參仙升脈口服液中揮發(fā)性成分及無機元素研究

宗時宇 黃壯壯 張 紅 李 曄 劉 峰 劉 洋

(1 陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所,西安,710003; 2 陜西步長制藥有限公司,西安,710075)

參仙升脈口服液是用于專門治療緩慢性心律失常的專利中成藥,具有溫補心腎,活血化瘀的作用[1]。該復(fù)方制劑由8味中藥組成,包括紅參、淫羊藿、補骨脂(鹽炙)、枸杞子、麻黃、細辛、丹參和水蛭[2]。參仙升脈口服液的化學(xué)組成十分復(fù)雜,既包括難揮發(fā)的黃酮類、苷類、醌類和糖類等成分,又包括具有揮發(fā)性的小分子化學(xué)物質(zhì),還含有多種無機元素。中藥藥效的發(fā)揮是基于藥物中多種成分綜合協(xié)同作用的結(jié)果[3],但目前研究多僅局限于方中單一中藥的化學(xué)成分研究[4-5],并不能夠體現(xiàn)中藥復(fù)方的整體性和化學(xué)成分的復(fù)雜多樣性。因此,參仙升脈口服液全方整體化學(xué)成分的快速、準確鑒定是一項非常必要又艱巨的工作。

近年來,色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多種化學(xué)成分的高效分析鑒定。課題組前期借助超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)手段,對參仙升脈口服液的化學(xué)成分進行了快速有效的辨識,共鑒定出160種化學(xué)成分。然而,僅利用單一的技術(shù)分析手段,對于揮發(fā)性成分和無機元素的檢測仍存在一定局限,為了實現(xiàn)對參仙升脈口服液整體化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的全面、系統(tǒng)的表征,本研究分別采用頂空氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(Headspace-Gas Chromatography-Mass Spectrometry,HS-GC-MS)和電感耦合等離子體質(zhì)譜(Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometer,ICP-MS)技術(shù)手段,進一步對該復(fù)方制劑的揮發(fā)性成分和21種無機元素進行分析,為參仙升脈口服液全面的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及安全性評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 GC-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(島津公司,日本,型號:TQ8040);GC-MS solution色譜工作站和NIST14 LIBRARY數(shù)據(jù)庫(島津公司,日本);ICP-MS(賽默飛世爾科技有限公司,美國,型號:ICAP-Q);微波消解儀(CEM公司,美國,型號:Mars6);超純水機(Millipore公司,美國,型號:Mill-Q);電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司,型號:SQP]。

1.2 試劑 濃硝酸(默克公司,德國,貨號:PSC01270);DEPC水(賽默飛世爾科技有限公司,美國,貨號:R0601);校正液(賽默飛世爾科技有限公司,美國,貨號:88323);各無機元素標準液(國家標準物質(zhì)研究中心);甲醇(賽默飛世爾科技有限公司,美國,貨號:A452-4);甲酸(賽默飛世爾科技有限公司,美國,貨號:A117-50);水為超純水。

1.3 分析樣品 參仙升脈口服液(山東步長制藥股份有限公司,批號:181202)由陜西步長制藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 基于HS-GC-MS的參仙升脈口服液揮發(fā)性物質(zhì)辨識

2.1.1 檢測條件 頂空條件:樣品瓶加熱溫度70 ℃;孵育時間30 min;定量環(huán)加熱溫度80 ℃;吸取樣品體積1 mL。GC條件:色譜柱HP-5 ms(60 m×0.25 mm,膜厚0.25 μm);分流比20∶1;柱箱初始溫度60 ℃;進樣口溫度280 ℃;程序升溫:初始溫度60 ℃,保持1 min,以3 ℃/min速率升至195 ℃,保持5 min,再以5 ℃/min速率升至240 ℃,保持5 min;載氣N2;柱流量1.5 mL/min;吹掃流量3 mL/min。MS條件:離子源為EI離子源;離子源溫度230 ℃;接口溫度260 ℃;溶劑延遲時間4 min;采集時間5～65 min;采集方式為Q1 Scan;間隔0.3 s;掃描范圍45～600 m/z。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取參仙升脈口服液5 mL,置20 mL頂空進樣瓶中,快速壓蓋密封瓶口,置于頂空自動進樣系統(tǒng)AOC-6000,注入色譜儀分析。

2.1.3 數(shù)據(jù)處理 質(zhì)譜數(shù)據(jù)歸屬利用工作站自帶的Nist 4.0數(shù)據(jù)庫進行解析,主要考察基峰和二級碎片離子峰的相似程度,根據(jù)Nist 4.0數(shù)據(jù)庫相似性打分選擇分值最高的結(jié)果作為化合物歸屬結(jié)果,對于打分相同的化合物歸屬,則根據(jù)參仙升脈口服液中構(gòu)成藥材所含有揮發(fā)性成分的相關(guān)文獻報道進行篩選和歸屬。參仙升脈口服液揮發(fā)性成分的GC-MS分析總離子流見圖1。通過搜索數(shù)據(jù)庫(美國國家標準與技術(shù)研究院,National Institute of Standards and Technology,NIST),共鑒定出29個揮發(fā)性成分,并以峰面積歸一化法計算各成分的相對百分含量。結(jié)果顯示,參仙升脈口服液中相對含量較高的揮發(fā)性成分有11個,占所鑒定揮發(fā)性成分總量的82.64%。這些成分的量由高到低依次為2-甲基-3-丁烯-2-醇(14.71%)、乙酸(11.66%)、1,2-丁二醇(10.77%)、乙二醇(10.47%)、3,5-二甲氧基甲苯(10.06%)、黃樟醚(7.69%)、α-蒎烯(4.54%)、桉葉油醇(4.35%)、β-蒎烯(3.39%)、優(yōu)葛縷酮(2.57%)和甲基丁香酚(2.43%)。見表1。

表1 參仙升脈口服液的GC-MS解析結(jié)果

圖1 參仙升脈口服液GC-MS總離子流

2.2 基于ICP-MS的參仙升脈口服液無機元素分析

2.2.1 檢測條件 ICP-MS工作參數(shù):功率13.5 kW,冷卻氣體積流量15 L/min,載氣體積流量0.8 L/min,輔助氣體積流量0.94 L/min,樣品提升量為1.5 L/min,蠕動泵采集樣品轉(zhuǎn)速40 r/min,測量條件為積分時間為10 s,數(shù)據(jù)采集方式為跳峰,單峰采樣點數(shù)為3,延遲時間1 s,重復(fù)次數(shù)3次。采用雙蠕動泵管進樣,按照檢測條件對待測樣品進行檢驗。

2.2.2 標準溶液的制備 精密移取鉻(52Cr)、銅(63Cu和65Cu)、砷(75As)、鎘(111Cd和114Cd)、汞(202Hg)、鉛(208Pb)、鈹(9Be)、硼(11B)、鈉(23Na)、鎂(24Mg)、鋁(27Al)、鉀(39K)、錳(55Mn)、鐵(56Fe)、鎳(58Ni)、鋅(64Zn)、銣(85Rb)、鍶(88Sr)和鋇(137Ba)適量的標準溶液,用10%硝酸溶液稀釋,配制成含上述21種無機元素質(zhì)量濃度分別為10 μg/mL的混合對照溶液。精密移取混合標準溶液適量,用10%硝酸溶液稀釋,配成含上述各元素質(zhì)量濃度分別為62.5、125、250、500、1 000 ng/mL的混合對照溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取參仙升脈口服液1.0 mL,置于聚四氟乙烯消解罐中,加入濃硝酸5 mL,密閉消解罐,放入微波消解儀中,按表2消解條件進行微波消解。消解完全后,消解液冷卻至60 ℃以下,轉(zhuǎn)入50 mL量瓶中,用DEPC水洗滌消解罐3次,洗液合并于量瓶中,定容至50 mL。

表2 微波消解條件

2.2.4 標準曲線的測定 依照測定條件以濃度為橫坐標、峰強度為縱坐標繪制21種無機元素的標準曲線,得到各元素的回歸方程,線性關(guān)系均較好。見表3。

表3 參仙升脈口服液各待測元素回歸方程及含量

2.2.5 供試品的測定 采用ICP-MS對參仙升脈口服液中的21種無機元素進行測定分析,并通過標準曲線計算參仙升脈口服液各待測元素的含量。結(jié)果顯示,參仙升脈口服液中含有豐富的Na、Mg和K人體必需的常量元素;較高的Fe、Zn、Mn微量元素;少量的Cd、Pb、As、Hg、Cu重金屬及有害元素。見表3。

3 討論

本研究采用HS-GC-MS分析技術(shù),對參仙升脈口服液中的揮發(fā)性化學(xué)成分進行了快速分析,共鑒定出29個化學(xué)成分,這些成分多數(shù)來源于藥材細辛,個別歸屬藥材紅參和麻黃,另有10個成分未找到歸屬藥材。未找到歸屬藥材的成分可能是由口服液制備過程中添加的輔料引入;也存在煎煮、混合等制備工藝過程中,口服液單味或多味組方藥材中的化合物之間相互反應(yīng)而產(chǎn)生的可能性,該類成分可能與藥物之間的增溶、助溶等相互作用有關(guān)[11-12]。本研究所鑒定出的參仙升脈口服液揮發(fā)性成分中,蒎烯具有抗氧化、抗衰老作用[13],桉葉油醇對神經(jīng)系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用[14-15],二者均能提高內(nèi)皮細胞活力,改善血管內(nèi)皮的功能狀態(tài)[16]。甲基丁香酚和黃樟醚是組方藥材細辛的主要活性成分,前者為主要有效成分,具有抗炎、降血壓和保護神經(jīng)系統(tǒng)的作用[7];而后者則為主要毒性成分,長期使用可致肝臟毒性[17];然而,也有研究表明,甲基丁香酚也具有一定程度的肝臟毒性[18-19]。課題組前期曾對10個不同產(chǎn)地細辛藥材中甲基丁香酚和黃樟醚的含量進行了定量分析與比較,發(fā)現(xiàn)2種成分在所檢的所有正品細辛中均占有相對較高的含量[20],這可能成為參仙升脈口服液引發(fā)潛在不良反應(yīng)的因素之一。

無機元素尤其是某些微量元素,與中藥藥效物質(zhì)的積累及功效的發(fā)揮也具有一定的相關(guān)性[21],且某些重金屬元素含量超限會直接影響中藥的用藥安全[22-23]。本研究利用ICP-MS對參仙升脈口服液中的21種無機元素進行了定量分析。結(jié)果符合2020年版《中華人民共和國藥典(四部)》9302“中藥有害殘留物限量制定指導(dǎo)原則”中的相關(guān)要求(As≤2.0 μg/mL,Hg≤0.2 μg/mL,Pb≤5.0 μg/mL,Cd≤0.3 μg/mL,Cu≤20 μg/mL)[24]。有研究顯示,缺Zn、Mn可致中醫(yī)的“腎虛證”[25];具有溫理、補氣助陽一類功效的中藥,Mn含量較高;具有清熱、平肝熄風(fēng)、活血補陽作用的中藥,Zn的含量較高;補陽藥中Fe、Zn、Mn的含量均較高。本研究結(jié)果表明,參仙升脈口服液中Fe、Mn和Zn元素含量在所測元素含量值中均處于較高的水平,這是否與其溫補心腎、活血補陽的功效具有一定的相關(guān)性,還需要進一步探究。

揮發(fā)性成分和無機元素在中藥藥理活性及臨床療效中發(fā)揮重要作用,是中藥物質(zhì)基礎(chǔ)全面、系統(tǒng)研究不可或缺的部分,對中醫(yī)藥現(xiàn)代化具有實際意義。本研究結(jié)合HS-GC-MS和ICP-MS技術(shù)手段,明晰了參仙升脈口服液中的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和無機元素的種類及含量,為后續(xù)參仙升脈口服液進一步的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制及安全評價體系的提升提供了參考。

利益沖突聲明:無。