黑茶水提物通過介導(dǎo)AMPK/mTOR信號通路調(diào)控自噬干預(yù)非酒精性脂肪肝的機制研究

摘要：為探討安化黑茶水提物對高脂高糖（HFHS）飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝病（NAFLD）小鼠調(diào)控自噬改善脂肪變性的作用機制，將雄性C57BL/6J小鼠分為正常組、模型組、西藥組（10 mg·kg-1）、黑茶低劑量組（0.75 g·kg-1）、中劑量組（1.5 g·kg-1）、高劑量組（3.0 g·kg-1）。采用HFHS飲食誘導(dǎo)小鼠NAFLD模型，造模的同時灌胃給藥10周；試驗結(jié)束后檢測小鼠的肝指數(shù)、血脂、肝功能、肝臟病理指標(biāo)、自噬指標(biāo)及自噬相關(guān)信號通路表達水平。結(jié)果表明，與正常組相比，模型組小鼠肝指數(shù)和總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）含量顯著升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量明顯降低；小鼠肝臟出現(xiàn)了脂肪變性的跡象，伴有大量大小不一的脂滴；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（LC3B）、Bcl-2相互作用蛋白1（Beclin1）、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶/腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK/AMPK）表達明顯降低，隔離體蛋白1（p62）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR/mTOR）表達顯著上升。與模型組相比，灌胃黑茶水提物可降低NAFLD小鼠肝指數(shù)和血清CHO、TG、LDL-C、AST、ALT水平，以及p62、p-mTOR/mTOR蛋白表達水平，升高血清HDL-C含量，以及LC3B、Beclin1、p-AMPK/AMPK蛋白表達水平；組織染色結(jié)果和透射電鏡觀察均表明肝臟的病理狀態(tài)得到了改善。綜上所述，黑茶水提物可能通過激活A(yù)MPK/mTOR信號通路調(diào)控自噬，減輕小鼠肝臟脂肪變性，從而改善NAFLD。

關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪肝??；黑茶；AMPK/mTOR；自噬

中圖分類號：S571.1；R972+.6 " " " " " " " 文獻標(biāo)識碼：A " " " " " " "文章編號：1000-369X（2024）02-329-12

Mechanism of Dark Tea Water Extract in Regulating Autophagy in Non-Alcoholic Fatty Liver via the AMPK/mTOR Signaling Pathway

LI Linli1， XIA Xuting1， SHI Min1， GE Jun1， MAO Caiwei1， YU Changhong2*， LIU Fulin1*

1. Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410208， China;

2. The First Chinese Medicine Hospital of Changde， Changde 415000， China

Abstract： This study aimed to investigate the intricate mechanisms underlying the modulatory effects of Anhua dark tea on autophagy to ameliorate steatosis induced by a high-fat and high-sucrose diet （HFHS） in mice with non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）. Male C57BL/6J mice were divided into different groups， including a normal group， a model group， a Western medicine group （10 mg·kg-1）， and various doses of dark tea groups （0.75， 1.5， 3.0 g·kg-1）. The therapeutic regimen was administered concurrently with the modeling process for a duration of 10 weeks using the HFHS-induced NAFLD model. At the end of the experiment， liver indices， blood lipids， liver function， liver pathology indicators， autophagy markers， and expression levels of key genes in the autophagy-related signaling pathway were assessed. Comparative analyses with the normal group revealed significant increases in liver index and levels of serum cholesterol （CHO）， triglycerides （TG）， low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C）， aspartate aminotransferase （AST）， and alanine aminotransferase （ALT）， as well as a substantial reduction in high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C） levels in the model group. The liver of the mice exhibits signs of "steatosis， characterized by an abundance of lipid droplets of different sizes. Protein expression analysis reveals a marked decrease in the levels of microtubule-associated protein light-chain-3B （LC3B）， Bcl-2-interacting coiled-coil protein 1 （Beclin1）， and phosphorylated adenosine monophosphate-activated protein kinase/adenosine monophosphate-activated protein kinase （p-AMPK/AMPK）. Conversely， there was a significant increase in the levels of sequestosome-1 （p62） and phosphorylated mammalian target of rapamycin/mammalian target of rapamycin （p-mTOR/mTOR）. Compared to the model group， gavage with dark tea decreased the liver index， serum levels of CHO， TG， LDL-C， AST， ALT， p62， and p-mTOR/mTOR in NAFLD mice， and increased serum HDL-C， along with LC3B， Beclin1， and p-AMPK/AMPK protein levels. The improvements were confirmed by tissue staining results and observations using transmission electron microscopy. In summary， our findings suggest that dark tea， by activating the AMPK/mTOR signaling pathway， may regulate autophagy， thereby alleviating hepatic steatosis and improving non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）.

Keywords： nonalcoholic fatty liver disease， dark tea， AMPK/mTOR， autophagy

非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪異常蓄積為主要特征的代謝性疾病，若不及時采取有效治療，不僅容易引發(fā)肝臟相關(guān)疾病，還可能會導(dǎo)致心血管問題和慢性腎臟疾病等嚴(yán)重并發(fā)癥[1-3]。NALFD與生活方式、遺傳易感性、脂肪組織功能障礙、胰島素抵抗、先天免疫調(diào)節(jié)異常，以及腸道微生物群紊亂等相關(guān)[4-6]，但具體發(fā)作的機制尚不明確。自噬是一種由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞分解代謝過程，對維持肝臟的細(xì)胞和代謝穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，因此調(diào)節(jié)自噬可能成為治療NAFLD和其他肝臟疾病的潛在策略[7]。腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）作為自噬啟動因子，可通過激活自噬清除脂滴[8]，還可通過抑制脂肪酸合成和促進脂肪酸氧化調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。研究表明，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）是治療NAFLD的潛在新靶點，在NAFLD的發(fā)生和發(fā)展中，mTOR通路由于過度活化導(dǎo)致自噬水平下降，使得脂質(zhì)在肝臟內(nèi)過度沉積，從而引發(fā)NAFLD[9-10]。因此，通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路，可以促進自噬降解脂質(zhì)，提高能量利用效率，從而對抗NAFLD引起的代謝紊亂。

黑茶作為一種經(jīng)過特殊發(fā)酵處理的天然飲品，富含生物活性成分。現(xiàn)代研究表明，茶葉具有良好的降脂作用。Zhou等[11]研究發(fā)現(xiàn)，茶葉中的表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯（EGCG）能夠通過促進自噬體的形成、增加溶酶體酸化，以及刺激肝細(xì)胞和體內(nèi)的自噬通量來提高肝自噬水平，減少肝脂肪變性。其作用機制可能是通過增加自噬的主要調(diào)節(jié)因子AMPK的磷酸化，刺激肝自噬，從而增加脂質(zhì)清除率，減少內(nèi)臟肥胖[12]。此外，EGCG還能通過ROS/MAPK通路減少細(xì)胞凋亡、增加自噬，緩解高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD[13]。然而，EGCG多存在于綠茶多酚中，黑茶中的含量較少。對于黑茶是否也能通過調(diào)節(jié)自噬機制改善高脂高糖（High-fat high-sucrose，HFHS）飲食誘發(fā)的NAFLD仍有待明晰。因此，本研究以AMPK/mTOR自噬通路為切入點，采用HFHS飼料喂養(yǎng)建立NAFLD小鼠模型，旨在探討黑茶對NAFLD小鼠的防治作用，為促進黑茶功效應(yīng)用提供理論依據(jù)和試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠60只，體質(zhì)量為（20±2） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質(zhì)量合格證：430727231100273457。實驗通過了湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審查，動物倫理批準(zhǔn)號為LLBH-202210240005，實驗單位使用許可證號為SYXK（湘）2019-0009。

1.2 材料與試劑

供試茶葉為2015年天茯茶（湖南省白沙溪茶廠股份有限公司，規(guī)格為1 kg，生產(chǎn)許可證編號為SC11443092300115，原料為天尖茶一級嫩葉），茶磚磚面平整，色澤黑褐，金花茂盛。取適量茶葉在蒸餾水中浸泡30 min，大火煮開后改小火煮一段時間，冷卻后過濾，收集濾液，將濾渣加入蒸餾水再次煮沸過濾，合并兩次濾液，小火濃縮至所需體積后離心，取上清液濃縮為0.3 g·mL-1的茶液，用紗布過濾后存放于離心管中低溫保存，整個過程保持無菌操作。

阿托伐他汀藥片購自福建東瑞制藥有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、總膽固醇（Cholesterol，CHO）、高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測定試劑盒購自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（Microtubule-associated-protein light-chain-3B，LC3B）抗體購自英國Abcam公司；磷酸化AMPK（Phosphorylated-AMPK，p-AMPK）抗體購自美國Affinity Biosciences公司；隔離體蛋白1（Sequestosome-1，p62）、Bcl-2相互作用蛋白1（Bcl-2 interacting coiled-coil protein-1，Beclin1）、磷酸化mTOR（Phosphorylated-mTOR，p-mTOR）、AMPK、mTOR抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；油紅O染色液購自武漢賽維爾生物科技有限公司；HE染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；無蛋白快速封閉液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、羊抗兔/羊抗鼠二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。高脂高糖飼料（基礎(chǔ)飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鈉）購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

1.3 主要儀器

全自動生化分析儀，邁瑞醫(yī)療國際有限公司；透射電子顯微鏡，日本HITACHI公司；鉆石切片機，湖南遠(yuǎn)湘生物科技有限公司；金屬浴鍋，杭州米歐儀器有限公司；恒溫箱，日本三洋電機公司；高速冷凍離心機，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司；電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；超純水儀，美國ICON公司。

1.4 動物分組、造模與預(yù)防性給藥

經(jīng)過1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，60只C57BL/6雄性小鼠隨機分配為正常組（普通飼料飼養(yǎng)）、模型組（HFHS）、西藥組（HFHS+阿托伐他?。?，以及黑茶低、中、高劑量組（HFHS+黑茶濃縮液），每組10只。成功建立NAFLD模型的標(biāo)準(zhǔn)是觀察實驗小鼠肝臟組織中的多項病理學(xué)特征，包括大小不一的脂滴、氣球樣變、細(xì)胞腫脹及炎癥細(xì)胞浸潤[14]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)體重動物換算系數(shù)法計算劑量[15]，西藥組劑量為10 mg·kg-1·d-1，黑茶低、中、高劑量分別為0.75、1.5、3.0 g·kg-1·d-1。黑茶劑量分別相當(dāng)于人體推薦劑量的50%、1倍和2倍。為了確保試驗結(jié)果準(zhǔn)確，本研究采用灌胃方式，正常組和模型組則分別灌胃等體積的蒸餾水。每日灌胃體積為10 mL·kg-1，且根據(jù)定期測量的體重進行調(diào)整，連續(xù)灌胃10周。

1.5 標(biāo)本收集與處理

處理結(jié)束后，采用氯胺酮（80 mg·kg-1）聯(lián)和賽拉嗪（5 mg·kg-1）腹腔注射麻醉小鼠、取血、離心后置于﹣80 ℃保存，用于肝功能、血脂等檢測；再將小鼠脫頸處死，迅速取下肝臟稱重、漂洗，將一部分肝臟小葉置于4%多聚甲醛中固定，用于HE染色、油紅O染色和免疫組織化學(xué)染色（Immunohistochemical staining，IHC）檢測；用刀片切取1 mm×2 mm

×3 mm薄片狀肝組織放于電鏡液中室溫避光固定2 h后，置于4 ℃冰箱保存，用于電鏡檢測；其余肝組織放于凍存管中干冰冷凍后存于﹣80 ℃冰箱以備蛋白免疫印跡檢測。

由于課題經(jīng)費有限，在進行各項指標(biāo)檢測時，為確保試驗結(jié)果的科學(xué)性，根據(jù)體重參數(shù)對每組小鼠進行分層，以保持各組間的同質(zhì)性；使用Excel軟件生成的隨機數(shù)序列將小鼠分配到不同的試驗檢測中；為盡量減少偏差，不同研究人員執(zhí)行隨機化與數(shù)據(jù)檢測分析。

1.6 肝指數(shù)和血清生化檢測

精確稱量小鼠及其肝臟的濕質(zhì)量，計算肝指數(shù)（肝指數(shù)=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。

血清生化檢測：將小鼠血液4 ℃靜置2 h，12 000 r·m-1離心15 min，取上層血清，用于測量轉(zhuǎn)氨酶及血脂各項指標(biāo)。根據(jù)各試劑盒說明書檢測血清CHO、TG、HDL-C、LDL-C、AST和ALT的含量。

1.7 組織病理分析肝臟脂質(zhì)蓄積

HE染色：將保存于4%多聚甲醛中的肝臟組織取出，進行脫水、包埋、切片、染色、封片，觀察結(jié)果。

油紅O染色：將肝臟組織于4%多聚甲醛中固定24 h后，配制油紅O工作液，將肝組織于冷凍切片機上切成8 μm左右的薄片后進行染色、分化、洗滌、封片，觀察結(jié)果。

1.8 IHC觀測自噬指標(biāo)

將預(yù)制好的石蠟切片脫蠟、滅活、抗原修復(fù)、封閉、孵育一抗（LC3B、Beclin1、p62抗體），4 ℃過夜，二抗孵育，二氨基聯(lián)苯胺顯色，顯微鏡下觀察顯色情況。組織上出現(xiàn)棕黃色即為陽性。

1.9 透射電鏡（TEM）觀察肝臟自噬體和自噬溶酶體

肝臟組織先用電鏡固定液4 ℃固定，再用OsO4·PB室溫固定、漂洗、脫水、滲透、包埋、切片、染色、TEM成像分析。

1.10 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測

取﹣80 ℃保存的肝臟組織，每組隨機選4只，分別用眼科剪取0.1 g組織用PBS洗滌3次后研磨、裂解、離心、金屬浴、測定蛋白濃度；將提取的蛋白在5%與12% SDS-PAGE凝膠上分離，并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，快速封閉液封閉，4 ℃孵育一抗過夜，37 ℃孵育對應(yīng)二抗，再使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進行顯影；用同一張膜上Beta-actin灰度值將不同蛋白表達水平標(biāo)準(zhǔn)化，Image J軟件灰度值分析。試驗重復(fù)4次。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用軟件GraphPad prism 9.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，通過單因素方差分析（One-way ANOVA），數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±SD）表示，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠指數(shù)變化

與正常組相比，模型組小鼠肝指數(shù)顯著增加（Plt;0.05）；與模型組相比，西藥組、黑茶低、中、高劑量組小鼠肝指數(shù)均顯著降低（Plt;0.05），其中高劑量組降低最多（圖1A）。

2.2 小鼠血液中轉(zhuǎn)氨酶和脂質(zhì)水平變化

由圖1可知，與正常組相比，模型組小鼠血清中肝功能（ALT、AST）和血脂（CHO、TG、LDL-C）含量顯著升高（Plt;0.01），HDL-C含量顯著降低（Plt;0.01）；與模型組相比，各用藥組ALT、AST、CHO、TG、LDL-C均顯著降低（Plt;0.05），其中高劑量組降低最為顯著（Plt;0.01）；西藥組ALT、AST、TG、CHO、LDL-C水平均高于高劑量組；各用藥組HDL-C含量較模型組均顯著升高（Plt;0.01），其中高劑量組HDL-C水平最高。

2.3 小鼠肝臟的病理學(xué)改變

HE染色結(jié)果顯示（圖2），在正常組的小鼠肝臟組織中，鏡下結(jié)構(gòu)呈正常狀態(tài)，肝細(xì)胞大小均勻，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰。而在模型組小鼠肝臟中，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)混亂，存在大量大小不一

的脂肪空泡，肝索排列無序，肝血竇狹窄或完全消失。然而，在高劑量處理的小鼠肝臟中，脂肪空泡顯著減少，細(xì)胞排列更加有序，形態(tài)結(jié)構(gòu)更加清晰。

2.4 小鼠肝臟中脂質(zhì)沉積水平變化

油紅O染色顯示（圖3），正常組小鼠肝臟中未見明顯紅色的脂滴，可見清晰的藍(lán)色細(xì)胞核；而模型組小鼠肝臟可見大量的紅色脂滴，細(xì)胞核不明顯。黑茶干預(yù)后脂滴數(shù)減少，其中黑茶高劑量組較模型組相比，紅色脂滴明顯減少，細(xì)胞核較為清晰。

2.5 小鼠肝臟LC3B、p62、Beclin1蛋白表達情況

由圖4可知，正常組小鼠肝組織p62、LC3B、Beclin1表達較低；與正常組相比，模型組小鼠肝組織LC3B、Beclin1無明顯陽性表達，p62表達顯著增加（P＜0.05）；與模型組

相比，各用藥組小鼠肝組織LC3B、Beclin1表達增加，p62表達顯著降低（P＜0.05），其中高劑量組小鼠改變最為明顯（P＜0.01）。

2.6 小鼠自噬體和自噬溶酶體的變化

正常組小鼠肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)完好，胞內(nèi)脂滴數(shù)量較少，可見自噬泡、自噬小體、自噬溶酶體；模型組胞質(zhì)稀疏、腫脹，周圍的自噬空泡數(shù)量顯著減少，脂滴數(shù)量明顯增多，并出現(xiàn)脂滴融合；各用藥組較模型組呈現(xiàn)自噬空泡增多，脂滴數(shù)量減少等不同程度的好轉(zhuǎn)，并可見少量自噬小體和自噬溶酶體（圖5）。

2.7 小鼠肝臟自噬水平的變化

Western blot結(jié)果顯示（圖6），與正常組小鼠相比，模型組小鼠肝臟組織中LC3B和Beclin1等自噬相關(guān)蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），p62表達水平顯著升高（Plt;0.01）。各用藥組與模型組相比較LC3B和Beclin1蛋白表達水平明顯升高（Plt;0.01），p62表達水平明顯降低（P＜0.05），其中黑茶高劑量組降低最為明顯（Plt;0.01）。

2.8 小鼠肝臟AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR水平的變化

Western blot結(jié)果顯示（圖7），與正常組小鼠相比，模型組小鼠肝臟中p-AMPK蛋白表達水平降低（Plt;0.05），p-mTOR蛋白表達水平升高（Plt;0.05）。各用藥組與模型組相比p-AMPK蛋白表達水平增加，p-mTOR蛋白表達水平降低，其中高劑量組變化最為明顯（Plt;0.01）。

3 討論

NAFLD是全球最常見的肝臟疾病之一，近十億人受其影響，且患病率持續(xù)上升[16]。迄今為止，尚無獲得美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的有效藥物或治療方法用于NAFLD[17]。一些常見的替代藥物包括維生素E、利拉魯肽、吡格列酮和己酮可可堿等目前被用于NAFLD治療。然而，這些化學(xué)藥物具有潛在的毒副作用，患者長期使用會導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性，甚至可能加重病情[18]。因此，從天然產(chǎn)品中尋找高效、低毒的緩解NAFLD的有效候選藥物已迫在眉睫。

黑茶作為中國傳統(tǒng)茶類之一，加工工藝復(fù)雜。在加工過程中，通過微生物的發(fā)酵作用，茶葉中的兒茶素及其沒食子酸酯衍生物被氧化成復(fù)雜的酚類茶色素，包括茶黃素（TF）、茶紅素（TR）和茶褐素（TB）[19]。其中，TB是黑茶的特征成分，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減緩體重增加、減輕糖尿病、減輕NAFLD和預(yù)防腫瘤等多種健康促進作用[20]。Huang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，TB可以增加回腸結(jié)合膽汁酸的水平，進而抑制腸道FXR-FGF1信號通路，加速肝臟膽固醇的排泄，并減少脂肪生成；亦或通過抑制胰脂肪酶和膽固醇酯酶的活性降低脂質(zhì)水平，同時抑制腸道脂質(zhì)消化和吸收[22]。研究發(fā)現(xiàn)，從各類黑茶中提取的TB可降低高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的肥胖小鼠的體重增加，使脂質(zhì)紊亂正常化，并改善葡萄糖耐量和胰島素敏感性[23-24]。此外，黑茶中的優(yōu)勢菌冠突散囊菌可以增加小鼠腸道中產(chǎn)生乙酸和丁酸的細(xì)菌總量，從而緩解肥胖[25]。黑茶黃烷醇、黃酮?；占捌溲苌镆部梢云鸬筋A(yù)防高脂血癥的作用[19]。

研究發(fā)現(xiàn)，黑茶中TB和多糖含量高于其他五大茶類，在HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠中，TB和多糖組合在降低肝脂質(zhì)水平和減輕NAFLD表型方面比單獨使用TB或多糖顯示出更強的作用，表明它們對減輕NAFLD具有協(xié)同作用[26]。因此，針對黑茶在防治NAFLD方面發(fā)揮的作用，黑茶TB和多糖的復(fù)合作用可能優(yōu)于各自單獨的效果。張文將等[27-28]研究發(fā)現(xiàn)，黑茶可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-kB通路，同時抑制肝脂合成和減少肝臟氧化應(yīng)激損傷，實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)早期NAFLD的效果。此外，黑茶還通過抑制HMGCR、SCD-1和PPAR-γ的mRNA表達來減少脂類物質(zhì)合成，并通過抗氧化作用減少氧化損傷和保護肝細(xì)胞，從而達到防治NAFLD的效果[29]。與上述結(jié)果相似，本研究結(jié)果表明，黑茶的應(yīng)用能有效恢復(fù)NAFLD小鼠的血脂調(diào)節(jié)能力，降低小鼠肝臟脂肪組織質(zhì)量增加量，改善肝索紊亂和肝細(xì)胞腫脹等病理變化，并通過調(diào)節(jié)AST和ALT水平來改善肝臟損傷。但是，目前黑茶對NAFLD預(yù)防作用的研究主要集中在抗炎、抗氧化、改善腸道菌群進而抑制肝脂合成等方面，缺乏對自噬相關(guān)機制的探討與分析。

自噬是一種通過溶酶體介導(dǎo)，吞噬并降解細(xì)胞內(nèi)受損的或衰老的細(xì)胞器的再循環(huán)過程，是細(xì)胞加速新陳代謝的重要手段，在真核細(xì)胞中普遍存在，在維持肝臟代謝穩(wěn)態(tài)中具有至關(guān)重要的作用，自噬流的恢復(fù)可以延緩NAFLD進展[30-32]。研究表明，激活自噬可以降低HFD小鼠肝臟中脂質(zhì)的變性和炎癥程度；相反，如果自噬受到抑制，將導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累增加[33-34]。因此，通過激活細(xì)胞內(nèi)的自噬機制，對于緩解和預(yù)防肝臟脂質(zhì)變性具有重要的生物學(xué)作用。

AMPK/mTOR信號通路是自噬的關(guān)鍵調(diào)控途徑。在這個信號通路中，AMPK充當(dāng)細(xì)胞能量傳感器和肝臟脂質(zhì)代謝的重要調(diào)控因子，通過抑制脂肪酸合成和促進脂肪酸氧化來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[35]。此外，AMPK的活化還能減少在肝臟中導(dǎo)致脂質(zhì)沉積和甘油三酯積累的酶活性，從而減輕NAFLD的病情[35]。AMPK是與肝臟中的正性脂質(zhì)調(diào)節(jié)相關(guān)的主要能量代謝開關(guān)，同時也是NAFLD的治療靶標(biāo)，在自噬調(diào)控中起到正調(diào)節(jié)作用[36-37]。另一方面，mTOR是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、存活、代謝和免疫的蛋白激酶，主要以mTORC1和mTORC2的2種復(fù)合物形式存在[10]。其中，mTORC1在脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用，它介導(dǎo)的信號通路有助于肝臟脂肪生成，同時抑制脂肪吞噬，因此在自噬調(diào)控中起到負(fù)調(diào)節(jié)作用[38]。故而，研究AMPK/mTOR信號通路對自噬的調(diào)節(jié)機制對深入了解代謝性疾病具有重要意義。在自噬過程中，LC3B-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3B-Ⅱ標(biāo)志著自噬體的形成[39]；同時，p62作為自噬的降解底物，在自噬障礙時會在細(xì)胞質(zhì)中積累，因此其表達水平與自噬活性呈負(fù)相關(guān)[40]。此外，Beclin1作為自噬啟動的核心蛋白，在自噬體形成初始階段起到了重要作用，增加Beclin1表達水平的化合物有望增加細(xì)胞自噬，故其表達水平與自噬活性呈正相關(guān)[41-42]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠的肝臟中LC3B、Beclin1和p-AMPK蛋白的表達水平相較于正常組顯著下降，而p62和p-mTOR蛋白的表達水平顯著上升，自噬泡明顯減少，這表明模型組小鼠的自噬水平受到抑制。與模型組相比，黑茶干預(yù)能夠上調(diào)LC3B、Beclin1和p-AMPK蛋白的表達水平，同時下調(diào)p62和p-mTOR蛋白的表達水平，這表明黑茶可能通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路在體內(nèi)誘導(dǎo)自噬，從而減輕肝臟脂肪變性。

綜上所述，黑茶可能通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR途徑，促進自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B和Beclin1蛋白的表達，抑制p62蛋白的表達，增強NAFLD模型小鼠肝臟的自噬水平，減輕肝臟損傷，改善脂肪變性，從而起到保護肝臟的作用。

此外，本研究仍存在一些局限性和不足之處。例如，關(guān)于自噬再激活與肝脂質(zhì)變性減少之間的關(guān)聯(lián)，數(shù)據(jù)支持尚不充分；未使用AMPK和mTOR的特異性抑制劑進行干預(yù)；未能排除黑茶在炎癥細(xì)胞等其他非肝細(xì)胞中的直接作用等。今后將繼續(xù)開展深入研究，探究黑茶治療NAFLD的有效性及其作用機理。

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