芒柄花素通過miR-1229/ZDHHC9分子軸對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、活力及凋亡的影響

黃淵智 劉紅玲

(欽州市第二人民醫(yī)院,欽州,535099)

膠質(zhì)瘤是一類來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的顱內(nèi)腫瘤,其病死率高,預(yù)后較差[1]。盡管在診斷和治療膠質(zhì)瘤方面取得了重大進(jìn)展,但患者的中位生存率很低[2]。微RNA(miRNAs)是一種非編碼RNA,其已被證實(shí)可通過靶向mRNA的3′非翻譯區(qū)域(3′Untranslated Region,3′UTR)改變基因的表達(dá),參與調(diào)控疾病的進(jìn)展[3]。研究表明,miRNAs在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中起至關(guān)重要的作用,可作為膠質(zhì)瘤靶向治療的新方向[4]。近年來隨著科學(xué)的進(jìn)步,中藥由于其抗腫瘤安全性高、不良反應(yīng)小、抑制作用持久等優(yōu)點(diǎn),已成為抑制腫瘤生長(zhǎng)的重要手段[5],目前已有多種中藥有效成分被證實(shí)對(duì)膠質(zhì)瘤具有顯著的抑制效果[6]。芒柄花素是從雞血藤、紅三葉草、黃芪等草本植物中提取的一種植物異黃酮,對(duì)多種腫瘤均有抑瘤作用,且其可通過靶向調(diào)控miRNAs表達(dá)發(fā)揮抑癌作用[7-8]。有研究表明miR-1229和在膠質(zhì)瘤癌組織中差異表達(dá)、低表達(dá)的miR-1229與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[9]。已證實(shí)鋅指DHHC型棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶9(Zinc Finger DHHC-type Palmitoyltransferase 9 Gene,ZDHHC9)可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫逃逸參與膠質(zhì)瘤進(jìn)程[10],在本實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-1229與ZDHHC9具有靶向結(jié)合位點(diǎn),但miR-1229/ZDHHC9分子軸在膠質(zhì)瘤中的調(diào)控作用還未見報(bào)道。有研究報(bào)道,芒柄花素對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)展也具有一定的抑制作用[11],但關(guān)于芒柄花素對(duì)膠質(zhì)瘤的作用及其作用機(jī)制的研究仍較少。因此,本研究通過在線數(shù)據(jù)庫篩選膠質(zhì)瘤中差異表達(dá)的mRNAs,進(jìn)一步探討芒柄花素對(duì)差異表達(dá)mRNAs的調(diào)控作用,并深入探究芒柄花素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的靶向調(diào)控機(jī)制,以期為中藥防治膠質(zhì)瘤提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、BT325、TJ905均購自上海盈灣生物科技有限公司(貨號(hào)分別為C1135、C1624、C1377);膠質(zhì)瘤T98細(xì)胞株購自上海雅吉生物科技有限公司(貨號(hào):YS1100C);人腦正常膠質(zhì)細(xì)胞株HEB購自上海莼試生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):CS-X0178)。

1.1.2 動(dòng)物 30只6～8周齡BALB/c裸鼠,體質(zhì)量18～22 g,雌雄各半,購自廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所,許可證號(hào)為SCXK桂2022-0001。本實(shí)驗(yàn)已獲得欽州市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):2023-10-17)。小鼠均飼養(yǎng)在清潔級(jí)恒溫動(dòng)物房中,溫度(22±2)℃,濕度為50%～60%,自由飲食水,適應(yīng)性生長(zhǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 藥物 芒柄花素購自武漢科斯坦生物科技有限公司,純度:98%。貨號(hào):PS0215-0025。

1.1.4 試劑與儀器 改良培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium,DMEM)(上海戶實(shí)醫(yī)藥科技有限公司,貨號(hào):12800-017);Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(上海創(chuàng)賽科技有限公司,貨號(hào):11668-027);miR-NC、miR-1229 mimic、棕櫚?；D(zhuǎn)移酶9(Palmitoyltransferase 9,ZDHHC9)過表達(dá)質(zhì)粒及所有引物序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供;兔單克隆增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)抗體(Abcam公司,英國,貨號(hào):ab265609);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(Cell Counting Kit 8,CCK-8)(上海澤葉生物科技有限公司,貨號(hào):ZY121205);兔ZDHHC9多克隆抗體(Abcam公司,英國,貨號(hào):ab74504);TRIzol試劑(上海愛必信生物科技有限公司,貨號(hào):abs60154);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海烜雅生物科技有限公司,貨號(hào):XY-PCR-1590);一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):C1086);Edu試劑盒(廣州銳博生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):C10310-1);BCA蛋白法檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,貨號(hào):mlsw_E0768);雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司,貨號(hào):KFS303);辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(北京博爾西科技有限公司,貨號(hào):BHR102)。酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司,型號(hào):SpectraMax i3x);倒置熒光顯微鏡(徠卡微系統(tǒng)有限公司,德國,型號(hào):DMi8-電動(dòng));實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司,型號(hào):SLAN-96S);預(yù)制凝膠蛋白電泳系統(tǒng)(賽默飛世爾科技公司,美國,型號(hào):Bolt TM Bis-Tris Plus)。

1.2 方法

1.2.1 體外實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 所有細(xì)胞均于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置于恒溫培養(yǎng)箱(5%二氧化碳,37 ℃)中進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)進(jìn)行消化(0.25%)傳代。并將TJ905細(xì)胞按照簡(jiǎn)單隨機(jī)法分為空白對(duì)照組、20 μmol/L處理組、50 μmol/L處理組、80 μmol/L處理組、110 μmol/L處理組、110 μmol/L+miR-1229組、110 μmol/L+miR-1229+ZDHHC9組、miR-NC組、miR-1229 mimic組。

1.2.1.2 轉(zhuǎn)染與藥物干預(yù) 空白對(duì)照組細(xì)胞不做處理,20 μmol/L處理組、50 μmol/L處理組、80 μmol/L處理組、110 μmol/L處理組細(xì)胞分別使用20/50/80/110 μmol/L的芒柄花素處理細(xì)胞;110 μmol/L+miR-1229組細(xì)胞先使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-1229 mimic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞48 h后再用110 μmol/L的芒柄花素繼續(xù)處理細(xì)胞;110 μmol/L+miR-1229+ZDHHC9組細(xì)胞先用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-1229 mimic和過表達(dá)ZDHHC9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞48 h后再使用110 μmol/L的芒柄花素繼續(xù)處理細(xì)胞;miR-NC組、miR-1229 mimic組分別使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-NC和miR-1229 mimic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞48 h。

1.2.1.3 觀察指標(biāo) 1)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。收集TJ905細(xì)胞,并接種于96孔板中,每孔接種5 000個(gè)細(xì)胞,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后按照1.2.1中方法進(jìn)行藥物處理細(xì)胞,分別在處理24、48、72、96 h后棄培養(yǎng)液,然后每孔加入10 μL的CCK-8試劑,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h,用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處吸光值(OD值)。

2)Edu法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖。將細(xì)胞接種于96孔板,按照1.2.1中分組處理細(xì)胞,然后每孔加入100 μL的Edu試劑(50 μmol/L),培養(yǎng)箱孵育2 h后棄上清,并使用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)清洗后加入50 μL多聚甲醛(4%)固定細(xì)胞30 min,加入50 μL的甘氨酸(2 mg/mL)室溫孵育5 min后棄甘氨酸,然后加入100 μL的滲透劑,10 min后棄去滲透劑并清洗。進(jìn)行Apollo染色,用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)復(fù)染細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)30 min,用熒光顯微鏡觀察并隨機(jī)采集5個(gè)視野進(jìn)行拍照。細(xì)胞增殖率=Edu各觀察組陽性細(xì)胞數(shù)/各觀察組總細(xì)胞數(shù)×100%。

3)TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。收集各組TJ905細(xì)胞,用多聚甲醛固定30 min,用含0.3% Triton X-100的PBS室溫孵育5 min,加入50 μL的TUNEL檢測(cè)液(綠色熒光),37 ℃避光孵育1 h,并使用DAPI進(jìn)行核復(fù)染。熒光顯微鏡觀察,并計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞率。

4)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)法檢測(cè)細(xì)胞miR-1229和ZDHHC9 mRNA表達(dá)。收集各膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及miR-NC組、miR-1229 mimic組TJ905細(xì)胞,使用TRIzol法提取細(xì)胞中總RNA,并檢測(cè)其質(zhì)量和濃度,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系:1 μL cDNA、10 μL SYBR supermix染料、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、8.2 μL d H2O。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s(1循環(huán)),95 ℃ 60 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(40循環(huán))。并分別以U6和GAPDH為內(nèi)參,用2-△△Ct法分析miR-1229和ZDHHC9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。各基因引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

5)檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。收集各組細(xì)胞加入放射免疫沉淀法(Radio Immunoprecipitation Assay,RIPA)裂解液后提取總蛋白,二辛可寧酸(Bicinchoninic Acid Assay,BCA)法測(cè)定蛋白的濃度,取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)束后轉(zhuǎn)膜(聚偏二氟乙烯(Poly Vinylidene Fluoride,PVDF)膜,室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h,滴加ZDHHC9一抗稀釋液(1∶1 000),4 ℃搖床孵育過夜,次日滴加二抗(1∶5 000)孵育2 h后進(jìn)行ECL顯影,并拍照,以GAPDH為內(nèi)參使用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析,使用目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶的灰度值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

6)生物信息學(xué)分析。通過dbDEMC數(shù)據(jù)庫(https://www.biosino.org/)miRNAs芯片(ID:EXP00174)對(duì)影響膠質(zhì)瘤異常表達(dá)相關(guān)的miRNAs進(jìn)行篩選,篩選到異常表達(dá)的miR-1229,通過Targetscan(https://www.targetscan.org/)在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-1229下游靶基因ZDHHC9,通過基因表達(dá)譜交互式分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2,Gepia2)數(shù)據(jù)庫(http://gepia2.cancer-pku.cn/)和腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)(https://www.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫篩查ZDHHC9在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況。

7)雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證ZDHHC9與miR-1229靶向結(jié)合。將ZDHHC9野生型和突變型3′-UTR克隆到熒光素酶報(bào)告載體上,將TJ905細(xì)胞接種于96孔板,接種密度為每孔10 000個(gè)細(xì)胞,將3′-UTR質(zhì)粒與miR-1229 NC或miR-1229 mimic共轉(zhuǎn)染至TJ905細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后通過雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活力(將相對(duì)的Renilla熒光素酶活力進(jìn)行歸一化作為對(duì)照)。

1.2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 小鼠皮下移植瘤模型制備與分組 使用不含血清的培養(yǎng)基將TJ905細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液,并調(diào)整為5×107個(gè)/mL,然后進(jìn)行移植瘤構(gòu)建。背部皮下注射5×106個(gè)TJ905細(xì)胞(0.1 mL)到裸鼠體內(nèi),接種后第5天觀察成瘤情況,在接種部位觸摸到結(jié)節(jié)的小鼠為構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的小鼠按照簡(jiǎn)單隨機(jī)法分為空白對(duì)照組、5.72 mg/kg喂藥組、14.31 mg/kg喂藥組、22.9 mg/kg喂藥組、31.49 mg/kg喂藥組,每組6只。

1.2.2.2 藥物干預(yù) 空白對(duì)照組灌胃給予等量的生理鹽水,72 mg/kg喂藥組、14.31 mg/kg喂藥組、22.9 mg/kg喂藥組、31.49 mg/kg喂藥組小鼠分別灌胃給予5.72、14.31、22.9、31.49 mg/kg的芒柄花素,1次/d,連續(xù)5周。

1.2.2.3 觀察指標(biāo) 1)腫瘤體積和重量檢測(cè)。從給藥后第7天開始(記為第1周),每隔1周使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)經(jīng)、短徑,并計(jì)算腫瘤體積[腫瘤體積(mm3)=長(zhǎng)徑×短徑2/2]。處理結(jié)束后腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉后處死小鼠并取移植瘤,稱取瘤重,并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織PCNA蛋白表達(dá)。取各組小鼠腫瘤組織,進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋后切片(4 μm),脫蠟后進(jìn)行阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,然后PBS清洗后進(jìn)行抗原修復(fù),使用自來水沖洗干凈后加入PCNA一抗稀釋液(1∶1 200)孵育30 min,結(jié)束后滴加二抗孵育30 min,然后根據(jù)試劑盒操作進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)顯色,封片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察(PCNA陽性著色為黃棕色),以黃棕色陽性表達(dá)的顆粒的平均光密度值表達(dá)PCNA蛋白的表達(dá)水平。生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié)果

2.1 芒柄花素對(duì)TJ905細(xì)胞增殖、活力及凋亡的影響 與空白對(duì)照組比較,各濃度芒柄花素處理組細(xì)胞增殖率均低(均P<0.05)。見圖1A。與空白對(duì)照組比較,培養(yǎng)96 h各濃度芒柄花素處理組OD值均低(均P<0.05)。見圖1B;與空白對(duì)照組比較,各濃度芒柄花素處理組細(xì)胞凋亡率均高(均P<0.05)。見圖1C。

圖1 各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖率、活力及凋亡率比較

2.2 芒柄花素對(duì)皮下移植瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響 與空白對(duì)照組比較,各劑量芒柄花素處理組小鼠21 d后腫瘤重量及體積均低(均P<0.05)。見圖2A～C。與空白對(duì)照組比較,各劑量芒柄花素處理組小鼠腫瘤組織中PCNA蛋白表達(dá)低(均P<0.05)。見圖2D。

圖2 不同劑量芒柄花素對(duì)皮下移植瘤重量、體積及PCNA表達(dá)的影響

2.3 miR-1229與ZDHHC9的靶向結(jié)合 通過dbDEMC數(shù)據(jù)庫miRNAs芯片(ID:EXP00174)對(duì)影響膠質(zhì)瘤異常表達(dá)相關(guān)的miRNAs進(jìn)行了篩選,共篩查到857個(gè)miRNAs,并發(fā)現(xiàn)28個(gè)高表達(dá)miRNA和35個(gè)低表達(dá)miRNA。見圖3A。與正常細(xì)胞HEB比較,miR-1229在其他膠質(zhì)瘤U251、BT325、TJ905、T98細(xì)胞中表達(dá)均低(均P<0.05)。見圖3B。通過Targetscan在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè),ZDHHC9與miR-1229具有靶向結(jié)合位點(diǎn)。見圖3C。通過Gepia2和TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),ZDHHC9在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá),且高表達(dá)ZDHHC9與膠質(zhì)瘤患者的低生存率正相關(guān)[P(HR)=0.93](P<0.01)。見圖3D～F。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,miR-1229 mimic能降低轉(zhuǎn)染ZDHHC9-WT(野生型)質(zhì)粒的293T細(xì)胞的熒光素酶活力(P<0.01),對(duì)轉(zhuǎn)染ZDHHC9-Mut質(zhì)粒(突變型)的293T細(xì)胞的熒光素酶活力無顯著影響(P>0.05)。見圖3G。與miR-NC組比較,miR-1229組細(xì)胞ZDHHC9蛋白表達(dá)低(P<0.05)。見圖3H。與空白對(duì)照組比較,50、80、110 μmol/L芒柄花素處理組ZDHHC9蛋白表達(dá)均低,miR-1229表達(dá)高(均P<0.05)。見圖3I～J。與對(duì)照組比較,miR-1229組細(xì)胞ZDHHC9 mRNA表達(dá)低(P<0.01)。見圖3K。

圖3 miR-1229與ZDHHC9的調(diào)控關(guān)系及其在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

2.4 芒柄花素通過miR-1229/ZDHHC9軸對(duì)TJ905細(xì)胞增殖、活力及凋亡的影響 與空白對(duì)照組比較，110 μmol/L組細(xì)胞Edu增殖率和細(xì)胞活力均低，細(xì)胞凋亡率高(均P<0.01)；與110 μmol/L組比較，110 μmol/L+miR-1229組細(xì)胞Edu增殖率和細(xì)胞活力均低，細(xì)胞凋亡率高(均P<0.05)；與110 μmol/L+miR-1229組比較，110 μmol/L+miR-1229+ZDHHC9組細(xì)胞Edu增殖率和細(xì)胞活力均高，細(xì)胞凋亡率低(均P<0.05)。見圖4。

圖4 芒柄花素通過miR-1229/ZDHHC9軸對(duì)TJ905細(xì)胞增殖、活力、凋亡的影響

3 討論

芒柄花素又名芒柄花黃素、刺芒柄花素,是一種弱極性異黃酮類化合物,廣泛存在于黃芪、紅車軸草等中藥材中。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,芒柄花素具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂代謝等多種藥理學(xué)作用[12-13]。芒柄花素對(duì)包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤均具有不同程度的抑制作用,可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成等多種途徑發(fā)揮抑瘤作用[7,15-16]。王維等[11]在研究中證實(shí),芒柄花素可通過抑制周期蛋白D1表達(dá),從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為;張雄[17]也在實(shí)驗(yàn)中證明,芒柄花素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。在本研究中,使用不同劑量的芒柄花素處理TJ905細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)芒柄花素可呈劑量依賴性抑制TJ905細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)其凋亡;同時(shí)通過裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)也觀察到,芒柄花素治療后小鼠體內(nèi)腫瘤重量和體積均顯著降低;此外還發(fā)現(xiàn),芒柄花素可顯著抑制小鼠腫瘤組織中PCNA蛋白的表達(dá)。PCNA是細(xì)胞核脫氧核糖核酸復(fù)制所必需的聚合酶輔助蛋白,其在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)反映腫瘤細(xì)胞增殖程度。本研究結(jié)果表明芒柄花素具有顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用,這與王維[11]、張雄[17]的研究結(jié)果一致。

miRNAs是一種長(zhǎng)度為21～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA,主要通過與mRNA的3′-UTR互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控靶基因的表達(dá)。因此,miRNAs在胚胎發(fā)育及細(xì)胞分化、增殖、生長(zhǎng)等生理過程中發(fā)揮重要作用[18-20]。miRNAs表達(dá)異常是導(dǎo)致多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。研究表明,miR-1229在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中低表達(dá),且過表達(dá)的miR-1229可通過抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡,參與調(diào)控膠質(zhì)瘤進(jìn)展[9,21-22]。本研究通過在線數(shù)據(jù)庫基因芯片篩選的miR-1229在膠質(zhì)瘤組織中顯著低表達(dá),且在不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞中均表達(dá)下調(diào),這與研究結(jié)果一致[18-20]。此外在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示,miR-1229與ZDHHC9靶向結(jié)合;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)芒柄花素處理TJ905細(xì)胞后,細(xì)胞中miR-1229表達(dá)明顯升高,而ZDHHC9表達(dá)下調(diào);且過表達(dá)miR-1229后,TJ905細(xì)胞中ZDHHC9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降。Gepia2和TCGA數(shù)據(jù)庫顯示ZDHHC9在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá),且高表達(dá)的ZDHHC9與膠質(zhì)瘤患者的低生存率正相關(guān)。以上提示芒柄花素可能通過miR-1229靶向調(diào)節(jié)ZDHHC9,進(jìn)而發(fā)揮抑瘤作用。

為進(jìn)一步證實(shí)以上猜想,通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察到,芒柄花素聯(lián)合過表達(dá)miR-1229處理細(xì)胞后,TJ905細(xì)胞增殖率和細(xì)胞活力均較單獨(dú)使用芒柄花素處理組進(jìn)一步降低,而凋亡率均進(jìn)一步升高;此外還觀察到上調(diào)ZDHHC9表達(dá)后,可顯著削弱芒柄花素聯(lián)合過表達(dá)miR-1229對(duì)TJ905細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。這提示芒柄花素可能通過miR-1229/ZDHHC9分子軸抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,并促進(jìn)其凋亡,從而發(fā)揮抑瘤作用。提示miR-1229有望成為膠質(zhì)瘤診斷的臨床指標(biāo),但仍需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述,芒柄花素可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤的進(jìn)程,這可能是通過靶向調(diào)控miR-1229/ZDHHC9分子軸實(shí)現(xiàn)的。本研究揭示了芒柄花素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的可能機(jī)制,然而仍需要大量的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突聲明:本研究與任何單位或個(gè)人無利益沖突。