紫龍金聯(lián)合?？颂婺釋ewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能及腫瘤血管生成的影響

李 朕 張洪亮 嚴勝利 陳月嬋 鄔 超 蔡 鋼

(1 新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院,烏魯木齊,830000; 2 石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院,石河子,832000; 3 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腫瘤二科,烏魯木齊,830000; 4 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科,烏魯木齊,830000)

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,最新的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,2020年全球范圍內(nèi)新發(fā)肺癌221萬例,因肺癌死亡180萬例[1-2]。肺癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢,而血管生成在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。抑制腫瘤血管生成可限制腫瘤細胞獲取氧氣和營養(yǎng)物質(zhì),并阻斷其侵襲和轉(zhuǎn)移所需的通路,成為治療肺癌的重要策略之一[2]。紫龍金是一種傳統(tǒng)中藥,由黃芪、當歸、白英、龍葵、丹參、半枝蓮、蛇莓、郁金組成,其活性成分具有抗腫瘤和抗血管生成的特性[3]。此外,既往研究還發(fā)現(xiàn)紫龍金片對肝癌、肺癌小鼠模型有抗癌作用,其主要通過激活人體淋巴細胞,促進T淋巴細胞增殖,提高巨噬細胞的吞噬能力,從而有效增強機體免疫能力[3]。?？颂婺崾且环N靶向治療藥物,主要針對表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR),可用于肺癌的治療,被廣泛應(yīng)用于臨床,并取得了良好療效[4]。然而,紫龍金和?？颂婺嵩诜伟┭苌珊兔庖吖δ芊矫娴南嗷プ饔蒙形疵鞔_。本研究探究紫龍金和?？颂婺釋ewis肺癌荷瘤小鼠模型中腫瘤血管生長的抑制作用,并評估其對細胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物、細胞 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級C57BL/6雄性小鼠50只,4～6周齡,體質(zhì)量18～22 g,購于上海西普爾必凱實驗動物有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2020-0016。將所有小鼠飼養(yǎng)在無菌的鼠房中,恒溫25 ℃,每12 h進行1次晝夜交替,給予充足的糧食和水。小鼠Lewis肺癌細胞株(上海冠導(dǎo)生物工程有限公司,批號:GD-C9819889),采用高糖的含10%胎牛血清的改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbeccos Modification of Eagles Medium,DMEM)培養(yǎng)基進行培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱。動物實驗經(jīng)我院實驗動物動心實驗動物倫理委員會批準(倫理審批號:A2023-069-01)。

1.1.2 藥品 紫龍金片(天津中新藥業(yè)集團股份有限公司隆順榕制藥廠,包裝規(guī)格:0.65 g,國藥準字Z20010064);埃克替尼(貝達藥業(yè)股份有限公司,125 mg/片,國藥準字H20110061)。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(CHI Scientific公司,美國,批號:3-2010);胰酶(北京伊塔生物科技有限公司,批號:YT00044);無菌生理鹽水(上海撫生實業(yè)有限公司,批號:FS-P0178);FITC anti-mouse CD3 Antibody(BioLegend公司,美國,批號:100203);APC anti-mouse CD4 Antibody(BioLegend公司,美國,批號:100515);PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8b.2 Antibody(BioLegend公司,美國,批號:140417);PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody(BioLegend公司,美國,批號:103235);放射性免疫沉淀分析(Radioimmunoprecipitation Assay,RIPA)裂解液(上海羽朵生物科技有限公司,批號:LG-PS0013);10%體積的10 mmol/L PMSF(MyBioSource公司,美國,批號:MBS355475-E);白細胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒(EK-Bioscience公司,批號:EK-M25951);腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒(EK-Bioscience公司,批號:EK-M29261);γ干擾素(Interferon Gamma,IFN-γ)ELISA試劑盒(EK-Bioscience公司,批號:EK-M25913);血管內(nèi)皮生長因子ELISA試劑盒(EK-Bioscience公司,批號:EK-M29117);二氧化碳(Carbon Dioxide,CO2)培養(yǎng)箱(Eppendorf公司,美國,批號:S41I230014);酶標儀(BioTek公司,美國,型號:BioTek Synergy H1);流式細胞儀(BD Biosciences公司,美國,型號:Accuri C6);離心機(青島澳柯瑪生物醫(yī)療有限公司,型號:ALX-18R);4 ℃冰箱(海爾公司,型號:HXC-149)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 參考既往文獻[5-6]構(gòu)建Lewis肺癌荷瘤小鼠模型。從液氮中取出Lewis肺癌細胞株于37 ℃恒溫水浴中使其完全解凍,將恢復(fù)活力的Lewis肺癌細胞株懸浮于DMEM培養(yǎng)基,并在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),待細胞進入對數(shù)生長期,使用胰酶消化細胞,并制備5×106個/mL的細胞懸液備用。取10只小鼠,在無菌條件下將細胞懸液(0.2 mL/只)注射到小鼠的右前肢腋窩皮下,建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型。在無菌條件下飼養(yǎng)14 d后脫頸椎處死小鼠,將瘤體組織剝離、剪碎、勻漿,制備成1×107個/mL的Lewis瘤細胞懸液。取40只小鼠,于右前肢腋窩皮下分別接種0.2 mL的Lewis瘤細胞懸液。模型制備成功標準:7 d后,在接種部位觸摸到約黃豆大小的結(jié)節(jié)狀腫塊[6]。將造模成功的40只小鼠隨機分為模型組、紫龍金組、埃克替尼組、聯(lián)合觀察組,每組10只。

1.2.2 給藥方法 參照相關(guān)文獻[7],紫龍金組將紫龍金片碾碎后溶于無菌生理鹽水備用,每只小鼠采用灌胃的方式給予紫龍金水溶劑,給藥劑量為20 g/kg;?？颂婺峤M灌胃給予?？颂婺?給藥劑量5 mg/kg[8];聯(lián)合觀察組給予紫龍金與?？颂婺崧?lián)合治療,給藥方法同紫龍金組、?？颂婺峤M。模型組給予同紫龍金組相同劑量的生理鹽水灌胃。4組均每日給藥2次,間隔12 h,持續(xù)14 d,末次給藥后小鼠禁食24 h,取眼眶靜脈血。隨后處死小鼠,收集小鼠的腫瘤組織保存?zhèn)錅y。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 腫瘤生長抑制率檢測 處死小鼠后,取小鼠接種部位腫瘤稱重,計算腫瘤生長抑制率。腫瘤生長抑制率=(模型組平均腫瘤重量-觀察組平均腫瘤重量)/模型組平均腫瘤重量×100%[6,9]。

1.2.3.2 血管生長指標檢測 1)血管內(nèi)皮生長因子的檢測:參照先前文獻[10-11]的方法進行評估分析,對小鼠進行靜脈取血后,將收集的血液進行離心3 min,離心半徑7 cm,離心轉(zhuǎn)速為12 000 r/min,之后收集上清液,按照說明,用ELISA試劑盒檢測小鼠血管內(nèi)皮生長因子水平。2)微血管密度(Microvessel Density,MVD)檢測:參照先前文獻[12]里的方法來評估腫瘤MVD。具體而言,將腫瘤血管組織進行石蠟包埋并切成4 μm厚的切片,把切片放入二甲苯中2次脫蠟,10 min/次。然后把切片放入無水乙醇中10 min洗去二甲苯。之后,把切片依次放入95%、90%、80%和70%乙醇中各1次,2 min/次。進行切片抗原修復(fù),即將切片放入盛有枸橡酸鹽緩沖液(工作液)的容器中,置微波爐內(nèi)加熱使溫度保持在92～98 ℃之間并持續(xù)10～15 min。取出容器,室溫冷卻10～20 min。之后,用PBS沖洗,5 min×3次。使用1%BSA封閉液封閉非特異性結(jié)合位點,滴加CD34一抗進行4 ℃孵育過夜,次日將切片與對應(yīng)的二抗繼續(xù)進行孵育,并使用DAB進行核復(fù)染,最后在顯微鏡下觀察。將染成棕黃色的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇視為1個計數(shù)單位,而不計數(shù)血管腔大于8個紅細胞大小且具有較厚肌層的血管。首先在低倍視野下選取5個MVD較高的區(qū)域,通過觀察CD34陽性細胞(染成棕色的內(nèi)皮細胞)來確定最高的血管密度區(qū)域。高倍鏡下(×200)將孤立的內(nèi)皮細胞或細胞簇視為1個計數(shù)單位,記錄5個視野內(nèi)的微血管數(shù)量,取平均值。計數(shù)標準:單個染色陽性的血管內(nèi)皮細胞;1個染色陽性的血管內(nèi)皮細胞簇;血管干上的分支結(jié)構(gòu)。

1.2.3.3 脾臟免疫細胞檢測 處死小鼠后,在無菌條件下分離小鼠脾臟,制備脾細胞懸液。加入紅細胞裂解液裂解紅細胞,在冰浴中孵育30 min后離心去除上清液,并用磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)進行洗滌,將細胞調(diào)整至107個/mL。取100 μL細胞懸液,加入2 μL的異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)anti-mouse CD3 Antibody、1 μL的anti-mouse CD4 Antibody、1 μL的PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8b.2 Antibody、1 μL的PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody。4 ℃避光條件下孵育40 min,用PBS進行洗滌,并去除上清液,用流式細胞儀檢測小鼠脾臟細胞內(nèi)CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞的比例。

1.2.3.4 腫瘤組織炎癥介質(zhì)檢測 采集小鼠腫瘤組織后,取適量腫瘤組織制備勻漿,用90%體積RIPA裂解液和10%體積的10 mmol/L PMSF進行組織勻漿(10%),置于冰上裂解30 min,于12 000 r/min離心30 min,離心半徑為7 cm,取上清液,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)錅y。分別用對應(yīng)的ELISA試劑盒檢測腫瘤組織IL-2、TNF-α、IFN-γ。

2 結(jié)果

2.1 紫龍金及?？颂婺釋π∈竽[瘤生長的抑制作用 與模型組比較,紫龍金組、?？颂婺峤M、聯(lián)合觀察組小鼠腫瘤重量低(均P<0.05);與紫龍金組及?？颂婺峤M比較,聯(lián)合觀察組小鼠腫瘤重量低(均P<0.05),腫瘤生長抑制率高(P<0.05)。紫龍金組與?？颂婺峤M小鼠腫瘤重量、腫瘤生長抑制率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腫瘤重量及腫瘤生長抑制率比較

2.2 各組小鼠血管內(nèi)皮生長因子水平比較 模型組、紫龍金組、?？颂婺峤M、聯(lián)合觀察組小鼠血管內(nèi)皮生長因子水平分別為(129.10±21.87)、(85.70±6.36)、(81.10±9.15)、(69.70±5.29)pg/mL。與模型組比較,紫龍金組、?？颂婺峤M、聯(lián)合觀察組小鼠血管內(nèi)皮生長因子水平低(均P<0.05);與紫龍金組及?？颂婺峤M比較,聯(lián)合觀察組小鼠血管內(nèi)皮生長因子水平低(均P<0.05);紫龍金組與?？颂婺峤M小鼠血管內(nèi)皮生長因子水平比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

2.3 各組小鼠MVD比較 免疫組化染色結(jié)果揭示各組小鼠MVD的組織表達情況。見圖1。模型組、紫龍金組、?？颂婺峤M、聯(lián)合觀察組小鼠MVD分別為(1.39±0.21)%、(0.63±0.05)%、(0.65±0.05)%、(0.42±0.08)%。與模型組比較,紫龍金組、?？颂婺峤M、聯(lián)合觀察組小鼠MVD低(均P<0.05)。與紫龍金組及?？颂婺峤M比較,聯(lián)合觀察組小鼠MVD低(均P<0.05);紫龍金組與?？颂婺峤M小鼠MVD比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

圖1 免疫組化染色檢測各組小鼠MVD組織表達水平

2.4 各組小鼠血清免疫細胞比例比較 與模型組比較,紫龍金組、?？颂婺峤M、聯(lián)合觀察組小鼠血清CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞的百分比例均高于模型組(均P<0.05);與紫龍金組及?？颂婺峤M比較,聯(lián)合觀察組小鼠血清CD4+T淋巴細胞比例、CD8+T淋巴細胞比例、B淋巴細胞比例較高(均P<0.05);紫龍金組與?？颂婺峤M小鼠血清的CD4+T淋巴細胞比例、CD8+T淋巴細胞比例、B淋巴細胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清免疫細胞比例比較

2.5 各組小鼠腫瘤組織炎癥介質(zhì)水平比較 與模型組比較,紫龍金組、?？颂婺峤M、聯(lián)合觀察組小鼠腫瘤組織IL-2、TNF-α、IFN-γ水平低(均P<0.05);與紫龍金組及埃克替尼組比較,聯(lián)合觀察組小鼠腫瘤組織IL-2、TNF-α、IFN-γ水平低(均P<0.05);紫龍金組與?？颂婺峤M小鼠腫瘤組織IL-2、TNF-α、IFN-γ水平比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠腫瘤組織炎癥介質(zhì)水平比較

3 討論

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[2,13-14],肺癌的治療策略包括手術(shù)切除、放療、化療和靶向治療等[14]。手術(shù)切除是早期肺癌的主要治療方法,但對于晚期肺癌或存在遠處轉(zhuǎn)移的患者來說,手術(shù)切除的效果有限[15]。放療和化療可以控制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移,但常伴有嚴重的不良反應(yīng)[15]。近年來,靶向治療作為一種個體化的治療策略,在肺癌治療中取得了顯著療效[16-17]。針對EGFR突變的患者,埃克替尼等EGFR酪氨酸激酶抑制劑已經(jīng)成為標準的一線治療方案[17]。然而,由于腫瘤的異質(zhì)性和耐藥性的出現(xiàn),單一靶向治療的效果通常不持久。

既往研究表明,紫龍金作為傳統(tǒng)中藥,有多種生物活性成分(黃酮類、多糖類和三萜類化合物等),具有抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多種作用[18]。本研究結(jié)果顯示,紫龍金與?？颂婺崧?lián)合治療后小鼠的腫瘤重量和小鼠腫瘤生長抑制率高于二者單獨治療,這一發(fā)現(xiàn)說明紫龍金與?？颂婺崧?lián)合使用具有更強的抗腫瘤作用,能夠在一定程度上提高治療效果。

血管內(nèi)皮生長因子是一種關(guān)鍵的血管生成因子,能夠促進內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管通透性增加,從而在腫瘤血管生成中發(fā)揮核心作用[19]。MVD則反映了腫瘤組織內(nèi)新生血管的數(shù)量和密度,是評估腫瘤血管生成程度的重要指標。MVD的增加通常意味著腫瘤血管生成活躍,腫瘤細胞的供血和營養(yǎng)供應(yīng)充足,從而加速了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[20]。?？颂婺嶙鳛榘邢蛑委熕幬?可以抑制EGFR活性,進而抑制腫瘤細胞的生長和分裂[21-22]。紫龍金與埃克替尼聯(lián)合治療抑制Lewis肺癌小鼠血管生成的機制可能與二者共同抑制血管內(nèi)皮生長因子表達有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,紫龍金與?？颂婺崧?lián)合治療后小鼠血管內(nèi)皮生長因子水平降低。本研究發(fā)現(xiàn),紫龍金與?？颂婺崧?lián)合治療后腫瘤內(nèi)MVD降低,說明二者降低了腫瘤的供血和營養(yǎng),從而限制了腫瘤的生長和擴散。

CD4+T淋巴細胞,又稱輔助性T細胞,在免疫應(yīng)答中起到調(diào)控和協(xié)調(diào)的作用。它們能夠激活其他免疫細胞,如CD8+T淋巴細胞和B淋巴細胞,從而發(fā)起針對腫瘤細胞的特異性免疫反應(yīng)。CD4+T淋巴細胞的增加通常意味著機體免疫功能的增強,有助于更有效地抵抗腫瘤[23]。CD8+T淋巴細胞,即細胞毒性T細胞,是機體抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細胞。它們能夠直接識別并殺滅腫瘤細胞,是機體對抗腫瘤的重要細胞。CD8+T淋巴細胞數(shù)量的增加和活性的提高,有助于增強機體對腫瘤細胞的清除能力[23]。紫龍金作為傳統(tǒng)中藥,已知具有抗炎和抗氧化作用,能夠激活淋巴細胞,增強免疫反應(yīng)。已有研究表明,紫龍金能夠調(diào)節(jié)免疫細胞的功能和數(shù)量,從而增強機體的抗腫瘤能力。埃克替尼作為靶向治療藥物,雖然主要針對腫瘤細胞的特定分子靶點,但其對免疫系統(tǒng)的影響也不容忽視。一些研究表明,靶向治療藥物可能通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境,增強機體的免疫反應(yīng),從而提高治療效果[24-25]。本研究結(jié)果顯示,紫龍金與埃克替尼聯(lián)合治療后小鼠免疫細胞比例升高。紫龍金和埃克替尼協(xié)同作用增加淋巴細胞活性,激活免疫系統(tǒng),使其更有效地抵抗腫瘤細胞。

IL-2是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子,能夠促進T淋巴細胞的增殖和分化,增強機體的細胞免疫應(yīng)答。在抗腫瘤免疫中,IL-2能夠激活和增強CD4+T細胞和CD8+T細胞的活性,從而增強機體對腫瘤細胞的識別和清除能力[26]。TNF-α則是一種具有廣泛生物活性的細胞因子,能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。同時,TNF-α也能夠激活其他免疫細胞,如巨噬細胞,進一步增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)[26]。本研究結(jié)果顯示,紫龍金與?？颂婺崧?lián)合治療后腫瘤組織IL-2、TNF-α、IFN-γ水平下降。IFN-γ作為一種免疫調(diào)節(jié)因子,可抑制腫瘤細胞的增殖,誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達,從而抑制腫瘤血管的形成。檢測IFN-γ的水平可以間接反映腫瘤的生長狀況。此外,在口咽癌的研究中顯示,紫龍金通過干預(yù)受體和通路活性以及調(diào)控TNF-α等信號通路發(fā)揮抗癌作用[27];而?？颂婺岜蛔C明在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有良好的抗腫瘤作用,但具體作用靶點尚未揭示[28]。本研究的結(jié)果表明紫龍金與埃克替尼的聯(lián)合使用在抑制腫瘤生長的同時,也影響了腫瘤組織內(nèi)的免疫微環(huán)境,減少了炎癥介質(zhì)的釋放。

綜上所述,本研究采用Lewis肺癌荷瘤小鼠構(gòu)建模型,發(fā)現(xiàn)紫龍金與?？颂婺崧?lián)合治療可抑制腫瘤生長及血管生成,增強免疫功能,減輕炎癥反應(yīng)。本研究為肺癌治療策略制定提供重要的理論和實驗基礎(chǔ)。然而,本研究仍存在一些不足之處,需要在后續(xù)研究中加以改進和完善。首先,本研究僅在小鼠模型上進行了初步探索,雖然取得了一定的研究成果,但尚需進一步在人體上進行臨床試驗,以驗證紫龍金與?？颂婺崧?lián)合治療的療效和安全性。其次,本研究對于紫龍金與?？颂婺崧?lián)合治療的具體機制仍需要深入研究,以便更好地優(yōu)化治療方案,提高治療效果。此外,本研究未涉及紫龍金與?？颂婺崧?lián)合治療的最佳用藥劑量和用藥時間等問題,這也是后續(xù)研究需要關(guān)注的重要方向。

利益沖突聲明:無。