，相關研究報道了槐米醇提取物中其他的潛在活性成分，如樺皮醇、槐二醇以及槐花米甲、乙、丙素，槲皮素和槐花皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等[4-8]。

槐米具有豐富的黃酮類成分，其藥用價值較高，并具有多種生物活性，有良好的保健作用?；泵字刑J丁提取工藝的改善、藥理作用及藥效學研究等方面是槐米的研究重點。槐米的藥理作用與其成分有關，有關槐米藥理作用方面的研究報道得到高度關注，特別是其提取物在抗氧化[9]、自由基清除等方面[10-12]已取得一定的研究成果。

黃嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XOD）是近年來治療高尿酸血癥的有效生物靶點之一，是生物體內嘌呤代謝過程中黃嘌呤或次黃嘌呤羥基化作用生成尿酸的核心調控者。因此，探明提取物中起效物質組分對靶點生物酶的作用機制，是研究槐米藥理作用的核心。本文采用體外XOD促動力學模型，探討槐米醇提取物及其潛在藥效成分對XOD活性抑制評價，探究其有效活性成分的量效和構效作用關系，并進一步探討潛在活性成分模擬水煮泡或酸性胃液蠕動環(huán)境條件下的行為作用及機制分析，為相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

儀器：UV-Vis（759S，上海棱光），超聲清洗儀（YQ-020A，上海易凈），電子天平（FA124，上海恒平），N-1210BV-WB型旋轉蒸發(fā)儀（理化器械株式會社），恒溫水浴鍋（江蘇新春蘭科學儀器有限公司，HH-M8），真空冷凍干燥機（上海繼譜電子科技有限公司，F(xiàn)D-2C-80），渦流混合器[冠森生物科技（上海）有限公司，XH-D]。

試劑：槐米（中藥飲片，采購于中藥材大市場，經鑒定為合格產品），所用試劑為黃嘌呤氧化酶（XOD），黃嘌呤（Xan），別嘌呤醇（All），焦磷酸鈉緩沖溶液（0.1 mol/L，準確稱量焦磷酸鈉5.318 g、EDTA 0.017 5 g，超聲溶解于純凈水，定容至200 mL，并用磷酸調pH值至7.5），EDTA，磷酸，槲皮素，蕓香葉苷，白樺脂醇和無水乙醇等。以上試劑為分析純，購于國藥試劑公司，試驗分析用水均為純凈水。

1.2 試驗方法

1.2.1 槐米提取物A的制備? 稱取槐米粉末90.0 g于1 000 mL燒杯中，加入適量無水乙醇（500 mL），室溫浸泡24 h，過濾，濾渣繼續(xù)浸泡1次（12 h），過濾，合并濾液，真空濃縮至無溶劑狀態(tài)，然后經冷凍干燥24 h，可獲得試驗樣品槐米提取物A。

1.2.2 槐米提取物B的制備? 稱取槐米粉末用量（90.0 g）置于圓底燒瓶中，加入500 mL水，回流3 h，冷卻至室溫，過濾，濾液冷凍干燥，獲得待測樣品B。

1.2.3 天然蕓香葉苷的提取分離及純化? 取1.2.1中獲得的槐米提取物A（10.0 g），依次采用石油醚和乙酸乙酯混合試劑（V1∶V2 = 1∶1～10∶1）進行超聲洗滌至混合試劑近無色狀態(tài)，離心分離，收集固體，冷凍干燥，然后將固體進行水重結晶（2次），過濾，干燥，即獲得淡黃色固體粉末蕓香葉苷，其收率為19.8%。

1.2.4 蕓香葉苷酸水解及其混合物制備? 稱取0.004 3 g蕓香葉苷（自制）分別置于5 mL EP離心管，加入鹽酸水混合液（1 mL，pH值2.0～3.0），水浴恒溫35 ℃，分別振蕩作用2、4、6、8、12、16、20和24 h，振蕩結束后，用1% NaOH水溶液調節(jié)pH值至5.0～6.0，然后冷凍干燥，制備獲得不同作用時間待測樣品D，以分析其潛在活性成分評價及構效關系。

1.2.5 體外XOD促動力學模型構建? 向0.1 mol/L焦磷酸鈉緩沖溶液（0.4 mL，pH值7.5）中加入1.0 mmol/L的Xan溶液（1.0 mL），并加入100 mu/mL XOD溶液（1.6 mL），渦流振蕩混勻。隨后，將反應體系置于（35±2） ℃的水浴中恒溫15 min。采用UV-Vis定波長（294 nm）光度掃描，記錄對應的光度值[ΔA0，294]（參比液為2 mL緩沖液+1 mL 1.0 mmol/L的Xan溶液），以探究槐米煎煮過程對XOD活性抑制的影響。

1.2.6 體外XOD活性抑制測試? 按照1.2.5的體外XOD促動力學模型建立步驟，將待測試樣品溶液（0.4 mL）、1.0 mmol/L的Xan溶液（1.0 mL）和0.01 mg/mL的XOD溶液（1.6 mL）依次加入反應試管中，混勻，并恒溫（35±2） ℃水浴15 min。遵循上述1.2.5檢測方法，記錄294 nm處的吸光度值[ΔA1，294]。以下列公式計算待測樣所對應的抑制率（參比液為0.4 mL各濃度待測液+1.6 mL緩沖液+1mL 1.0 mmol/L的Xan溶液），以探究酸性蠕動作用過程對蕓香葉苷的影響。

[抑制率（%）=ΔA0，294-ΔA1，294ΔA0 ，294×100]

式中，[ΔA0，294]為未加入抑制劑，294 nm處的吸光度值；[ΔA1，294]為加入抑制劑，294 nm處的吸光度值。

1.3 數據分析

本文采用OriginPro 8.5軟件對相關試驗數據進行線性或以非線性回歸法擬合。

2 結果與分析

2.1 槐米提取物對體外XOD活性抑制影響

為進一步研究傳統(tǒng)中藥飲片槐米中潛在活性成分在高尿酸血癥治療方面的藥理藥效和作用機制，試驗選取了臨床上有效的藥物靶點XOD作為靶-藥結合研究對象，并構建體外XOD促動力學模型。同時，利用體外XOD促動力學模型評價槐米提取物A對體外XOD生物活性抑制作用，探討其量效關系。如圖1（A）所示，當槐米提取物A藥劑濃度在10～90 μg/mL，在相同藥劑濃度條件下，體外XOD活性抑制作用相比對照藥劑All，呈現(xiàn)出較大差異性。為此，試驗進一步考察了槐米提取物A在較高藥劑濃度范圍內對體外XOD生物活性的影響，試驗結果顯示，隨著藥劑濃度從100 μg/mL遞增至700 μg/mL，槐米提取物A對體外XOD活性抑制率與其濃度呈現(xiàn)出良好的依賴性，且最大抑制率為36.68%，但仍小于對照藥劑All對XOD活性抑制作用，如圖1（B）所示。由此說明，槐米提取物A中可能具有潛在生物活性物質，可有效抑制XOD生物活性。

2.2 潛在活性成分評價及構效關系分析

蕓香葉苷、槲皮素、白樺脂醇、槐花二醇、槐花米甲、乙、丙素和槐花皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等是槐米中的已知化學成分，由于槐花二醇以及槐花米甲、乙、丙素和槐花皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等成分難以分離獲得。為進一步揭示槐米提取物A中可能存在的潛在活性成分，試驗選取了易溶于乙醇的化學成分蕓香葉苷、槲皮素和白樺脂醇為研究對象，分子結構如圖2所示。

蕓香葉苷又名蘆丁，為天然黃酮苷類化合物，是黃酮醇與二元糖以糖苷鍵合而成的天然化合物，待測樣品蕓香葉苷在藥劑濃度為62.5～750.0 μmol/L，可觀察到蕓香葉苷對體外XOD活性抑制作用不明顯，與藥劑濃度無相關依賴性，且抑制率低于5%，如圖3所示。該試驗結果與槐米提取物A對體外XOD活性抑制作用相差較大。

天然白樺脂醇屬于五環(huán)三萜類化合物，擁有多個手性碳，是萜類手性化合物的代表之一。為探究槐米中化學成分白樺脂醇對XOD活性作用的影響，試驗采用體外XOD促動力學模型對天然白樺脂醇進行生物活性評價及量效關系分析。試驗結果顯示，隨著白樺脂醇藥劑濃度在62.5～625.0 μmol/L遞增，UV光譜圖中呈現(xiàn)的294 nm處吸光度值變化影響較為明顯，并與藥劑濃度呈一定的線性關系，但最大抑制率也未超過30%，仍然低于在相同條件下槐米提取物A對體外XOD活性抑制效果，如圖4所示。由此說明，天然白樺脂醇是槐米提取物A中的有效抑制成分之一。

針對槐米提取物中黃酮醇類化合物槲皮素，試驗采用與上述相同的體外活性評價方法，對天然槲皮素成分進行體外XOD活性抑制評估。結果表明，在不同濃度的待測藥劑作用下，槲皮素對體外XOD活性作用表現(xiàn)出良好的抑制效果，特別是在藥劑濃度為62.5～250.0 μmol/L內，槲皮素對體外XOD活性抑制作用與藥劑濃度可呈良好的依賴性，隨著藥劑濃度的繼續(xù)增加，其對應的抑制率可明顯地觀察到趨近于最大值（61.64%，IC50值為203.6 μmol/L），如圖5所示，由此說明，槲皮素可能為槐米提取物A中主要的有效抑制活性成分。

2.3 槐米煎煮過程對XOD活性抑制的影響

從上述試驗結果可知，槐米提取物A中可能性有效抑制活性成分分別為槲皮素和白樺脂醇。槲皮素是一種富電子體系的多酚類化合物，可充當較強的天然還原劑，與天然成分蕓香葉苷分子結構比對分析可知。蕓香葉苷是一個槲皮素和二元糖以糖苷鍵形式鏈接組成的黃酮苷類化合物，從化學反應角度分析可知，蕓香葉苷中的糖苷鍵在熱—酸性環(huán)境中易發(fā)生斷鍵，形成槲皮素和二元糖。此外，相關研究發(fā)現(xiàn)，蕓香葉苷成分在槐米中的含量較高，約占30%，是槐米中的主要化學成分之一。由此可知，如果蕓香葉苷成分在一定的條件下轉化為槲皮素，在藥理方面可能會有效提升槐米提取物A對XOD活性的藥用價值。中藥藥劑制備方式熱水煎煮過程可能會促使槐米中的主要成分蕓香葉苷分子結構水解，生成槲皮素和糖元。為此，試驗稱取一定量的中藥飲片槐米，并模擬其水煎煮過程，煎煮3 h后，過濾，湯劑經冷凍干燥，可獲得待測樣品B（槐米水提物）。隨后，試驗將待測樣品B在體外XOD促動力學模型中進行XOD活性測試，結果表明，如圖6（A）所示，在藥劑濃度100～700 μg/mL內，待測樣品B對XOD活性的抑制率，相比槐米提取物A而言表現(xiàn)出一定的增效作用。為了進一步驗證試驗提出的觀點，試驗稱取一定量的蕓香葉苷配制成不同濃度的水溶液，回流3 h，冷卻至室溫，并采用體外XOD促動力學模型對其待測樣品B進行XOD活性測試，試驗結果與蕓香葉苷（未經回流處理）的XOD活性作用相比，回流后蕓香葉苷溶液與相同濃度未經回流處理的蕓香葉苷溶液對體外XOD活性抑制作用的差異不明顯，且未能表現(xiàn)出較強的增效作用，如圖6（A）所示，這說明熱水回流過程對蕓香葉苷分子結構影響不大，可能未造成其糖苷鍵的水解。試驗再次考察了不同濃度的蕓香葉苷在弱酸性（檸檬酸，pH值5.0～6.0）溶液中回流過程的行為變化，經3 h回流后，獲得相對應的待測樣品C。在對待測樣品C活性評價方面，待測樣品C對體外XOD活性抑制作用與蕓香葉苷（回流或為回流處理）對比呈現(xiàn)出較好的正面響應值，且十分明顯，如圖6（B）所示，這說明弱酸性熱水條件有助于蕓香葉苷分子結構中的糖苷鍵水解。

槐米經水煎煮后對XOD活性抑制表現(xiàn)出的一定程度增效作用，其原因可能為槐米中存在酸性成分，在熱水煎煮過程中促使蕓香葉苷分子結構中的糖苷鍵水解，轉化為槲皮素，從而提高了待測樣品B中槲皮素含量的占比，表現(xiàn)出較好的XOD活性抑制作用。

2.4 酸性蠕動作用過程對蕓香葉苷的影響

傳統(tǒng)中藥飲片服用方式以水煮泡為主，其湯汁經胃腸進入血液循環(huán)，作用于病灶。人體胃腸道酸性蠕動作用過程往往是藥劑中有效成分吸收的主要途徑之一。因此，試驗采用恒溫水浴溶出儀，模擬蕓香葉苷在酸性胃液蠕動作用下的變化，如圖7所示，即取一定量的蕓香葉苷置于pH值2.0～3.0的酸性溶液中，恒溫35 ℃，振蕩作用不同時間，并配制成藥劑濃度為750 μmol/L（以蕓香葉苷濃度為準）的待測樣品D。當蕓香葉苷在酸性溶液中振蕩作用2 h時，其抑制率略高于相同藥劑濃度（750 μmol/L）的蕓香葉苷（未參加酸性溶液中振蕩作用）；隨著酸性溶液中振蕩作用時間延長，其對應的抑制率為遞增趨勢；在作用時間為24 h時，其對應抑制率可達到40.6%，但仍低于相同藥劑濃度的槲皮素（750 μmol/L，抑制率61.2%），說明蕓香葉苷在酸性溶液中振蕩作用24 h時可能未完全轉化為槲皮素。

以上試驗結果驗證了槐米中主要化學成分蕓香葉苷在人體或動物胃腸道作用過程可能會被分解為具有相對高效的XOD活性抑制成分槲皮素，從而提升了槐米在高尿酸血癥方面應用的可行性。該結果與有關槐米提取物對高尿酸血癥小鼠降尿酸作用的有效性研究一致，進一步說明中藥飲片槐米治療高尿酸血癥的潛在活性成分可能與槲皮素有關。

3 結論

槐米作為傳統(tǒng)的中藥飲片之一，具有良好的醫(yī)用價值。天然蕓香葉苷、槲皮素及白樺脂醇等成分為槐米中已知化學成分，其中蕓香葉苷作為槐米中的主要化學成分，且含量比重較大，是槐米中的重要潛在活性成分。本文利用體外XOD促動力學模型，研究槐米提取物及其潛在活性成分蕓香葉苷、槲皮素和白樺脂醇對XOD活性抑制作用及量效關系，明確了槲皮素對XOD活性作用影響較大。試驗進一步模擬了槐米中主要化學成分蕓香葉苷在中藥飲片水煮泡或酸性胃液蠕動作用對XOD活性抑制的影響，揭示了槐米醇提物對高尿酸血癥小鼠降尿酸作用的機制，為相關研究提供參考。

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（責編：王 菁）

作者簡介 楊長遠（1996—），男，貴州天柱人，從事制藥工程研究。

收稿日期 2024-01-30