全基因組測(cè)序在食源性沙門(mén)氏菌監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

汪憶夢(mèng) 于明明

基金項(xiàng)目：濰坊市衛(wèi)生計(jì)生委科研項(xiàng)目計(jì)劃（WFWSJK-2021-143，WFWSJK-2022-236）。

作者簡(jiǎn)介：汪憶夢(mèng)（1989—），女，山東東營(yíng)人，碩士，主管技師。研究方向：食品微生物和病原微生物檢驗(yàn)。

通信作者：于明明（1983—），女，山東濰坊人，碩士，副主任技師。研究方向：食品和病原微生物檢驗(yàn)。E-mail： 20932641@qq.com。

摘 要：沙門(mén)氏菌是重要的食源性致病菌，給社會(huì)帶來(lái)了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)影響。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，全基因組序列分析在沙門(mén)氏菌的監(jiān)測(cè)中顯示出了極大的發(fā)展?jié)摿蛢r(jià)值。本文綜述了全基因組序列分析在沙門(mén)氏菌血清型鑒定、分子分型以及耐藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用前景。利用高通量測(cè)序技術(shù)與沙門(mén)氏菌抗原相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行血清型的預(yù)測(cè)，在血清凝集方法難以確定血清型的情況下發(fā)揮重要作用。與傳統(tǒng)的細(xì)菌分子分型方法相比，全基因組測(cè)序技術(shù)速度更快、分辨率更高，且易于實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室間比較，在公共衛(wèi)生事件中可用于快速識(shí)別病原體并進(jìn)行溯源分析。利用耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)從基因水平上發(fā)現(xiàn)其攜帶的耐藥基因，結(jié)合耐藥表型進(jìn)一步探索其耐藥機(jī)制。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息技術(shù)的不斷成熟，更多的共享數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)不斷出現(xiàn)，全基因組序列分析將應(yīng)用于更廣泛的領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞：全基因組測(cè)序；食源性沙門(mén)氏菌；血清分型；分子分型；抗生素耐藥

Application of Whole Genome Sequencing for the Monitoring Foodborne Salmonella

WANG Yimeng， YU Mingming*

（Weifang Disease Control and Prevention Center Microbiology Laboratory， Weifang 261061， China）

Abstract： Salmonella is an important food-borne pathogen that is associated with serious public health and economic implications. With the development of high-throughput sequencing technology， Whole genome sequencing has shown great potential and value in the surveillance of Salmonella. The review strives to discuss the serotype identification， molecular typing and antimicrobial resistance profiles of Salmonella in Whole genome sequence and looks forward to its future. The prediction of serotypes using high-throughput sequencing technology compared with Salmonella antigen-related gene databases plays an important role in cases where serotypes are difficult to determine by serum agglutination methods. Whole genome sequencing technology is faster， higher resolution， and easy to achieve inter-laboratory comparisons than traditional bacterial molecular typing methods， and can be used for rapid identification of pathogens and traceability analysis in public health events. The drug resistance gene database is utilized to discover the drug resistance genes they carry at the gene level， and to explore their resistance mechanisms in conjunction with the drug resistance phenotype. With the continuing maturation of high-throughput sequencing and bioinformatics approaches， and the emergence of more shared database platforms， whole genome sequence analysis will be applied to a wider range of fields.

Keywords： whole genome sequence analysis; food-borne Salmonella; serotype; molecular typing; antimicrobial resistance

沙門(mén)氏菌是目前公共衛(wèi)生學(xué)公認(rèn)的人畜共患食源性致病菌，感染力強(qiáng)，血清型復(fù)雜[1]，目前已發(fā)現(xiàn)2 600多種血清型，其中傷寒、副傷寒沙門(mén)氏菌專(zhuān)性感染人類(lèi)，可引起我國(guó)法定傳染病傷寒、副傷寒[2]，其他血清型宿主廣泛，可寄生在禽類(lèi)和畜類(lèi)等肉產(chǎn)品來(lái)源的養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)，也可感染人類(lèi)，引起以發(fā)熱、腹痛、腹瀉等癥狀為主的急性腸胃炎、敗血癥以及其他并發(fā)癥[3]，每年全球有超過(guò)1億例腹瀉病與沙門(mén)氏菌感染有關(guān)，醫(yī)療負(fù)擔(dān)嚴(yán)重[4]。沙門(mén)氏菌腹瀉病與食用了被該菌污染的食物密切相關(guān)，世界各地每年都有大量沙門(mén)氏菌引起的食物中毒和感染的相關(guān)報(bào)道[5-6]，在我國(guó)，70%～80%的細(xì)菌性食物中毒事件是由沙門(mén)氏菌引起的[7]。世界衛(wèi)生組織將沙門(mén)氏菌列為具有中等危害和嚴(yán)重危害的食源性致病菌，是世界各國(guó)重點(diǎn)監(jiān)控的食源性致病菌[8]。

傳統(tǒng)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法是利用沙門(mén)氏菌對(duì)膽鹽、煌綠耐受的特點(diǎn)，將食品或者臨床樣本進(jìn)行選擇性增菌后，在選擇性平板上劃線(xiàn)分離沙門(mén)氏菌，然后利用沙門(mén)氏菌的生化特點(diǎn)進(jìn)行鑒定，該方法需要5～7 d

可分離得到沙門(mén)氏菌菌株。隨著飛行質(zhì)譜、核酸檢測(cè)等新技術(shù)的應(yīng)用，分離周期可縮短為3～5 d。

平板劃線(xiàn)法成本低、用時(shí)長(zhǎng)，可用于風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)、菌株收集、常規(guī)食品等樣本檢測(cè)，也是公共衛(wèi)生事件中得到菌株證據(jù)必不可少的手段，但需要借助其他方法對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行分型、溯源、耐藥等進(jìn)一步的分析。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，將病原菌整個(gè)基因組的核苷酸序列進(jìn)行解讀，獲得更多的遺傳信息變?yōu)榭赡?，在?xì)菌病原學(xué)和流行病學(xué)研究中得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[9]。本文將討論高通量測(cè)序技術(shù)及全基因序列分析在沙門(mén)氏菌監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查中的原理和應(yīng)用，以及遇到的問(wèn)題和挑戰(zhàn)。

1 全基因序列分析在沙門(mén)氏菌血清分型中的應(yīng)用

20世紀(jì)，沙門(mén)氏菌血清分型沿用了世界衛(wèi)生組織國(guó)際沙門(mén)菌協(xié)作和研究中心公布的懷特-考夫

曼-勒密諾表（White-Kauffmann-Le Minor Scheme，WKLM），是基于沙門(mén)氏菌的表面蛋白、莢膜和鞭毛等抗原與特異血清的凝集的分型方法，目前仍是沙門(mén)菌血清分型的金標(biāo)準(zhǔn)，該系統(tǒng)將沙門(mén)氏菌分為46個(gè)

血清群，2 659個(gè)血清型，不同血清型對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物的致病性有所差異[10]。由于沙門(mén)氏菌存在自身抗原變異現(xiàn)象，以及抗原表達(dá)量的高低、操作人員的技術(shù)水平、主觀(guān)判斷都會(huì)影響血清凝集結(jié)果的準(zhǔn)確性，此外商業(yè)化血清種類(lèi)和質(zhì)量的局限性，也導(dǎo)致了少數(shù)無(wú)法凝集確定血清型的現(xiàn)象。如果通過(guò)高通量測(cè)序和拼接獲得沙門(mén)氏菌全基因組序列，便可與已知的沙門(mén)氏菌血清型相關(guān)抗原序列比對(duì)，預(yù)測(cè)沙門(mén)氏菌血清型。隨著生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，ZHANG等[11]公布了沙門(mén)菌抗原相關(guān)基因序列信息并建立了SeqSero數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，目前已更新至2.0版本；YOSHIDA等[12]于2016年建立了SISTR（Salmonella in Silico Typing Resource）數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)；中國(guó)疾控中心傳染病所在已有平臺(tái)的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)優(yōu)化了沙門(mén)菌血清型預(yù)測(cè)軟件SalmonSeroPredicition，用戶(hù)均可提交自己的沙門(mén)氏菌基因組序列到平臺(tái)預(yù)測(cè)血清型[13]。此外，檢索沙門(mén)氏菌基因組序列中的管家基因并在MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，也可進(jìn)行沙門(mén)氏菌血清型預(yù)測(cè)，但由于該方法只比對(duì)了7個(gè)管家基因，且數(shù)據(jù)庫(kù)中ST型和血清型種類(lèi)尚未完善，其精準(zhǔn)程度低于全基因組SNP系統(tǒng)發(fā)育分析，但運(yùn)行速度快，占用計(jì)算機(jī)資源少，可作為輔助手段[14]。陳丹妮等[15]將包含50種血清型的509株沙門(mén)氏菌分別用SISTR、MLS、SalmonSeroPredicition3個(gè)平臺(tái)和傳統(tǒng)的血清凝集方法進(jìn)行結(jié)果比對(duì)，得到三者的準(zhǔn)確率分別為96.67%、93.52%、69.16%；張璐等[16]比較了283株沙門(mén)氏菌，分別用SeqSero2.0和傳統(tǒng)血清凝集方法得到的血清型結(jié)果，符合率為97.6%，同ZHANG等[11]公布的98.7%相近?；谌蚪M序列的沙門(mén)氏菌血清分型具有較高的應(yīng)用價(jià)值，隨著數(shù)據(jù)庫(kù)和生物信息學(xué)手段的完善，將得到更廣泛的應(yīng)用。

2 全基因序列分析在沙門(mén)氏菌分子分型和疾病暴發(fā)事件中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的細(xì)菌分子分型技術(shù)包括脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）、多位點(diǎn)序列分型（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、多位點(diǎn)序列分型（Multilocus Sequence Typing，MLST）、多位點(diǎn)可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)分析（Multiple Locus Variable-number tandem repeat Analysis，MLVA）等，曾是致病菌監(jiān)測(cè)、識(shí)別和溯源的標(biāo)準(zhǔn)方法，目前仍是我國(guó)國(guó)家致病菌識(shí)別網(wǎng)Pulsenet和食源性疾病分子溯源網(wǎng)絡(luò)的主要工具。這些技術(shù)對(duì)高克隆化的菌株分辨力有限，以腸炎沙門(mén)氏菌為例，85%的腸炎沙門(mén)可以歸為5個(gè)PFGE型別，難以精準(zhǔn)分型，且操作過(guò)程煩瑣，檢測(cè)通量低[17]；常規(guī)AFLP、RFLP、MLST僅對(duì)細(xì)菌基因組中的一小部分序列進(jìn)行分析，在疫情暴發(fā)監(jiān)測(cè)中逐漸被基于全基因組的單核苷酸多態(tài)性分型（wgSNP）和基于全基因組的多位點(diǎn)序列分型（wgMLST）所取代。BAKKER等[18]在一起沙門(mén)氏菌疾病暴發(fā)事件中，將PFGE圖譜完全相同的沙門(mén)氏菌分離株，改用wgSNP分析，準(zhǔn)確識(shí)別了暴發(fā)前后的菌株，并檢測(cè)到以往小型暴發(fā)；巴伐利亞州食品安全局利用全基因組測(cè)序分析技術(shù)，追溯了2017—2021年牛群間疫情暴發(fā)的原因，發(fā)現(xiàn)該事件由山區(qū)牧場(chǎng)來(lái)源的沙門(mén)菌引起[19]。wgMLST可對(duì)病原菌基因組上千個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行分析分型，具有比常規(guī)MLST更高的分型能力，可以區(qū)分常規(guī)MLST型別和PFGE帶型完全一致而在流行病學(xué)上不相關(guān)的菌株。與wgSNP相比，wgMLST對(duì)生物信息分析的要求較低，具有快速、標(biāo)準(zhǔn)化、高分辨的特點(diǎn)[20]。

3 全基因序列分析在沙門(mén)氏菌耐藥研究中的應(yīng)用

患病的人和動(dòng)物以及攜帶者都是沙門(mén)氏菌傳染源，抗生素是治療沙門(mén)氏菌病的首選藥物。但在畜牧產(chǎn)業(yè)中抗生素常被作為促生劑濫用，以及臨床治療上不規(guī)范使用抗生素，均造成了沙門(mén)氏菌的耐藥性。沙門(mén)氏菌在抗生素選擇的壓力下，可通過(guò)以下途徑產(chǎn)生耐藥性。①產(chǎn)生滅活酶、鈍化酶或修飾酶，或作用于抗生素使之失活，或修飾結(jié)合位點(diǎn)使藥物無(wú)法作用，如超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶、碳青霉烯酶的產(chǎn)生，導(dǎo)致對(duì)β-內(nèi)酰胺藥物的耐藥性[21]；乙酰轉(zhuǎn)移酶、腺苷轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶等修飾氨基糖苷類(lèi)藥物使之鈍化[22]。②基因突變或缺失導(dǎo)致藥物的作用靶點(diǎn)的改變，使藥物不能透過(guò)細(xì)胞膜，或不能與作用靶點(diǎn)結(jié)合。如GyrA、GyrB基因變異導(dǎo)致沙門(mén)氏菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物敏感性降低[23]。③從整體上改變細(xì)胞膜通透性、主動(dòng)外排機(jī)制、可移動(dòng)的耐藥遺傳元件等，可使沙門(mén)氏菌產(chǎn)生多重耐藥[24]。隨著研究的進(jìn)步，將有更多的耐藥機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)沙門(mén)氏菌的耐藥也是動(dòng)態(tài)變化的，對(duì)其監(jiān)測(cè)具有重要意義。常規(guī)藥敏試驗(yàn)采用的是美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦的肉湯稀釋法，是經(jīng)過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)后基于表型的藥敏方法，在基因水平上，常用PCR方法檢測(cè)耐藥基因，受限于已知的耐藥基因，而通過(guò)全基因組序列分析進(jìn)行耐藥分析，通量大、耗時(shí)少、準(zhǔn)確度高，可從基因組范圍檢索更多耐藥基因，在分子水平上探索耐藥機(jī)制，結(jié)合表型實(shí)驗(yàn)，研究耐藥基因的表達(dá)和調(diào)控水平。目前最常用的耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)為ResFinder和抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)，張璐等[16]、暢曉輝等[25]分別對(duì)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果與全基因組序列分析耐藥結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)耐藥基因的預(yù)測(cè)與表型基本一致，其差異之處正是需要進(jìn)一步研究的契機(jī)。

4 結(jié)語(yǔ)

食源性沙門(mén)氏菌的監(jiān)測(cè)是重要的公共衛(wèi)生組成部分，也是食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)、食源性疾病監(jiān)測(cè)的重要內(nèi)容，將全基因組序列分析應(yīng)用于該領(lǐng)域，發(fā)揮其在暴發(fā)和溯源分析、流行病學(xué)的調(diào)查中的領(lǐng)先作用具有重要意義。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，生物信息技術(shù)的不斷成熟，研究軟件的不斷更新迭代，全基因組序列分析將成為研究沙門(mén)氏菌分型、致病和耐藥機(jī)制等領(lǐng)域的常規(guī)必備手段。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，其檢測(cè)成本不斷降低，全基因組測(cè)序?qū)?yīng)用于更廣泛的領(lǐng)域。

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