不同時期獨活不同部位中香豆素類成分積累規(guī)律研究

尹轉(zhuǎn)霖 姬黨通 李 欠

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,蘭州,730070; 2 省部共建干旱生境作物學(xué)國家重點實驗室,蘭州,730070)

獨活(RadixAngelicaePubescentis)為傘形科(Umbelliferae)當(dāng)歸屬(AngelicaL.)植物重齒毛當(dāng)歸(AngelicapubescenMaxinf.biserrataShan et Yuan)的干燥根[1],主產(chǎn)于四川、湖北、安徽等地。獨活味辛、苦,微溫,歸肝、腎、膀胱經(jīng),其祛風(fēng)勝濕、散寒止痛,主要用于治療風(fēng)寒濕痹、腰膝疼痛、少陰伏風(fēng)頭痛、頭痛齒痛等癥[2]。獨活始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品,自古以來為治療風(fēng)濕痹痛的要藥[3]。

獨活中主含有香豆素和揮發(fā)油類成分,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗老年癡呆等藥理作用[4-7],還含有甾醇、有機酸、糖類等成分[8-9]。據(jù)國內(nèi)外研究報道,發(fā)現(xiàn)從獨活中分離得到的94個化合物中,香豆素類化合物69個,其他類化合物25個[10-13]。香豆素類化合物是獨活中的主要活性成分,其含量的高低是衡量獨活藥用價值和質(zhì)量品質(zhì)的重要指標(biāo),因其具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出抗炎、抗凝血、抗癌、鎮(zhèn)靜、抗焦慮、抗癲癇等藥理作用[14-18]。

氣相色譜-質(zhì)譜(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)作為一種分離檢測化合物的新方法,將色譜的分離能力和質(zhì)譜的鑒定能力結(jié)合起來,能夠準(zhǔn)確地對待測成分進(jìn)行定性、定量分析,因其高靈敏度和準(zhǔn)確度等特性,使用范圍廣泛。GC-MS聯(lián)用在中藥領(lǐng)域主要應(yīng)用于揮發(fā)性成分的分析測定中[19-23]。

本研究將GC-MS技術(shù)應(yīng)用到獨活香豆素類成分的鑒別分析中,通過對不同時期獨活根、莖、葉中的主效成分進(jìn)行研究,觀察不同時期、不同部位獨活中香豆素類成分含量的動態(tài)變化規(guī)律,以期建立采用GC-MS分析獨活中香豆素類成分的方法,本研究為獨活藥材的質(zhì)量控制及高效利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 三重四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫公司,美國,型號:Agilent 7890B-7000D),電熱恒溫真空干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司,型號:DZF-1B),萬分之一天平(上海力辰邦西儀器科技有限公司,型號:AL104),小型高速粉碎機(山東精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司,型號:WK-1000),電子天平(慈溪市天東衡器廠,型號:HX203T),超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司,型號:SB25-12DTD)。

1.2 試劑 甲醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號:20210930)。

1.3 分析樣品 獨活取自甘肅省華亭市馬峽鎮(zhèn)趙莊村(106°30′0.03″E,35°14′21.12″N),經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)中草藥栽培與鑒定系陳垣教授鑒定并確認(rèn)為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸,實驗分別以4月、6月、8月、10月、12月的獨活新鮮根、莖、葉作為材料,12月份獨活地上部分干枯,莖葉不進(jìn)行采樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 GC-MS分析條件 氣相色譜條件:色譜柱DB-23(30 m×0.25 mm×0.25 μm);柱溫起始溫度為35 ℃,保持1 min,以8 ℃/min的速率升至150 ℃,保持1 min,再以4 ℃/min的速率升溫至250 ℃,保持12 min;分流比5∶1,流速為1 mL/min,載氣為氦氣。質(zhì)譜條件:進(jìn)樣口溫度250 ℃,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度150 ℃;電離方式采用電子轟擊離子化(EI源),電子能量為70 eV;選擇SIM離子檢測模式;掃描范圍50～650(m/z)。

按照上述分析條件對獨活根、莖、葉醇提取物中的化學(xué)成分及各組分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行確認(rèn)和測定,得到獨活根、莖、葉中化學(xué)成分的GC-MS總離子流圖。經(jīng)NIST14.L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫檢索對照,并與相關(guān)參考文獻(xiàn)佐證,分析確定獨活不同部位的化學(xué)成分。

按照2項下的方法進(jìn)行分析,得獨活根中香豆素類成分的GC-MS總離子流圖。

2.2 樣品溶液的制備 將不同時期的獨活根、莖、葉于40 ℃條件下進(jìn)行干燥粉碎,過40目篩,干燥至恒重。分別取不同部位獨活干燥后的藥材粉末約5 g,精密稱定,分別加入甲醇50 mL于錐形瓶中,精密稱定總重量,浸泡30 min,在40 ℃條件下于水浴中超聲(功率:400 W,頻率:40 kHz)提取40 min,取出,冷卻至室溫,用甲醇補足減失的重量,搖勻濾過,再用0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。

2.3 數(shù)據(jù)分析 采用GC-MS聯(lián)用儀對化合物進(jìn)行全離子掃描,以此得到不同時期、不同部位獨活的總離子流圖,通過化合物的保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù),利用NIST質(zhì)譜庫對質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索,選擇匹配度高于80%的色譜峰,依據(jù)現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)對香豆素類化合物進(jìn)行定性鑒定,同時根據(jù)峰面積歸一化法來計算各組分的相對含量。

2.4 獨活不同部位中化學(xué)成分分析 根中化合物種類最多,分析鑒定出了59種化合物,莖中鑒定出了45種化合物,葉中分析鑒定出了44種化合物。見圖1,表1。

表1 獨活活性成分分析

圖1 獨活不同部位中化學(xué)成分總離子流

2.5 獨活不同部位有效成分鑒定分析 由表1可知,超聲輔助醇提取的獨活中主要活性成分為香豆素類化合物、酯類化合物、烯烴類化合物、醇酚類化合物和脂肪酸類化合物。莖、葉中所含的活性成分的種類基本相同,香豆素類成分作為獨活中的活性成分,對其代表性成分花椒毒素、蛇床子素、二氫歐山芹素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯分析發(fā)現(xiàn),獨活根、莖、葉中都含有以上4種活性成分。

2.6 不同時期獨活根中香豆素類成分分析 不同時期獨活根中香豆素類成分分析結(jié)果見圖2。

圖2 獨活根中香豆素成分GC-MS離子流

不同時期獨活根中4種香豆素類成分的相對含量變化明顯,蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯作為藥典規(guī)定的2種指標(biāo)性成分,其相對含量最高,二氫歐山芹素和花椒毒素成分的含量相對次之;同一時期的香豆素類成分含量變化中,相對含量波動最大的是蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯,二氫歐山芹素和花椒毒素次之。

不同時期獨活根中香豆素類成分先增加后減少,不同生長時期對獨活香豆素含量變化具有顯著影響。在4月至10月生長期時段內(nèi),獨活根中香豆素含量隨生長期的延后呈上升趨勢,10月份香豆素類成分含量達(dá)到最大。4月至6月生長期的香豆素含量增幅緩慢,獨活營養(yǎng)生長前期地上部分處于快速增長階段,藥材營養(yǎng)物質(zhì)積累較慢。進(jìn)入8月至10月后香豆素含量增幅較大,獨活地上部分生長趨于緩慢,莖葉趨于枯萎,利于根中營養(yǎng)物質(zhì)的積累。10月之后香豆素含量變化呈下降趨勢,獨活地上部分的營養(yǎng)轉(zhuǎn)化結(jié)束,根系為了維持生命代謝,損耗了部分干物質(zhì),該時期不利于獨活藥材品質(zhì)的提高。見圖3。

圖3 不同時期獨活根中香豆素類成分含量變化

2.7 不同時期獨活莖中香豆素類成分分析 不同時期獨活莖中香豆素類成分分析結(jié)果見圖4。

圖4 獨活莖中香豆素成分GC-MS總離子流

不同時期獨活莖中香豆素類成分變化呈先增大后減小趨勢,4個不同時期的香豆素類成分變化中,6月到8月獨活地上部分處于快速生長時期,生長旺盛,4種香豆素類成分含量變化趨勢明顯,8月份含量達(dá)到最大。其中蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含量變化最顯著,二氫歐山芹素和花椒毒素次之;同一時期獨活莖的香豆素類成分中,蛇床子素含量最高,其次為二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、二氫歐山芹素和花椒毒素。見圖5。

圖5 不同時期獨活莖中香豆素類成分含量變化

2.8 不同時期獨活葉中香豆素類成分分析 不同時期獨活葉中香豆素類成分分析結(jié)果見圖6。

圖6 獨活葉中香豆素成分GC-MS總離子流

不同時期獨活葉中香豆素類成分變化趨勢先增大后減小,其中二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含量變化趨勢最顯著,其次是二氫歐山芹素、蛇床子素和花椒毒素。6月到8月生長時期之間,獨活地上部分進(jìn)入生長旺盛期,葉片中香豆素類成分的含量也隨之增加,8月香豆素類成分含量達(dá)到最大。8月到10月生長期內(nèi),隨氣溫的下降,獨活地上部分生長趨于緩慢,葉片中香豆素類成分含量亦隨之降低;同一時期獨活葉中香豆素類成分含量最高的是二氫歐山芹素,二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、蛇床子素次之,花椒毒素含量最低。見圖7。

圖7 不同時期獨活葉中香豆素類成分含量變化

蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、花椒毒素、二氫歐山芹素4種活性成分以根中含量最高,葉中最低。蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯根中的含量以10月最高,為31.62%和4.89%,莖中以8月最高,而8月時葉中以二氫歐山芹素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含量最高,為0.14%和0.77%,10月莖、葉中4種活性成分含量有所下降。

3 討論

賀云彪和黃蘭芳[24]用GC-MS技術(shù)對獨活提取物進(jìn)行了分析測定且成功鑒定出了48種成分,后劉潔麗等[25]利用GC-MS技術(shù)對當(dāng)歸不同部位的揮發(fā)油進(jìn)行了研究,魏婧等[26]對荊條不同部位中的揮發(fā)油成分做了GC-MS分析,結(jié)果均顯示不同生長部位的揮發(fā)油在化學(xué)成分組成上有明顯差異,且有些成分是特定部位具有的。艾青青等[27]采用GC-MS分析了康定獨活根中的揮發(fā)油成分,研究結(jié)果顯示醇類和酯類成分是康定獨活根中主要的揮發(fā)油成分。本研究采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對不同時期、不同部位獨活中的香豆素類成分進(jìn)行了分析鑒定,由獨活香豆素類成分的色譜圖可知,在所建立的GC-MS分析條件下,獨活香豆素化合物各色譜峰分離度良好。通過分析不同部位中的主要代表性活性成分蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、花椒毒素、二氫歐山芹素的含量變化趨勢,發(fā)現(xiàn)不同時期同一化合物在不同部位的含量變化存在差異。4種活性成分以根中含量最高,葉中最低,根中蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量以10月最高,莖中以8月最高,而葉中8月時以二氫歐山芹素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含量最高,10月莖、葉中4種活性成分含量有所下降。由此可知,在8月至以后時期,獨活地上部分生長趨于緩慢,所需養(yǎng)分逐漸減少,大量同化物向根中轉(zhuǎn)移。10月之后香豆素含量變化呈下降趨勢,根系為了維持生命代謝,損耗了部分干物質(zhì)。

獨活作為臨床中治療風(fēng)濕痹痛的要藥,近些年在治療高血壓、骨質(zhì)疏松、日常保健等方面都被經(jīng)常使用,現(xiàn)代相關(guān)藥理研究指出,獨活中的活性成分香豆素類化合物在臨床應(yīng)用中發(fā)揮了重要作用,通過分析以上4種代表性活性成分,發(fā)現(xiàn)各時期獨活不同部位中香豆素含量積累變化明顯,闡明了不同時期獨活藥用部位及非藥用部位中活性成分的差異性,為獨活不同部位活性成分研究與非藥用部位資源的合理利用提供理論依據(jù)。此外,藥用植物中活性成分多且復(fù)雜,對活性成分含量動態(tài)積累規(guī)律的研究在藥材質(zhì)量把控環(huán)節(jié)中具有至關(guān)重要的作用。本研究還為藥用植物活性成分的動態(tài)積累變化提供一定的科學(xué)依據(jù),不同的生長期引起的有效成分含量變化對獨活藥理活性的影響,有待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。